毕业设计（论文）-细野荞和苦荞清除活性氧作用研究.doc

毕节学院本科毕业论文（设计）毕 业 论 文题 目：细野菌和苦荞清除活性氧 作用研究学 号： 08110902033姓 名： 教 学 院： 地理与生命科学学院专业班级： 生物科学2009级指导教师： ）完成时间： 2013年5月06日 毕节学院教务处制细野荞和苦荞清除活性氧作用研究作者姓名： 专业班级：生物科学2009级学号：08110901033 指导教师： 摘 要：本实验采用NBT光还原法，Fenton反应法和钼酸铵显色分光光度法研究细野荞和苦荞叶、茎、根水提取液对OH、O2-和H2O2清除作用。结果表明，细野荞茎对OH和H2O2的清除率分别极显著高于叶和根；叶对O2-的清除率极显著高于根和茎，而茎显著高于根，但未达到极显著水平。苦荞茎对OH、叶对O2-的清除率分别极显著高于根和茎，叶对O2-和H2O2的清除率也分别显著高于根和茎，但未达到极显著水平，而根和茎对O2-清除率差异不显著。关键词：细野荞；苦荞；活性氧；OH ；O2- ；H2O2Scavening of Reactive Oxygen Species by the Extraction of F. gracilipes(Hemsl) Dammer ex Dielst and F. tartaricum(L.)GaertnCandidate: Zhao fei-fei Major: Biology scienceStudent No.:08110901033 Advisor: Zhang yizhongAbstract: This experiment use the method of NBT photoreduction reduction, the system of fenton and Ammonium molybdate spectrophotometry to study the cleaning effect of extracted liquor from F.gracilipes(Hemsl) Dammer ex Dielst and F.tartaricum(L.)Gaertn (leaves, stem, root) on OH,O2- and H2O2. The results showed that the cleaning effect of the stem from F.gracilipes(Hemsl) Dammer ex Dielst was more respectively significant than the leaves and root on OH and H2O2; the cleaning effect of the leaves was more respectively significant than the root and stem on O2-, meanwhile the stem was more significant than the root, but the significant level was not reached. The cleaning effect of the stem and leaves from F.tartaricum(L.)Gaertn more respectively significant than the root and stem on OH and O2-, the cleaning effect of the leaves was more respectively significant than the root and stem, but it was not reached the significance level, and the cleaning rate of the root and stem was not significant in difference on O2-.Key words: F.gracilipes(Hemsl) Dammer ex Dielst; F.tartaricum(L.)Gaertn; Reactive oxygen species; OH; H2O2; O2.i目 录摘 要iAbstract.ii引言11 材料和方法21.1 供试材料21.2仪器与试剂21.3试验方法21.3.1 提取液对OH的清除测定方法21.3.2 提取液对O2-的清除测定方法31.3.3 双氧水H2O2的研究41.3.4 计算公式42 数据处理43 结果与分析53.1细野荞各器官提取液对OH的清除作用53.2细野荞各器官提取液对O2-的清除作用53.3细野荞各器官提取液对H2O2的清除作用63.4 苦荞各器官提取液对OH的清除作用73.5 苦荞各器官提取液对O2-的清除作用83.6 苦荞各器官提取液对H2O2的清除作用84 讨论9参考文献11致 谢13引言荞麦（Buckwheat）又名三角麦、乌麦，属蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）的双子叶禾谷类作物，植物学上主要有甜荞（F.esculetum Moench）和苦荞（F.tartaricum(L.)Gaertn）两个栽培种1。