国标培养法与2种金黄色葡萄球菌快速筛检方法的比较.pdf

第8 卷第1 期食品安全质量检测学报 、，o I 8N O 1 2 0 1 7 年1 月 J o u m a lo f F 0 0 dS a f e t ya n dQ u a l it yJ a n ，2 0 1 7 国标培养法与2 种金黄色葡萄球菌快速筛检 方法的比较 王利刚，张磊，张婧，费云滟，付莎莉，吴丹，屠大伟+ ( 重庆市食品药品检验检测研究院，重庆4 0 1 1 2 1 ) 摘要：目的将m in i v I D A s 法和膜芯片2 种快速筛检方法与国标培养法进行比较，评估2 种快速筛检方法 的效果和可操作性。方法以金黄色葡萄球菌为目标菌，针对3 种筛检方法设计灵敏性、特异性、抗干扰性实 验和人工污染实验，通过比较获得3 种筛检方法的应用效果情况。结果 国标培养法和m in i V l D A s 法的灵敏 性较好，m in i V I D A S 法和膜芯片法的特异性和抗干扰性较好，人工污染实验中3 种方法的结果均符合设计预 期。结论日常检验中可采用国标培养法和m in i v I D A s 法进行筛检工作，应急任务可使用膜芯片法，以缩短 筛检时间，m in i v I D A s 法和膜芯片法是金黄色葡萄球菌快速筛检的可靠工具。 关键词：金黄色葡萄球菌；m in i V I D A s 法；膜芯片法；快速筛检 C o m p a r is o no ft r a d it io n a lc u l t u r em e t h o da n d2r a p ids c r e e n in gm e t h o d sf b r d e t e c t io no f 脚，纱肠c D c c W s 仃“r P “s W A N GL i G a n g ，Z H A N GL e i，Z H A N GJ in g ，F E IY r u n Y a n ，F US h a L i，W UD a n ，T UD a W e i4 ( D g g 抽g 砌s 嘶“把扣，乃D J 口胛dD r 增n f 阳，彻g g 砌占4 01 121 ，加以) A B S T R A C T ：o b j e c t iv e T oc o m p a r e2r a p ids c r e e n in gm e t h o d so fm in i V I D A Sm e t h o da n dm e m b r a n ec h ip m e t h o dw it ht h ec u l t u r em e t h o dinn a t io n a ls t a n d a r d ，e V a l u a t in gt h ee f 话c t iV e n e s sa n df e a s ib il it yo ft h e2m e t h o d s M e t h o d s 哆p J 纱，D c D c c “s 口“陀“sw a ss e l e c t e da s t a r g e tb a c t e r ia t h ee x p e r im e n t sw e r ed e s ig n e dt o t e s tt h e s e n s it iv it y ，s p e c if ic it ya n din t e r f e r e n c er e s is t a n c eo f3m e t h o d s ，a n dt h ea r t m c ia l l yc o n t a m in a t e ds a m p l e sw e r et e s t e d s iI 叽1 t a n e o u s l y T h e 叩p l ic a t io ne f 话c t so f3s c r e e n in gm e t h o d sw e r ec o m p a r e d R e s u l t s T h ec u l t I l r em e t h o din a t io n a ls t a n d a r da n dm in i V I D A Sm e t h o dh a dah ig hs e n s it iV it y ，t h es p e c if ic i够a n din t e r f e r e n c er e s is t a n c eo f m in i V I D A Sa n dm e m b r a n ec h ipm e t h o dw e r eb e t t e r ，a n dt h er e s u l t so f3m e t h o d sina r t