HBV全基因组克隆转染细胞系的建立.doc

HBV全基因组克隆转染细胞系的建立作者：赵艳芳，闫永平，苏海霞，王安辉，张磊，张景霞，门可，徐德忠 【关键词】 肝炎病毒,乙型；基因组,病毒；克隆,分子；转染；细胞培养；基因表达 【Abstract】 AIM: To construct a new cell culture system for producing HBV in : Fulllength HBV DNA was cloned into pcDNA3 vector (named pcDNA33HBV). HepG2 cells were transfected with pcDNA33HBV and screened with antibiotic G418. HBsAg and HBeAg were identified by ELISA and HBcAg was identified by immunocytochemical staining. S gene mRNA expression was tested by RTPCR and HBV DNA in the supernatant of transfected cells was tested by PCR. RESULTS: The plasmid pcDNA33HBV was constructed successfully. After stable transfection, HBsAg and HBeAg could be detected in the supernatant of transfected cells. HBcAg positive staining was located mainly in the cytoplasm. S gene mRNA expression was verified. S gene and preS gene could be detected in the supernatant by RTPCR. The copies of HBV genome can reach 1108 copies/L detected by realtime quantitative PCR. CONCLUSION: Rebinant plasmid pcDNA33HBV could be expressed, transcribed and replicated in HepG2 cells. This transfectionbased cell culture system could produce high copies of HBV genome. 【Keywords】 hepatitis B virus; genome, viral; cloning, moleculor; transfection; cell culture; gene expression 【摘要】 目的： 建立HBV体外细胞培养体系. 方法： 构建HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2细胞，G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg，HBeAg的表达，免疫组化检测细胞内HBcAg的表达，RTPCR检测细胞S基因mRNA的表达，PCR检测细胞上清液DNA. 结果： 成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2后，培养上清HBsAg，HBeAg阳性，细胞内HBcAg呈核浆型分布，且以浆型分布为主. RTPCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达，上清中HBV S及前S基因阳性，荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1108拷贝/L. 结论： 重组质粒pcDNA33HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制，该细胞培养体系能产生较高水平的HBV. 【关键词】 肝炎病毒，乙型；基因组，病毒；克隆，分子；转染；细胞培养；基因表达 0引言 由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏，体外组织培养也一直没有太大进展，且不能在体外人工培养，制约了对HBV的研究1. 将HBV DNA转移至靶细胞，建立表达HBV的体外培养细胞模型对研究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义2-4. HBV基因组呈双链闭合环状，基因结构紧凑，其开放读框分布于全长DNA，为使完整的转染基因能在细胞内复制，目的基因的长度要大于一个HBV DNA单元5-6. 我们构建3倍HBV基因的重组真核表达质粒，转染细胞，以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型，并研究其产生HBV的水平. 1材料和方法 材料HBV全基因亚克隆载体pUC193HBV为pUC19在EcoR及Hind位点中插入头尾相连的HBV（adr亚型）三连体，由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠，保存在大肠杆菌DH5中. 