现代研究表明：荞麦营养丰富，其中蛋白质、脂肪、维生素和微量元素（K,Cu,Mg,Zn,Se）普遍高于大米、小麦、玉米等作物2。除了蛋白质、脂肪、维生素和微量元素等营养成分以外，还含有芦丁、也皮素、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、异荭草苷、原儿茶酸、金丝桃苷、海棠苷等多种黄铜类化合物 3。黄酮具有显著的抗氧化性能4，有降血糖、降血脂5、防癌、抗突变、增强免疫力、杀菌、抗动脉粥样硬化、抗衰老等功能6。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指具有较高化学反应活性的氧的集中代谢产物，如超氧物阴离子自由基(O2)、羟自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)等 7。在正常情况下，活性氧的产生和清除是平衡的，但在受到生物和非生物胁迫时，会导致活性氧的产生过量8，高浓度的活性氧对植物细胞有很强的的毒害9,可通过脂质过氧化反应等途径损伤组织细胞，导致细胞死亡、染色体突变和畸变，并可导致癌变10,而低浓度的活性氧不仅不会对细胞造成伤害，而且还可充当信号分子参与植物的某些防卫反应过程9。现代医学研究证明，衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有直接的关系4。自由基具有高度的化学活性，是人体生命活动中多种生化反应的中间产物代谢产物11。超氧阴离子自由基(Superoxide anion，O2)、羟自由基(Hydroxyl radical，OH)等是生物体内主要的活性氧自由基，由它们所引发的体内脂质过氧化，是人类疾病发生和衰老的重要原因。因而，抑制脂质过氧化物或增强抗氧化功能对防御疾病有重要意义12。近年来，有大量关于活性氧的研究报道，如龚宁等 13对花叶开唇兰水、乙醇、氯仿三种提取物，分别用NBT光化还原法、Fenton反应法和钼酸铵显色分光光度法监测对O2、OH及H2O2活性氧清除作用进行研究，并得出O2和OH具有较强的清除作用，而对H2O2则无明显清除作用这一结果。何永艳14等以不同生育时期的甜荞和苦荞提取物为研究对象，测定出苦荞在盛花期抗氧化活性最强等结果。姚亚平15等利用不同的荞麦品种和不同提取物对荞麦的清除活性进行了相关的研究，乙醇提取物酚酸含量的测定采用Foiln-Ciocalteu法（用原儿茶酸作标准准物），并得出苦荞乙醇提取物中的总酚含量高于甜荞，且其还原力与其总酚含量有关等结论。董良飞16等在金钱草提取物清除活性氧的研究中表明其提取物能有效清除OH、O2自由基，对DNA的OH氧化损伤有显著抑制作用。关于活性氧对植物的影响有张怡等在非生物胁迫下观察植物生理生化代谢反应，得出降低植物逆境状态下的活性氧水平，可以减少逆境对植物产生的危害17。本研究以细野荞和苦荞的叶、茎、根为实验材料，探讨其水提液对O2、OH、H2O2清除作用。以期为荞麦遗传育种、开发及利用提供理论依据。1 材料和方法1.1 供试材料细野荞于2012年7月采自贵州省毕节市七星关区鸭池镇，苦荞与2012年3月种植于贵州省毕节市七星关区鸭池镇试验地。采集的细野荞和苦荞均用水清洗净，并剪下各器官，在40 下恒温烘干至恒重，将其打粉，待用。细野荞：称取叶、茎各3 g，根1.5 g，分别加入干重的40倍、45倍、30倍水，苦荞：称取叶、茎各3 g，根1.5 g，分别加入干重的40倍、45倍、30倍水，在80 下恒温振荡（140 r/min）1 h，过滤收集滤液。再将细野荞叶、茎、根的残渣分别加入干重的25倍、25倍、9倍水，将苦荞叶、茎、根的残渣分别加入干重的25倍、25倍、15倍水，在80恒温振荡（140 r/min）1 h，过滤收集滤液，合并两次滤液备用。