if l c ia l l yc o n t a m in a t et e s t w e r ec O n s is t e n tw it ht h ed e s ig ne x p e c t a t io n C O n c l u s iO nT h ec u l t u r em e t h o dinn a t io n a ls t a n d a r da n dm in i- V I D A S m e t h o dc a nb eu s e dind a il ym s p e c t io n s ，a n dm e m b r a n ec h ipm e t h o dc a nb eu s e dine m e r g e n c yt e s t in gino r d e rt o s h o r t e nt h es c r e e n in gt im e A d d ic io n a l l y ，t h em in i V I D A S m e t h o da n dm e m b r a n ec h ipm e t h O da r er e l ia b l et o o l sf o r r a p ids c r e e n in go f & 印，D c o c c “s 口“，“s K E Yw o R D s ：& 嘿p 砂Z D c D c c “s 口“理“j ；m in i- V I D A Sm e t h o d ；m e m b r a n ec h ipm e t h o d ；r a p ids c r e e n in g 基金项目：重庆市社会民生科技创新专项项目( c s t c 2 0 1 5 s h m s z x 0 0 0 0 2 ) F u n d ：S u p p o n e db yt h eS o c ia lS c ie n c ea n d 1 1 e c h n 0 1 0 9 yI n n o V a t io nP r o j e c to f C h o n g q in g ( c s t c 2 0 1 5 s h m s z x 0 0 0 0 2 ) + 通讯作者：屠大伟，正高级工程岘主要研究方向为食品质量与安全。E - m a il ：w e id a n l m 1 6 3 c o m + C o r r e s p o n d in ga u t h O r ：T UD a - W e i，S e n io rE n g in e e LC h o n g q in gI n s t it u t ef o rF o o da n dD n l gC o n t r o l ，C h o n g q in g4 0 1 1 2 1 ，C h in aE m a il w e id a t u f u 1 6 3 c o m 第1 期王利刚，等：国标培养法与2 种金黄色葡萄球菌快速筛检方法的比较 2 3 9 1 引言 金黄色葡萄球菌( & 印自y 肠c o c c 淞以站憎螂) 是一种食品 中常见的食源性致病菌，广泛存在于自然界中，在其生长 过程中会产生不同种类的毒素和侵袭性酶，如肠毒素、杀 自细胞素、溶血毒素和血浆凝固酶等，食用了被其污染的 食品后可能导致人体出现食物中毒，如严重腹泻等症状， 严重威胁健康和生命安全【l 。5 。因此，研究金黄色葡萄球菌 的检测方法对提高食品安全检验技术、保障公众生命健康 具有重要意义。 根据我国食品中致病菌的限量标准规定，金黄色葡 萄球菌要求为五样法检验 6 ，而金黄色葡萄球菌的国家标 准检验方法采用的是传统培养方法 ”，操作步骤繁多，从 处理样品到初步筛检结果通常需要3 6 7 2h ，因此，传统的 培养方法已经不能满足检验工作中通量大、时限短的要求， 迫切需要快速、简便、可靠的筛检技术。随着对金黄色葡 萄球菌生长特性研究的深入和生物技术的发展，免疫学及 分子生物学检验技术逐步建立并应用到检验中，部分成熟 可靠的技术已经商业化 8 。1 2 。本研究将国家标准中的传统 培养方法【”、已商业化的基于免疫学方法的金黄色葡萄球 菌筛检试剂条 13 】和正在开发的基于分子生物学方法的膜 芯片3 种筛检方法进行对比试验，对方法的灵敏性、特异 性和抗干扰性进行比较并观察不同方法在人工污染试验 下的筛柃效果。