第三章__无病毒植物

第三章植物主要组织培养方法,第一节植物离体无性繁殖第二节无病毒植物培养第三节植物花药和花粉培养第四节植物胚胎培养,植物病害基础知识：一、植物病害归结为5类基本症状二、致病的原因三、防治植物病害的主要措施,一、植物病害归结为5类基本症状,变色：尤以病毒病常见；坏死：指细胞和组织的死亡。因受害部位不同而表现各种症状，常见的有霜霉、叶枯、立枯、猝倒、溃疡等；腐烂：指植物组织的大面积分解和破坏。其与坏死之区别：腐烂是整个组织和细胞的破坏和消解，而坏死则多少还保持原有组织的轮廓。腐败烂又可根据部位不同分为根腐、茎腐、基腐、果腐、花腐等,萎蔫：指因根茎部的坏死和腐烂，而致维管束组织受到破坏，使根部水分不能及时输送到顶端，地上部枝叶表现萎垂或凋萎。畸形：受病原物产生的激素类物质刺激而表现出组织异常增长，如增大、增生、减生和变态等。,二、致病的原因,1.植物真菌病害2.植物细菌病害3.植物病毒4.植物病原线虫,三、防治植物病害的主要措施,防治植物病害的主要措施可以分为：植物检疫、栽培措施、抗病品种、生物防治和化学防治和培养无病毒植物等方面。,植物检疫：又称法规防治,病害是通过被侵染的种子、苗木和农产品的调运途径进行传播。所以国家通过制订检疫法等法律行政措施，防止危险性病害的传播蔓延。植物检疫的任务是制订全国性或局部地区植物检疫对象名单，并对有可能携带检疫对象的农副产品、种子、苗木、旅客携带物，邮寄、托运物的进出境进行检疫，查出带有检疫对象的物品，就地销毁或进行紧急防治等。,改善栽培措施，提高植物的抗病能力：,通过改善栽培措施可以减少病原菌的数量。土壤中的残株落叶，是多种病原微生物的越冬场所，通过轮作、清洁田园，把植物的残株、落叶集中处理销毁，可大量减少病菌的来源，减轻病害发生。同时，通过施肥、排水灌溉、适宜的种植密度、及时中耕除草等农业措施，能够保证植株生长壮旺，有助于增强植物对病原菌侵袭的抵抗力，对病害有直接或间接的预防作用。,选用抗病品种：,经过多年的努力，我国已在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆、烟草、果树、蔬菜等作物选育出一批农艺性状好、抗病性强的丰产良种，各地可根据作物病害的发生种类，选择适合当地种植的抗病品种。但是抗病品种也存在抗病性丧失的问题，如果连年种植抗性单一的品种，病原菌也可能产生新的生理小种，而导致抗病品种退化，不再抗病。为延长抗病品种的使用年限，要做好抗病品种的合理布局，有计划地轮换使用具有不同抗病基因的品种，同时配合采用其它防治措施减少菌源，降低病原菌对品种的压力，延长抗病品种的使用寿命。,生物防治：,植病生物防治的任务就是利用有益生物以及它们的代谢产物或产品对病原物的各种不利作用，来减少病原物的数量，削弱其致病性或直接杀死病原菌，抑制植物病害的发生流行。研究证明，土壤中存在大量的有益微生物种群，它们能抑制或杀死病原菌。如麦田中的荧光假单胞杆菌，可抑制小麦全蚀病菌对小麦的侵害。利用噬菌体防治细菌性病害，利用弱毒疫苗防治植物病毒病等方面的研究已取得成功。,化学防治：,化学防治就是使用对病原物有毒的化学物质，这些化学物质能够抑制病原物的萌发、生长和繁殖甚至杀死病原物。用于防治植物病害的化学物质，通称杀菌剂。按照杀菌剂防治病害的作用方式，可区分为保护性、治疗性杀菌剂。保护性杀菌剂多在病原菌入侵以前使用，可保护植物，阻止病原菌入侵。治疗性杀菌剂能进入植物组织内部，抑制或杀死已经侵入的病原菌，使植物病情减轻或恢复健康。,无病毒植物培养在植物病害防治中的意义,第二节无病毒植物培养,一、病毒在植物体内的危害及分布二、植物脱毒方法三、脱毒植物检测及保存,1.植物病毒的危害植物病毒作为植物的一种病原，引起了不少毁灭性的病害，对植物的生长、发育，对人类的生存和发展已经造成很大的威胁。据估计，植物病害在全世界引起的年均损失是600亿美元，而植物病毒病害处于仅次于真菌病害之后的第二位，如1978年大麦黄矮病毒病大发生，使加拿大曼尼托巴地区小麦损失170万美元,一、病毒在植物体内的危害及分布,病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%，为害马铃薯的病毒则更多。,马铃薯病毒病的危害,马铃薯受病毒侵染后发生退化，造成产量降低、品质下降，每年世界上由马铃薯病毒造成的减产至少为20%。20032004年的全国马铃薯产品质量安全普查发现，病毒病仍是造成脱毒种薯不合格的重要原因之一。危害马铃薯的病毒有30余种，其中在我国普遍存在而且危害严重的见表1。,表1我国马铃薯主要病毒病及对产量造成的影响,病毒对产量造成的影响（减产%）马铃薯卷叶病毒（PLRV）4060马铃薯Y病毒（PVY）50左右马铃薯Y病毒（PVY）+马铃薯A病毒（PVA）80左右马铃薯X病毒（PVX）1050马铃薯S病毒（PVS）1020马铃薯类病毒PSTVd2035，严重时60,由于病毒对植物造成如此严重的危害。