1.2仪器与试剂仪器：723 N可见分光光度计: 上海精科产品；电子天平: 奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；双功能水浴恒温振荡器：江苏金坛亿通电子有限公司产品。试剂：NBT为amresco公司产品；L-MET、核黄素为国产生化试剂，番红花红T为国产生物染色素，EDTANa2-Fe()，PBS，EDTA，钼酸铵等。1.3试验方法 1.3.1 提取液对OH的清除测定方法清除OH的测定方法参照文献13并稍加改动。将细野荞的每种样品（叶、茎、根）均设置5个浓度梯度（0.094 mg/mL、0.188 mg/mL、0.282 mg/mL、0.376 mg/mL、0.47 mg/mL），将苦荞的每种样品（叶、茎、根）均设置5个浓度梯度（0.692 mg/mL、1.384 mg/mL、2.076 mg/mL、2.768 mg/mL、3.46 mg/mL），并分别对各浓度进行清除率测定。细野荞浓度为0.47 mg/mL的样品配方为：总体积均3 mL，其中70 g/mL的番红花T 0.5 mL，体积分数为0.33 %的H2O2 0.5 mL，2 mmol/L的EDTANa2-Fe()1 mL，pH=7.4的PBS 0.75 mL，样品0.25 mL。将其充分混匀，置37 恒温水浴锅中保温30 min，取出用自来水冷却10 min，用723 N可见分光光度计于520 nm处测吸光度值，即为样品空白组B0。在上述配方中以双蒸水代替样品即为空白组A0，以双蒸水代替样品和EDTANa2-Fe()为对照组A1，以双蒸水代替EDTANa2-Fe()为样品对照组 B1。然后每种样品均再设4个浓度（0.094 mg/mL、0.188 mg/mL、0.282 mg/mL、 0.376 mg/mL）。样品空白组分别加样品0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL，并用双蒸水补足到总体积0.25 mL。其样品对照组相应改变，其它操作同上。清除率的计算公式为： A1：对照组的吸光度值。A0：空白组的吸光度值。B1：样品对照的吸光度值。B0：样品空白的吸光度值。苦荞方法同上。1.3.2 提取液对O2-的清除测定方法清除O2-的测定方法为：清除O2-的测定方法参照文献13并稍加改动。将细野荞的每种样品均设置5个浓度梯度（0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL、1.5 mg/mL），将苦荞的每种样品均设置4个浓度梯度（0.147 mg/mL、0.441 mg/mL、0.736 mg/mL、1.03 mg/mL）。并分别对各浓度进行清除率测定。浓度为1.5 mg/mL的细野荞的样品配方为：总体积均3.25 mL，依次加入0.25 mL样品，14.5 mmol/L的 L-Met 2.7 mL，3.0 mmol/L的EDTA 0.1 mL，2.25 mmol/L NBT0.1 mL，60 mol/L核黄素0.1 mL（EDTA、NBT、核黄素均以50 mmol/L Ph 7.8的PBS配制）。混匀倒入吸光度一致的比色杯，在3000 lux下光照10 min，反应后立即避光，迅速将反应液颠倒混匀，立即在560 nm下测吸光度值作为样品对照。以PBS代替NBT作为样品空白，以双蒸水代替样品作为对照，以双蒸水代替样品和NBT作为空白。然后每种样品均再设4个浓度（0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL）。样品空白组分组加样品0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL，并用双蒸水补足到总体积0.25 mL。其样品对照组相应改变，其它操作同上。浓度为1.03 mg/mL的细野荞的样品配方为：总体积均3.07 mL，依次加入0.07 mL样品，14.5 mmol/L的 L-Met 2.7 mL，3.0 mmol/L的EDTA 0.1 mL，2.25 mmol/L NBT 0.1 mL，60 mol/L核黄素0.1 mL（EDTA、NBT、核黄素均以50 mmol/L ph 7.8的PBS配制）。混匀倒入吸光度一致的比色杯，在3000 lux下光照10 min，反应后立即避光，迅速将反应液颠倒混匀，立即在560 nm下测吸光度值作为样品对照。以PBS代替NBT作为样品空白，以双蒸水代替样品作为对照，以双蒸水代替样品和NBT作为空白。然后每种样品均再设3个浓度（0.147 mg/mL、0.441 mg/mL、0.736mg/mL）。