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1菌株与样品 金黄色葡萄球菌( & 乜加y ，D c o c c “sd “旭甜s ，C I c c2 3 6 5 6 ) 和表皮葡萄球菌( & 印砂肠c o c c 甜s 印f 如珊f 加，c I c c1 0 2 9 4 ) 来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心；鼠伤寒沙门氏 菌( 勋，m D n P z 肠巧p 砌”“订“m ，A T c c 1 4 0 2 8 T ”) 、单核细胞增 生李斯特氏菌括把r 如m o 胛D 哕幻g e n 甜，A T c c 1 9 1 1 5 7 ”) 、阪 崎氏肠杆菌( 砌把，0 6 口把r5 口忌口z 口七f f ，A T c c 2 5 9 4 4 ”) 和大肠 埃希氏菌( 西c g r f 幽f 口c o ? j ，A T C C 2 5 9 2 2 T ”) 来源于美国菌 种保藏中心。 人工污染试验使用的样品为实验室日常检验样品， 共5 0 批次，均已确定为金黄色葡萄球菌阴性样品。其中肉 制品1 0 批次、蛋及蛋制品1 0 批次、蔬菜制品1 0 批次、生 鲜乳1 0 批次、冷冻肉制品1 0 批次。 2 1 2 仪器与试剂 z D P 一2 1 6 0 常规生化培养箱( 上海智城分析仪器制造 有限公司) ：m in i V I D A s 全自动免疫分析仪( 美国 b io M 6 r ie u x ，I n c ) ：M F s 一8 膜芯片杂交仪( 四川华汉三创生 物科技有限公司) ；I M G _ 1 膜芯片成像仪( 四川华汉三创 生物科技有限公司) 。 7 5 氯化钠肉汤、B a ir d P a r k e r 培养基、血平板、B H I 肉汤、营养琼脂、兔血浆冻十粉( 北京陆桥技术股份有限公 司) ；V I D A SS E T 2 试剂条( 法国b io M 缸e u X ，s A 公司) ；细菌 基因组D N A 提取试剂盒( 天根生化科技( 北京) 有限公司) ； 敛病微生物检测芯片( 四川华汉三创生物科技有限公司) 。 2 2 实验方法 2 2 1实验步骤 国标方法：按照G B4 7 8 9 1 0 7 】中的检验流程，将样品 转接至B a ir d P a r k e r 培养基，3 6 培养2 4h ，观察筛检结果。 m in i V I D A s 法：按照使用说明书进行增菌、提取等 操作，上机检验结束后，生成仪器报告并打印筛检结果。 膜芯片法：接种产品自带培养基，并按照其要求的培 养温度、时间培养后，使用细菌基因组D N A 提取试剂盒提 取细菌总D N A ，使用自带的P c R M ix 对提取的D N A 进行 扩增，扩增产物9 9 变性1 0m in ，用膜芯片杂交仪进行杂 交、洗脱等操作，结束后使用膜芯片成像仪观察筛检结果。 2 2 2 灵敏性试验 本研究对3 种筛检方法的灵敏度进行比较，将金黄色 葡萄球菌标准菌株接种到营养肉汤中，3 6 培养2 4h ，按 照l ：l o 的比例进行梯度稀释，获得1 0 1 1 0 4c F u 肺L 浓度 的菌悬液，不同浓度视作不同方法液体培养基培养物，分 别按照2 2 1 进行筛检操作。 2 2 3 特异性试验 本研究对3 种筛检方法的特异性进行比较，对金黄色 葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、 阪崎氏肠杆菌、大肠埃希氏菌和表皮葡萄球菌进行培养， 培养物按照1 ：1 0 的比例进行梯度稀释，获得1 0 3c F u m L 浓度的菌悬液，分别按照2 2 1 进行筛检操作。 2 2 4 杂菌干扰试验 本研究对存在杂菌干扰时的3 种筛检方法的筛检效果 进行比较，将金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细 胞增牛李斯特氏菌、阪崎氏肠杆菌、大肠埃希氏菌和表皮 葡萄球菌分别进行培养，按照1 ：10 的比例进行梯度稀释， 以金黄色葡萄球菌为目标，设定3 组混合菌。第1 组为鼠 伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎氏肠杆菌、 大肠埃希氏菌和表皮葡萄球菌，浓度均为1 0 1c F u m L ，按 照体积比为1 ：1 ：l ：1 ：1 混合：第2 组混合菌中上述5 种菌的 浓度均为1 0 2c F u m L ，按照体积比为1 ：1 ：1 ：1 ：1 混合；第3 组混合菌中上述5 种菌的浓度均为1 0 3C F u m L ，按照体积 比位1 ：1 ：1 ：1 ：1 混合。以上混合菌按照1 ：l ( 旷功的比例与浓度 为1 0 2c F u m L 的金黄色葡萄球菌混合，同时使用浓度为 1 0 3c F u m L 的金黄色葡萄球菌和浓度为1 0 3c F U m L 的混 合菌作为阳性和阴性对照，分别按照2 2 ，1 进行筛检操作。 