所以世界各国都开始重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在各国普遍开展。如马铃薯的茎尖培养法，获得无病毒无性系。,2.病毒在植物体内的分布,病毒浸染植物叶片后即增殖并向附近细胞转移，尽管速度很慢，但经过一段时间，叶片内病毒浓度达到一定量而达到韧皮部时，即可随维管束大范围转移到植株其它部位。1943年White首先发现已感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒浓度很低，甚至没有。,Holmes（1948）和Masset（1949）进一步证实，在病毒感染的植株内，病毒的分布随植株不同部位和年龄而异。老叶和成熟组织即器官中病毒含量较高，幼嫩和未成熟的组织及器官中病毒含量较低。在根尖、茎尖生长点附近约0.11mm区域内则几乎不含病毒。为什么？,病毒的特征,病毒(Virus)是包被在蛋白或脂蛋白保护性外壳中，只能在适合的寄主细胞内完成自身复制的一个或多个基因组的核酸分子，又称分子寄生物。病毒的复制依赖于寄主的核酸和蛋白质合成系统，需要寄主提供原材料。病毒是严格寄生性的一种专性寄生物。其核酸复制和蛋白质合成需要寄主提供原材料、能量和场所。,病毒在植物体内分布不均匀的机理目前还不十分清楚，但有以下几种假说：,能量竞争：病毒不具备细胞结构，但它有核酸，也需要合成DNA，植物细胞分裂时，也需要合成DNA。分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量、自我复制。而病毒核酸的合成要靠植物提供的能量来实现自我复制，这就产生了细胞分裂与病毒复制对能量的竞争。病毒可能得不到足够的能量来进行核酸复制，所以导致分生组织中没有病毒或病毒含量低。而分生组织以下的细胞分裂不活跃，主要是生长，因此病毒可以在这些细胞中获得足够的能量用于复制。,传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束来实现的，但在分生组织中，维管束组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素浓度水平很高，抑制了病毒活性。酶缺乏：病毒合成可能需要酶的参与，但在分生组织中还没有建立起病毒复制所需要的酶系统，因此病毒无法在分生组织中复制。,3、获得无病毒繁殖体的方法：引进无毒种苗；筛选无毒个体；脱毒（去毒）、培育无毒株。,二、脱毒的概念及方法：脱毒：用人为的方法将植物体内的病毒去掉。方法：（一）物理方法（二）化学方法（三）生物方法,（一）物理方法,1.高温处理（即热处理）2.低温处理（较少用）,1热处理法的发现及应用热处理又称温治疗法(theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成病毒很少，而而病毒受破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。,原理：病毒是蛋白质外壳包被的核酸分子，热处理能使病毒在体内的增殖减缓或停止，因而失去侵染能力热处理能刺激细胞分裂，使植物细胞在与病毒的生存竞争中占优势；方法：愈伤组织热处理；（不常用）植株热处理；,(1)温汤浸渍处理适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室(箱)内，一般在3540。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。,（二）化学方法,植物脱毒的化学方法是利用化学药品（如嘌呤和嘧啶类似物，氨基酸、抗生素等）处理，抑制植物体内病毒复制。常用的化学药品有孔雀绿、硫尿嘧啶等，这些化学物质在某些程度上可抑制病毒合成，但不能使病毒失活，且对寄主植物有毒害，故应少用。,（三）生物方法,1.茎尖培养2.微体嫁接3.珠心组织培养4.愈伤组织培养,（1）茎尖培养脱毒原理：感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒。植物的种子一般是无毒的遗传性状不够稳定，易失去F1代杂种优势，不利于成年型的保持，繁育周期较长。,（2）茎尖培养脱毒方法：茎尖丛生芽生根再生株无毒）无毒茎尖培养：,大茎尖,小茎尖,叶原基,顶端分生组织,大茎尖较大，可能带病毒；小茎尖较小0.11.0mm，一般无毒。大脱毒效果差，成苗易茎尖小脱毒效果好，成苗难在满足培养材料成苗的前提下，茎尖越小越好。