样品空白组分组加样品0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL，并用双蒸水补足到总体积0.07 mL。其样品对照组相应改变，其它操作同上。清除率的计算公式同上。1.3.3 双氧水H2O2的研究清除H2O2的测定方法参照文献13并稍加改动。将细野荞的每种样品（叶、茎、根）均设置5个浓度梯度（0.784 mg/mL、1.568 mg/mL、2.352 mg/mL、3.316 mg/mL、3.92 mg/mL），将苦荞的每种样品（叶、茎、根）均设置5个浓度梯度（0.692 mg/mL、1.384 mg/mL、2.076 mg/mL、2.768 mg/mL、3.46 mg/mL）。具体操作如下：将0.25 mL提取液加于试管中，然后放入37水浴锅，迅速加入1.5 mL基质液（在60 mmol/L钠-钾磷酸盐缓冲液中（pH=7.4）含65mol/L的H2O2），以提取溶剂代替提取液作对照，以PBS（7.4）代替基质液作样品和对照的空白（即空白，作空白2），30 s后，加入1.5 mL钼酸铵并迅速振荡均匀，放入常温自来水中终止反应5 min,后通过分光光度计，测定OD450值。1.3.4 计算公式 2 数据处理用Excel 2003和SPSS11.5统计软件进行作图、计算以及数据处理。 3 结果与分析3.1细野荞各器官提取液对OH的清除作用用提取液浓度对清除率作图，细野荞对OH的清除作用见图1图1 细野荞茎和叶对OH清除作用从图1可以看出：细野荞的全叶、茎对OH均有清除作用，而且均表现出随着浓度的增加，清除率也升高。根据线性回归方程（茎: y = 145.67x + 26.571，r= 0.967678*，叶: y = 175.06x - 10.001，r= 0.99106*），当清除率为50%时，细野荞茎的提取液浓度为0.160836 mg/mL，叶的为0.342745 mg/mL，因此在清除率为50%水平上，细野荞对OH的清除作用茎叶。t检验见表1。表1 细野荞茎和叶对OH清除作用茎叶平均值（%）67.65 39.36 方差（%）709.00 654.83 观测值1515自由度28t 值2.966p值0.003 由表1可知，t=2.966，P=0.0030.01，因此细野荞茎对OH的清除率极显著高于叶。3.2细野荞各器官提取液对O2-的清除作用用提取液浓度对清除率作图，细野荞对O2-的清除作用见图2图2 细野荞各器官对O2-清除作用从图2可以看出：细野荞的叶、茎、根对O2-均具有清除作用，而且均表现出随着浓度的增加，清除率也升高。根据线性回归方程（茎：y = 43.937x + 21.317，r= 0.955877*，根：y = 20.025x + 26.747，r= 0.99559*），当清除率为50%时，细野荞茎的浓度为0.6528 mg/mL，根的浓度1.161198 mg/mL，因此在清除率为50%水平上，细野荞对O2-的清除作用茎根。多重比较结果见表2表2 细野荞各器官对O2-的多重比较细野荞器官平均值（%）多重比较0.050.01叶80.448aA茎60.86bB根44.769cB注：不同小写字母表示0.05水平上的差异显著；不同大写字母表示0.01水平上的差异极显著。由表2知：叶对O2-的清除作用最好，极显著高于茎和根；而茎显著高于根，但未达到极显著水平。在0.05水平上，清除率大小排列为叶茎根。3.3细野荞各器官提取液对H2O2的清除作用用提取液浓度对清除率作图，细野荞对H2O2的清除作用见图3图3 细野荞茎和叶对H2O2清除作用从图3可以看出：细野荞的叶、茎对H2O2均具有清除作用，而且表现出随着浓度的增加，清除率也升高。t检验见表3。表3 细野荞茎和叶对H2O2清除作用茎叶平均值（%）20.197.39方差（%）102.5816.81观测值1515自由度18t值4.537p值0.0001由表3可知，t=4.537，P=0.00010.01，因此细野荞茎对H2O2的清除率极显著高于根。3.4 苦荞各器官提取液对OH的清除作用用提取液浓度对清除率作图，苦荞对OH的清除作用见图4图4 苦荞茎和根对OH清除作用从图4可看出，苦荞的叶、根对OH均具有清除作用，且随着浓度的增加，清除率也升高。t检验见表4。表4 苦荞茎和根对OH清除作用茎根平均值（%）56.9325.26方差（%）850.25218.03观测值1515自由度28t值3.753p值0.0004由表4可知，t=3.753，P=0.00040.01，因此苦荞茎对OH的清除作用极显著高于根。