2 2 5 人工污染试验 模拟日常检验条件，对3 种筛检方法的筛检效果进行 比较，收集实验室检验的金黄色葡萄球菌阴性样品5 0 批次 2 4 0 食品安全质量检测学报第8 卷 其中肉制品1 0 批次、蛋及蛋制品1 0 批次、蔬菜制品1 0 批次、生鲜乳1 0 批次、冷冻肉制品1 0 批次。将每批次样 品分为2 组，一组为阳性对照组，按照每2 5g 样品添加1 m L 浓度为1 0 2C F U m L 的金黄色葡萄球菌的比例进行人工 污染；另一组为阴性对照组，不进行人工污染，分别按照 2 2 1 进行筛检操作。 3 结果与分析 3 1 灵敏性实验 用3 种方法对不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液进行 灵敏性试验的结果如表1 所示，在传统国标培养法中， B a ir d P a r k e r 培养基上出现典型菌落的浓度( 即检出浓度) 为 1 0 1C F U m L ；m in iV I D A S 法出现判定为阳性结果的浓度为 1 0 1c F u 1 1 1 L ，灵敏性较高，当检测阈值( t e s tv a l u e ，T v ) 大于 O 1 3 时，系统判定检出金黄色葡萄球菌；膜芯片法的检出 浓度为1 0 2C F u m L 膜芯片法通过核酸杂交显色后观察结 果是否呈阳性，但在杂交前还经过了D N A 提取、P c R 扩 增及高温变形等过程 1 钔，每一步操作都会对结果造成影响 故其灵敏性除方法本身外还应考虑实验人员的操作情况。 由实验结果可以看出，国标培养法和m in iv I D A s 法的灵 敏性高于膜芯片法。 3 2 特异性实验 3 种方法的特异性实验结果如表2 所示，国标培养法 中B a ir d P a r k e r 培养基的选择性较强，金黄色葡萄球菌在 B a ir d P a r k e r 培养基上的典型生长状态为：菌落直径为2 3 m m ，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带， 在其外层有一透明圈 ”。其他菌一般不会生长或与金黄色 葡萄球菌的典型形态差异较大，肉眼观察容易区分，可直 接排除。表皮葡萄球菌在B a ir d P a r k e r 培养基上的生长状 态与金黄色葡萄球菌相似，但没有浑浊圈，也可以直接分 辨。但有报道称，B a ir d P a r k e r 培养基可能会因为配制、保 存等原因，使金黄色葡萄球菌生长时出现生长状态不典型 的情况【1 5 】。m in iD A s 法针对金黄色葡萄球菌产生的肠 毒素进行检验，特异性较强。膜芯片法针对金黄色葡萄球 菌的s p 基因 16 设计探针，特异性较好，其特异性与 m in iV I D A S 法相当。 表13 种检测方法的灵敏性比较 T a b l el C o m p a r is o no fs e n s it iV it yo f3m e t h o d s 菌悬液浓度( C F U 札) 1 0 11 0 21 0 3 1 0 4 现象描述无可疑菌落生长可疑菌落生长可疑菌落生长可疑菌落生长 国标培养法 笋定结果 + T V 值0 2 00 7 31 2 42 8 9 M in i V I D A S 法 判定结果 + + 膜芯片法灞运萄诿品翻霾豳 震震 蕊爝豳隧 麓圈豳豳 疆霸黼豳嘲 豳圈豳圈黧豳豳 圈霜瘸露黧露圈图 _ + 注：4 1 表示细菌通用内参基因；5 表示金黄色葡萄球菌；1 1 表示杂交阳性质控样；1 2 表示杂交阴性质控样。 表23 种检测方法的特异性比较 1 a b l e2C o m p a r is o no fs p e c 狮c it yo f3m e t h o d s 金黄色葡萄球菌鼠伤寒沙门氏菌 单增李斯特氏菌阪崎氏肠杆菌大肠埃希氏菌 表皮葡萄球菌 国标培养法 m in iV I D A S 法 膜芯片法 + + + 第1 期王利刚，等：国标培养法与2 种金黄色葡萄球菌快速筛检方法的比较 2 4 1 3 3 杂菌干扰实验 杂菌干扰实验结果如表3 所示，按照2 4 的设计，干 扰菌的总浓度水平为1 0 1c F u m L 、1 0 2c F u m L 及1 0 3 c F u mL 分别处于低于、相当、高于金黄色葡萄球菌的浓 度水平，本试验的结果可反应3 种筛检方法在以上3 种干 扰浓度下的筛检效果情况。阳性对照组和阴性对照组的实 验结果显示3 种方法的操作正常，采用国标培养法时，在 杂菌干扰实验的3 个设计中均有典型菌落生长，但由于其 中有其他干扰菌的存在，出现菌落之间交叉、覆盖的现象， 不利于典型菌落的观察，可以再次挑菌纯化后观察，其他 研究者也有类似情况出现【1 7 。