真核细胞表达载体pcDNA3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠；人肝母细胞瘤细胞系（HepG2）由第四军医大学微生物学教研室惠赠，本室传代培养；内切酶EcoR, Hind, T4 DNA连接酶,Taq DNA聚合酶,反转录酶及DNA marker（TakaRa公司）；质粒提取试剂盒（西安市莱博科技发展有限公司）；LipofectamineTM 20XX（Invitrogen公司）；DMEM培养基，G418（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；ELISA检测试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）；SABC免疫组化试剂盒，DAB染色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；S基因，actin 及HBV 前S/S基因引物均由北京赛百胜公司合成. 方法 和pcDNA3的酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培养 pUC193HBV和pcDNA3，以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HBV和pcDNA3，分别以EcoR, Hind单酶切pUC193HBV，以EcoR, Hind双酶切pUC193HBV和pcDNA3，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，利用胶回收试剂盒回收9600 bp HBV全长基因片段和线性pcDNA3. 重组质粒的构建及鉴定HBV DNA与 线性pcDNA3以浓度比31混合，在T4 DNA连接酶作用下4连接16 h. 连接产物转化感受态细胞DH5. 随机调取抗性菌落，经小量扩增，提取质粒，分别以EcoR, Hind单酶切并以二者双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定. 脂质体介导下pcDNA33HBV基因转染转染前一日将处于对数生长期的HepG2细胞用胰酶消化并换无抗生素的DMEM培养基，将细胞接种于24孔板，密度达90%时进行转染. 转染方法按说明书进行. 24 h后传代，48 h换含600 mg/L G418培养基进行筛选. 设未转染的HepG2细胞为对照. 待对照组细胞全部死亡后，用含300 mg/L G418的培养基维持. 筛选过程不含其他抗生素. 测抗原表达取转染细胞的上清液用ELISA法测HBsAg，HBeAg. 操作及结果判定按ELISA试剂盒说明书进行，终止反应后10 min内用酶标仪检测A450 nm值. 染色法检测细胞中HBcAg的表达Triton X100处理，封闭非特异性抗原反应，依次加入一抗（兔抗人HBc mAb）、生物素化的二抗（羊抗兔IgG）和SABC复合物，DAB显色，脱水透明，封片观察. 检测细胞中S基因mRNA的表达提取细胞总RNA，反转录为cDNA, 以actin (sense: 5CCCAGATCATGTTTGAGACC 3; antisense: 5TAGCTCTTCTCCAGGGAGGA3）为内参照，扩增片段长度为361 bp. 以S基因引物（sense: 5CTGCTGGTGGCTCCAGTT 3; antisense: 5CAATACCACATCATCCAT 3）做PCR反应,扩增产物为500 bp. 反应条件为94预变性5 min 后开始循环,94 50 s, 55 50 s, 72 55 s，共30个循环,最后72延伸5 min. 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物. 检测培养上清中DNA收集转染细胞上清，提取DNA，以针对HBV前S/S基因的引物(sense: 5CGGGATCCCATATTCTTGGGAACAAG3; antisense: 5CACTGCAGGGTTTAAATGTATACCCA3) PCR，扩增片段长度为1200 bp，反应条件为94预变性5 min后开始循环，94 45 s, 55 1 min, 72 2 min, 共35个循环，最后72延伸5 min. 设质粒pUC193HBV为阳性对照. 荧光定量PCR检测上清中DNA滴度取转染后48 h、转染后1 mo及转染后3 mo的细胞上清液（经PCR检测DNA阳性）送第四军医大学西京医院临床免疫科，做荧光定量PCR检测HBV DNA滴度. 操作步骤按乙型肝炎核酸扩增荧光检测试剂盒说明书进行. 结果判定为HBV DNA滴度1106拷贝/L为阳性，否则为阴性.2结果 , pcDNA3和pcDNA33HBV的酶切鉴定pUC193HBV双酶切后，电泳出现两条带，片段大小约2900 bp（pUC19）和9600 bp（3HBV），单酶切条带均在9416 bp与23130 bp之间，pcDNA3双酶切为5400 bp的片段. 连接产物双酶切后，电泳出现两条带，分别为5400 bp（pcDNA3）和9600 bp（3HBV），单酶切条带均在9416 bp 与23 130 bp之间，与预期结果相符(图1) ，且测序证实连接正确. 