《植物组织培养》课件 项目3 无菌操作技术

项目三

无菌操作技术任务三外植体的选择与处理任务二无菌操作技术任务一虚拟无菌操作任务二无菌操作技术知识目标理解有菌和无菌的范畴；掌握常用的灭菌方法；掌握无菌操作过程。

123掌握组织培养相关的灭菌方法；熟练掌握无菌操作技术；12

灭菌和接种

任务讲解灭菌和接种一、灭菌二、无菌操作三、接种第一节灭菌和接种

灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。灭菌和接种第一节灭菌和接种

这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不人。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。灭菌和接种第一节灭菌和接种

无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。灭菌和接种第一节灭菌和接种消毒：杀死、消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有生命的物质全部杀死。灭菌和消毒的区别是什么？一、灭菌灭菌和接种灭菌概念1.培养基灭菌◆高压湿热灭菌◆某些激素、维生素采用过滤灭菌视频3-1培养基灭菌自动高压湿热灭菌锅1电源水位指示灯温度、压力显示窗温度压力设置钮压力表放汽阀灭菌锅1卧式灭菌锅2卧式灭菌锅2卧式灭菌锅结构

过滤灭菌滤膜Ø0.45um以下1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121℃。2.溶液先进行初滤(滤膜Ø0.65um)过滤灭菌

培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器体积(mL)121℃灭菌所需最少时间(min)20-501575-15020250-50025100030高压蒸汽灭菌2.玻璃器皿灭菌◆干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h◆湿热灭菌：121℃,20-40min◆接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。3.接种工具灭菌◆用前干热灭菌：160～180℃,1.5～2.0h◆用前湿热灭菌：121℃,20～30min◆接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。◆湿热灭菌：121℃，20～30min◆实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。4.实验服、口罩、滤纸灭菌4.实验服、口罩、滤纸灭菌5.接种室灭菌紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，15～20min。臭氧灭菌机：1～2h熏蒸灭菌：2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高锰酸钾；冰醋酸；1～3%高锰酸钾或3%来苏儿。

接种台喷雾消毒：75%酒精。

◆用化学灭菌剂消毒◆常用化学灭菌剂6.接种材料灭菌视频3-2

接种材料灭菌水洗茎尖选取酒精灭菌氯化汞灭菌无菌水冲洗接种灭菌图示常用灭菌剂的使用浓度与效果比较灭菌剂使用浓度持续时间去除难易效果次氯酸钙9-10%5-30min易很好次氯酸钠2%5-30min易很好氯化汞0.1-1%5-8min较难最好抗菌素4-50mg/L30-60min中较好灭菌剂的使用浓度与效果8.培养室灭菌新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次；隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。

熏蒸灭菌：

2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高锰酸钾二、无菌操作

接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。视频3-3无菌操作

除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；(2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。注：若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。三、接种三、接种三、接种灭菌和无菌操作是组织培养的关键，在各环节中都要保持无菌的环境；灭菌的方法很多，要根据材料和目的来选择；接种是整个组织培养的关键步骤，要严格按照操作流程完成。123灭菌和消毒有何差别?为什么?常用的灭菌方法各有哪些优缺点?采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项?实验人员进入接种室接种之前，应做哪些准备工作?1234项目三

无菌操作技术任务三外植体的选择与处理任务二无菌操作技术任务一虚拟无菌操作无菌操作任务三外植体的选择与处理知识目标学会处理各种外植体的方法和操作流程；学会外植体的培养方法；掌握外植体的培养过程。123掌握外植体的选择方法；熟练掌握外植体的灭菌方法和无菌操作技术；学会外植体的培养过程

123技能目标第一节外植体的选择和处理第二节培养和驯化任务讲解第一节外植体的选择和处理一、外植体选择时应注意：（1）选择优良的种质及母株（2）选择适当的时期（3）选取适宜的大小（4）外植体来源要丰富（5）外植体要易于消毒二、外植体取材的部位：（1）茎尖茎尖不仅生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，而且茎尖培养是获得脱毒苗木的有效途径。因此茎尖是植物组织培养中最常用的外植体。（2）节间部大部分果树和花卉等植物，新梢的节间部是组织培养的较好材料。新梢节间部位不仅消毒容易，而且脱分化和再分化能力较强，因此是常用组织培养材料。（3）叶和叶柄叶片和叶柄取材容易，新出的叶片杂菌较少，实验操作方便，是植物组织培养中常用的材料。尤其是近年在植物的遗传转化中，以叶片为试验材料的报道很多。（4）鳞片水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。（5）其他种子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。三、外植体处理：首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、70％酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70％酒精浸10-30s。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1-2种使用。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次1-3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-10次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。第五步接种。接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放人培养基的过程。第二节培养和驯化

指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

1．培养方法(1)固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。1培养方法(2)液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。1.初代培养◆2.继代培养◆3.生根培养◆培养步骤2．培养步骤2．培养步骤丛生芽的发育Ⅰ顶芽腋芽微型扦插丛生芽的发育Ⅱ顶芽CTK刺激带芽的茎切段侧芽接种培养形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状获得较多嫩茎梢茎段培养继代扩繁试管苗生根培养无愈伤组织产生初代继代丛生芽的发育2不定芽的发育脱分化分化愈伤组织芽、芽丛切割芽丛继代培养大量芽丛试管苗生根培养外植体初代继代不定芽的发育石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程体细胞胚状体的发育Ⅰ体细胞胚状体的发育1体细胞胚状体的发育Ⅱ

外植体特点：数量多，速度快，结构完整，成苗率高愈伤组织小孢子游离单细胞器官

胚状体

试管苗体细胞胚状体的发育2原球茎的发育

缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。原球茎的发育视频视频3-5初代培养继代培养扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段、分离芽丛、胚状体、原球茎。培养基：基本培养基或分化培养基实质：增殖培养物，为生产成品试管苗做准备。继代培养目的：扩繁无根苗，最后达到边繁殖边生根视频3-6继代培养生根培养培养材料生根继代培养初代培养生根培养基：1／2或1／4MS培养基生根方法与途径新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h在含IAA培养基中培养