M in i V I D A s 法的筛检结果 均为阳性，阴性对照组的检测结果为阴性，杂菌干扰实验 结果与预期完全符合。膜芯片法在干扰菌浓度低或者相当 时检出，干扰菌浓度高时未检出，原因可能是D N A 提取后 总D N A 浓度不变，但是目标菌的D N A 浓度相对较低，从 而影响判定结果。 表33 种检测方法的抗干扰性比较 T h b l e 3 C o m p a r is o no fa n t i in t e r f e r e n c eo f3m e t h o d s 3 4 人工污染实验 人工污染实验结果见表4 ，国标培养法对于阳性组 样品的筛检效率为9 0 ，有1 0 的样品出现疑似典型菌 落的情况，进一步实验证明其为非金黄色葡萄球菌，阴 性组样品中也有相同情况出现。m in l 一V I D A S 法对于阳性 组样品的筛检效率为1 0 0 ，对阴性组样品的筛检效率为 8 0 其中有2 0 的样品被鉴定为阳性，可能的原因是这 类样品在原料或者生产过程中存在金黄色葡萄球菌生长 的情况，并且产生了肠毒素，肠毒素具有耐热等特性 18 1 ， m in i V I D A S 法针对的是金黄色葡萄球菌的肠毒素进行检 表4 人工污染样品的筛检结果比较 T h b l e 4C o m p a r is o no ft h ep r e d e t e c t io nf o ra r t in c ia U y c o n t a m in a t e ds a m p l e s 验，因此会出现以上情况。膜芯片法对于阳性组样品的筛 检效率为10 0 ，但是阳性结果观察到的显色程度不同， 个别样品显色较浅，这可能是南于干扰芮较多，增菌过 程中金黄色葡萄球菌未形成优势菌株，从而造成后期显 色不明显，符合预期。 4 结论 从3 种筛检方法的比较结果可以看出，传统国标培养 法的灵敏性、特异性较优，但在杂菌较多的情况下进行菌 落形态观察时容易被干扰；m in iV I D A s 法在特异性、灵敏 性和抗干扰性上均表现良好，可以满足日常筛检工作需要， 而且可以直接判定样品中是否存在肠毒素，获得样品的安 全风险情况的进一步信息：膜芯片法的特异性较好，但是 该方法要从菌株水平转换剑分子水平，中间步骤会影响其 灵敏性，甚至可能出现假阴性结果。实际操作中3 种方法 的筛榆时间差异较大，国标培养法为3 6 7 2h ，m in i v I D A S 法为9 0 m in 或者2 4h 膜芯片法为1 4h 。综合以卜情7 兑，建 议日常检验中可以采用国标培养法和m in iV I D A S 法进行 筛柃工作，对于应急任务可使用膜芯片法缩短筛检时间， 同时用m in i v I D A S 法进行验证，确保实验结果的准确性。 参考文献 1 周莉，王永，王法云，等食品中金黄色葡萄球菌概况及新型检测技术 研究进展 J 巾国酿造，2 0 1 6 ，3 5 ( 2 ) ：1 _ 4 z h o uL ，W a n g Y ，W a n gFY 鲥以R e c e n ta d v a n c eo fg e n e r a ls it L l “o na n d n o v e ld e t e c t io nt e c h n o l o g ie so fs 硷p 砂肠c D c c “s w 旭“sinf o o d J c h in a B r e w ，2 0 1 6 ，3 5 ( 2 ) ：1 - 4 2 李琼琼，范一灵，宋明辉，等食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测 方法 T 食品安全质量检测学报2 0 1 6 ，7 ( 2 ) ：5 5 5 5 6 0 z h a n gQ Q ，F a l lY L ，S o n gM H ，订fR e s e a r c ha d V a l l c e so nf o o d b o m e & 印砂f 0 c c 谢e n t e r o t o x in s 锄dit sd e t e c t io nm e t h o d s J 】JF o o ds a fQ u a l ， 2 0 1 6 ，7 ( 2 ) ：5 5 55 6 0 3 N e c id o v a L ， B o g d a n o v ic o v a K ， H a m s t l a k o v aD ，甜d 7 s h o r t c o m m u n ic a t io n ：P a s t e l l r iz a t io na sam e a n so fin a c t iv a t in gs t 印h y l o c o c ca l e n t e r o t o x in A ，B ，a n d c in m il k J 】J D a ir ys c l ，2 0 1 6 ，9 9 ( 】1 ) ：8 6 3 8 8 6 4 3 4 c h e o gK ，w a n gs ，x uYD if 艳r e n tr 0 1 e so f 印砂f 。