3.5 苦荞各器官提取液对O2-的清除作用用提取液浓度对清除率作图，细野荞对O2-的清除作用见图5图5 苦荞各器官对O2-清除作用从图5可看出：细野荞叶、茎、根对O2-均具有清除作用，且随着浓度的增加，清除率也升高。根据线性回归方程（茎：y = 43.069x + 18.955，r= 0.982802*，根：y = 54.839x + 26.027，r= 0.99544*），当清除率为50%时，苦荞茎的浓度为0.72082 mg/mL，根的浓度0.437152 mg/mL，因此在清除率为50%水平上，苦荞对O2-的清除作用根茎。多重比较结果见表5表5 苦荞各器官对O2-的多重比较苦荞器官平均值（%）多重比较0.050.01叶77.05aA根58.3bAB茎44.30bB注：不同小写字母表示0.05水平上的差异显著；不同大写字母表示0.01水平上的差异极显著。从上表5可看出：叶对O2-的清除作用最好，显著高于根，极显著高于茎，根和茎之间无显著差异。3.6 苦荞各器官提取液对H2O2的清除作用用提取液浓度对清除率作图，苦荞对H2O2的清除作用见图6图6 苦荞茎和叶对H2O2清除作用由图6可看出：苦荞的叶、茎对H2O2均具有清除作用，且随着浓度的增加，清除率也升高。t检验见表6。表6 苦荞茎和叶对H2O2清除作用叶茎平均值（%）14.888.96方差（%）85.2032.86观测值1515自由度28t 值2.11p值0.022由表6可知t=2.11，P=0.0220.05，因此苦荞叶对H2O2的清除作用显著高于茎。4 讨论龚宁等18研究了用Fenton反应测定金线兰对OH的清除作用NBT光还原法测定金线兰提取液对O2-的清除，均发现金线兰各器官对OH和O2-有较高的清除作用，而叶的水提液清除作用最强。龚宁等13研究结果表明花叶开唇兰提取液对O2-和OH具有较强的清除作用，而对H2O2则无明显清除作用。胡博路等19研究了用对碱性苯三酚体系测定核桃对O2-的清除作用，发现核桃壳无清除作用，核桃仁、核桃叶均有较强的清除作用，且核桃仁的清除能力强于核桃叶。李晓明20等对芦蒿不同部位清除自由基活性进行研究，其结果表明芦蒿醇提取液对O2-的清除作用由高到低依次为秸秆、叶、花、茎，对OH则为叶、花、茎、秸秆。从以上结果可以看出，几种植物叶和茎对O2-和OH均有较高的清除作用，这与本研究结果基本一致。本研究结果表明细野荞茎对OH和H2O2的清除率分别极显著高于叶和根；叶对O2-的清除率极显著高于根和茎。苦荞茎对OH、叶对O2-的清除率分别极显著高于根和茎，叶对O2-和H2O2的清除率也分别显著高于根和茎。这些结果可考虑应用到细野荞和苦荞使用部位的选择上，即采细野荞和苦荞的茎或叶入化妆品，或其他保健品的加工。但其发挥清除作用的物质有可能随季节21、发育阶段22的变化而变化，本研究材料采集于7月，已有花序，其他季节、发育阶段是否也有同样的规律有待进一步研究。参考文献1 侯文娟,张美莉,付媛,等.甜荞各分离蛋白清除活性氧自由基的研究J.科学研究, 2009, 30(9): 40-43.2 黄燕菲,彭镰心,丁玲,等.荞麦和商品苦荞麦中芦丁含量的测定J.现代食品科技, 2012, 28(9): 1219-1222.3 李丹,丁霄霖.苦荞黄酮抗氧化作用的研究J.食品科学, 2001, 22(4): 22-23.4 方玉梅,谭萍,王毅红,等.苦荞麦苗黄铜类化合物清除二苯代苦味酰肼自由基的作用J.贵州 农业科学, 2009, 37(7): 21-22.5 王敏,魏益民,高锦明.苦荞黄铜的抗脂质过氧化和红细胞保护作用研究J.中国食品学报, 2006, (1): 87-94.6 于智峰,付英娟,王敏,等.苦荞黄铜提取物体外清除自由基活性的研究J.食品科技, 2007,(3): 126-129.7 田敏,饶龙兵,李纪元.植物细胞中的活性氧及其生理作用J.植物生理学通讯, 2005, 4(2): 235-241.8 何金环,李存法,梁月丽,等.植物细胞活性氧及其胞内信号转导J.河南农业科学, 2005, 8, 18-20.9 吕品,张岩,李建华,等.植物细胞活性氧的产生和清除机制J.生物学教学, 2010, 35(2): 4-5.10 戴甲培,石悦.活性氧双向生物学效应和机制J.中南民族大学学报, 2012, 31(3): 43-51.11 段志芳,付莉.剑花水提取液化学自由基作用研究J. 2011, 36(9): 262-265.12 Rizhsky L,et al.Double antisense plants lacking ascorbate peroxidase and catalase are less sensitive to oxidative stre