1,6: pcDNA3经EcoR和Hind双酶切; 2: pUC193HBV经EcoR和Hind双酶切; 3: pUC193HBV经EcoR酶切; 4: pUC193HBV经Hind酶切; 5, 10: DNA marker Hind digest; 7: pcDNA33HBV经EcoR和Hind双酶切; 8: pcDNA33HBV经EcoR酶切; 9: pcDNA33HBV经Hind酶切. 抗G418细胞克隆的形成及筛选转染后4 wk内对照组HepG2细胞在G418的作用下全部死亡，同时转染pcDNA33HBV组HepG2细胞阳性克隆形成. 挑取阳性克隆继续用G418筛选培养，建立了携带HBV全基因的细胞系.SA法检测HBsAg和HBeAg表达转染pcDNA33HBV细胞组上清中HBsAg, HBeAg均阳性，而对照组HepG2细胞上清始终为阴性. 在HepG2细胞中的表达转染pcDNA33HBV组细胞内HBcAg为核浆型分布，以浆型分布为主. 未转染的HepG2细胞未见染色(图2). S基因mRNA表达的检测以转染细胞cDNA PCR扩增actin，在250 bp与500 bp间可见特异性条带，说明cDNA质量良好，转染pcDNA33HBV组细胞S基因引物扩增产物为500 bp (图3). 对照组细胞未见扩增条带. 培养上清HBV DNA检测转染pcDNA33HBV组细胞培养上清PCR扩增出1200 bp的阳性条带，为HBV特异性前S/S基因，与阳性对照相同. 对照组HepG2细胞未出现阳性条带(图4). 荧光定量PCR检测上清中DNA滴度转染pcDNA33HBV组细胞培养上清中HBV滴度分别为48 h： 1108拷贝/L；1 mo： 4107拷贝/L；3 mo： 7107拷贝/L. 3讨论 随着分子生物学的发展,将重组基因转入动物细胞并表达已成为确定和分析功能基因产物的有力手段，大大促进了HBV的研究. 有研究报道，迄今用于繁殖HBV的所有组织培养系统，都是用串联的HBV基因组，常在很强的外源性启动子的控制下，这些系统可用于生成大量病毒1. 我们构建的pcDNA3 3HBV，含完整的头尾串联的HBV全基因，载体pcDNA3带有CMV早期启动增强子，转染细胞后，能有效合成和分泌HBsAg， HBeAg. RTPCR显示转染细胞有HBV特异性S基因mRNA的表达，证实该转染细胞中存在HBV转录、复制过程. 且转染细胞上清中扩增出前S/S基因，即整个S区，说明有病毒DNA的存在. 其中前S1蛋白位于完整的病毒颗粒（Dane颗粒）表面，与病毒的装配和感染密切相关7，具有与肝细胞受体结合的位点1. 由此说明转染细胞可分泌结构较完整的病毒颗粒. 荧光定量PCR进一步证明该细胞系能产生较高滴度的HBV DNA. 如同细胞系8，该细胞模型可望作为一种新的HBV体外细胞培养体系，其将为HBV的后续研究奠定实验基础. 它的优点在于病毒复制可持续很长时间，且可传代培养. 另外，转染细胞以固定的拷贝数整合于宿主细胞染色体上，复制方式有别于自然感染，其不能用于病毒吸附、透过及脱衣壳过程的研究. 国外学者利用转染细胞的培养上清感染细胞研究HBV的感染机制9-10，我们已经利用阳性血清成功感染了HepG2细胞11和原代培养的滋养层细胞，将浓缩纯化此细胞分泌的HBV，建立接近自然状态的HBV感染模型，进行HBV的感染机制及胎盘滋养层细胞上特异性受体的研究. 【参考文献】 1 骆抗先. 乙型肝炎病毒基础和临床M. 北京： 人民卫生出版社，20XX:41-86. 2 Parekh S, Zoulim F, Ahn SH, et al. Genome replication, virion secretion, and e antigen expression of naturally occurring hepatitis B virus core promoter mutantsJ. J Virol, 20XX,77(12):6601-6612. 3 唐霓,黄爱龙,张秉强,等. 倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达J.中华肝脏病杂志,20XX,11(8):464-466. 4 Fellig Y, Almogy G, Galun E, et al. A hepatocellular carcinoma cell line producing mature hepatitis B viral particlesJ. Biochem Biophys Res Commun, 20XX,321(2):269-274. 5 Lu X, Block TM, Gerlich WH. Proteaseinduced infectivity of hepatitis B virus for human hepatoblastoma cell lineJ. J Virol, 1996,70(4):2277-2285. 6 倪宏,骆抗先,朱幼芙,等. 乙型肝炎病毒全基因在肝癌细胞中的转染与表达J. 第一军医大学学报,20XX,21(7):501-502. 7 Ryu CJ, Gripon P, Park HR, et al. In vitro neutralization of