c D c c “s 口“增“j e n t e r o t o x inj nd j 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彻蜘t I n d ，2 0 1 6 ，4 2 ( 3 ) ：1 9 8 2 叭 9 】朱安妮，唐俊妮，赵燕英，等金黄色葡萄球菌新型肠毒素I 双抗夹心 一酶联免疫检测方法的建立 J 食品科学，2 叭6 ，3 7 ( 1 6 ) ：1 9 3 1 9 8 z h uA N ，T a n gJ N ，z h a oY Y ，甜以D e v e l 叩m e n to fad o u b l e - a n t ib o d y s a n d w ic he n z y m e1 in k e dim m u n o s o r b e n ta s s a yf o rd e t e c t io no f s t a p h y l o c o c c a le n t e m t o x inI ( S E I ) J 】F o o ds c i，2 0 1 6 ，3 7 ( 1 6 ) ：1 9 3 1 9 8 1 0 】李琴，王莹，柳家鹏，等金黄色葡萄球菌肠毒素E u s A 检测方法的 建立及应用 J 】中国奶牛，2 0 1 6 ，( 3 ) ：3 2 3 5 L i Q ，W h n gY ，L iuJ P ，甜口f D e v e l o p in g ad e t e c t io nm e t h o df o r s 印h y l o c o c c a le n t e r o t o x ina bb ye n 2 y m e l in k e dim m u n o - s o r b e n ta s 8 a y J c h in aD a il yC 毗l e ，2 0 1 6 ，( 3 ) ：3 2 3 5 1 1 赵碉明，满朝新，曲艳艳，等环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄 色葡萄球菌明中国食物与营养，2 0 1 6 ，2 2 ( 1 ) ：5 7 6 1 z h a oY M ，M a nz x ，Q uY Y ，甜口，R a p idd e t e c t io no f 印砂，。c o c c 螂 m l 佯“sinr a wm e a ts a l 】叩l e sb yl o o p n l e d ia t e dis o t l l e r m a la I l l p l if ic a t io n J F o o d N u t rC h in a ，2 0 1 6 ，2 2 ( 1 ) ：5 7 6 1 1 2 周莉，王永，王法云等免疫磁珠检测食品中金黄色葡萄球菌的研究 J 河南科学，2 0 1 5 ，( 7 ) ：1 1 1 9 1 1 2 3 z h o uL ，w a n gYw a n gF Y “a ? ，I H u n u n em a g n e t icb e a d s ( m I B ) d e t e c t 缸g 印砂f 。c c 驸口“，跏siI lf o o d J H e n a l ls c i，2 叭5 ，( 7 ) ：1 1 1 9 1 1 2 3 1 3 薛成玉，遇晓杰，万丽葵，等全自动荧光酶标仪测定金黄色葡萄球菌 肠毒素的研究 J 中国卫生工程学，2 0 0 8 ，7 ( 5 ) ：3 0 5 3 0 6 x u ecY Y u ，w a nL K ，甜以D e t e m in a t io no f 印砂，D c c 蚶口“陀淞 e n t e r o t o x il lb ym in iV I D A sd e t e c t o r J c h inJP u b l icH e a h hE n g ，2 0 0 8 ， 7 r 5 1 ：3 0 5 3 0 6 1 4 】何洋应用基因芯片检测食品中金黄色葡萄球菌 D 成都：西华大学， 2 0 0 6 H eY _ A p p l y in gg e n ec h ipf o rd e t e c t in g 印砂如c c “s 口“耀淞inf o o d s 【D 】c b e n g d u ：x ih u au n iv e r s i吼2 0 0 6 1 5 张文利，刘月芳B P 培养基经不同条件贮存后对金