,评价：i、行之有效的脱毒方法，与热处理结合效果更佳;ii、对难再生的植物，可结合微体嫁接等方法获得无毒种苗；茎尖实生苗砧木,2.茎尖微体嫁接,木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.41.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。,3.珠心组织培养,柑橘类植物除合子胚外，还有多个珠心胚。珠心组织与维管束系统没有直接联系，故珠心组织培养可获得无病毒植株。,4.愈伤组织培养脱毒,通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。,通过愈伤组织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能性：,病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰退或丢失。变异,植物病毒病症状初步识别,病状：变色（花叶、斑驳、脉明）、畸形（如皱缩、卷叶、矮化、小叶、小果、叶或果不对称、丛生、耳突等）、坏死（坏死斑点、环斑、蚀纹等）无病症。与非侵染性病害比较，有发病中心（在田间表现为发病不均匀。能传染。,三、脱毒植物检测及保存1、检测方法：指示植物法血清法（生理、生化指标）电镜检测酶联免疫鉴定法（ELISA）,指示植物(indmatingplant)法指具有能够敏感表现某种病毒的专化性症状的寄主植物。它对病毒极为敏感。将待测植物的汁液接种到指示植物上，如果被测植物带毒，则指示植物上会出现特定症状。因此指示植物又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。,指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes1929年发现的。他用感染TMV的昔通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦23d后叶片上出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。,由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。,几种马铃薯病毒种类的症状,种类症状指示植物马铃薯X病毒脉间花叶千日红曼陀罗辣椒心叶烟番茄马铃薯S病毒叶脉深陷粗缩千日红苋色藜光曼陀罗马铃薯Y病毒随品种而异，有些野生马铃薯洋酸菜微花叶、有些坏死曼陀罗马铃薯卷叶病毒浅白色、紫色、红色洋酸菜,方法,摩擦接种法：嫁接法：,木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。,抗血清(antisemm)鉴定法用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。,血清学技术鉴定病毒的原理：,抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白的抗原(antigen)特性，可以制备病毒特异性的抗血清(antiserum)。先将纯化的植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，获得抗血清。血清制备的关键是病毒的纯化，纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。血清反应：植物病毒与其血清的反应有好多种，但依据的原理都是抗原与抗体的特异性结合。最常用的两种方法是琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定法。,植物病毒血清学鉴定病毒的常见方法,琼脂双扩散法：在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体和抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀；沉淀线的形状说明抗原和抗体的相互关系。酶联免疫吸附(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法：该方法利用了酶的放大作用，使免疫检测的灵敏度大大提高。,电子显微镜(elecmcmicroscope)检查法由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5m大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。,酶联免疫鉴定法(Enzymelinkedimmunityabso