枸杞多糖检测方法研究.ppt

枸杞多糖检测方法研究,姓名：王畅2010-8-5,内容提要,枸杞多糖简介,来源：茄科植物枸杞的干燥果实枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide）简称LBP，是以阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖与半乳糖醛酸组成的酸性杂多糖同多肽或蛋白质构成的复合多糖为主,还含有中性杂多糖和葡聚糖同多肽或蛋白质构成的复合多糖，是天然的大分子物质。,ClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtext,白色略带棕色絮状，纤维状无味吸湿性,理化性质（一）,理化性质（二）,溶解性1.溶于水，二甲基亚砜，溶解度随中性单糖含量的减少而降低2.不溶于高浓度乙醇，乙醚，丙酮，氯仿，正丁醇等有机溶剂,理化性质（三）,常见的化学性质测定试验结果结论硫酸苯酚反应阳性含中性糖硫酸半胱氨酸阳性含半乳糖醛酸卡玛斯亮蓝反应阳性含有蛋白质斐林试剂反应阴性不含还原糖碘碘化钾反应阴性不含有淀粉,选题背景（一）,生理活性：增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖血脂、保肝，可作为第三代功能性食品的功能因子随着生活水平的提高，由以治病为主向防病为主的观念转变，为功能食品的开发带来了良好机遇。功效明确的枸杞多糖符合新一代功能食品的要求，枸杞多糖的研究将推动枸杞产品向更高层次发展,保健食品的区分,第一代保健食品：以民间的处方，秘方为基础，根据原材料的功能推断保健品的功能，未经严格的科学检测的保健食品第二代保健食品：经过动物实验和人体实验证明产品具有某项生理调节功能，其安全性，功能性都较为可靠第三代保健食品：经过进一步的严格实验及审核，除具备第二代产品的要求外，还要明确功能能因子及其结构，含量，作用机理，类似于药品的要求,选题背景（二）,多糖一般的检测方法概括如下:,1将无紫外吸收的多糖与显色剂显色，产生紫外吸收，从而用紫外法定量,如硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法，3、5-二硝基水杨酸比色法测定总糖。,2直接测糖法，折光法测定多糖，主要是水溶性糖。原理是用折射计测得的折射指数值(糖度)代表着溶液中可溶性物质的含量高低，若溶液中的溶质是糖物质或以糖为主的糖物质,则折射指数值就反映着糖含量的高低。,3多糖检测的HPLC法也是基于上面的思路，要么衍生化后使用紫外或荧光检测器，要么使用通用型检测器，这类检测器主要有示差检测器。,蒽酮-硫酸法,多糖在浓硫酸作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛或羟甲基糠醛,而生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,反应后溶液呈蓝绿色在620nm处有最大吸收，在10100ug范围内其颜色的深浅与可溶性糖质量浓度成正比其主要反应式为,选题背景（三）,质量不易控制枸杞多糖是一个水溶性的大分子物质,不能如小分子物质那样,通过熔点测定、元素分析,四大光谱等鉴定后,制定质量标准。分子量测定决定了枸杞多糖的生物活性，分子量过大不易透过细胞膜，影响活性，分子量小一般是没有活性的，因此分子量数据可以作为枸杞多糖质量标准的重要指标。多糖的单糖组成分析是进行多糖质量控制和获取多糖基本信息的重要环节。单糖组分及其摩尔比可以作为质量标准的重要指标。,分子量测定高分子物质的分子量测定有渗透压法、蒸气压法,凝胶色谱法、超速离心法等，但已有的报导大多集中在有机溶剂体系的高分子聚合物如各种塑料产品、人工橡胶等，水体系大分子物质如蛋白质、多糖的分子量测定很少报导单糖组成测定方法主要有TLC、GC、HPLC、CE等,但是关于枸杞多糖柱前衍生化高效液相色谱法测单糖组成还未见报道。,研究目的,建立一个枸杞多糖的质量标准定量鉴别方法：(1)通过HPLC法测定枸杞多糖的分子量(2)通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞多糖的单糖组成及其摩尔比,在多糖的分子量测定方法、尤其是枸杞多糖的测定方法尚未确立标准，无据可依的情况下，继承传统保健理论的同时结合现代科学检测技术，找出枸杞多糖的最优检测方法，制订枸杞多糖的检测标准，为以后的枸杞多糖检测提炼提供依据。,研究意义,研究动态,常见的检测方法,化学方法,物理方法,苯酚-硫酸法，高碘酸氧化，Smith降解，甲基化分析,比旋光仪、紫外分光光度计、红外光谱仪、液相色谱仪、气相色谱仪、质谱、核磁共振,从所得到的数据来看，国内对枸杞多糖的分离纯化，含量测定分离提取、分级纯化组分鉴定及其分子量、结构、基本性质等方面有大量成果报道,但研究者所得出的枸杞多糖分子量、组成、结构、等研究结果各不相同,枸杞多糖相对分子量的检测方法,蒸汽压法,凝胶过滤法,HPLC,渗透压法,光散射法,粘度法,a,f,e,b,c,d,分子量的测定方法,凝胶过滤法将已知分子量的葡聚糖标准品进行凝胶层系，洗脱收集，用硫酸-蒽酮法检测多糖，分别求得相应的洗脱体积Ve用蓝色葡聚糖上柱求得外水体积Vo.以Ve/Vo为纵坐标，lgMr为横坐标，得到分子量的标准曲线。3.取枸杞多糖进行一样的操作求得Ve/Vo查标准曲线可求得多糖的分子量,多糖中单糖的组成及其摩尔比的测定方法,组成成分,单糖：阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖半乳糖醛酸-硫酸-半胱氨酸反应定性蛋白质-斐林-酚法,枸杞多糖中单糖的组成及其摩尔比,枸杞多糖常见官能团红外光谱解析,紫外检测,在200nm处有多糖的特征吸收峰,在260nm处没有吸收峰，说明不含核酸,在280nm处吸收峰不明显，说明蛋白质含量低,发展趋势,1)枸杞多糖结构与活性、功能的关系方面得到明确，市场上将有更多以枸杞多糖为主要成分的新药，并且都是采用现代生物技术，从分子、细胞、器官等分子生物水平上研究活性因子的结构、含量及其作用机理，准确评价其功效。2）因为有统一的质量标准，明确的结构证明其新颖性，创新性，实用性，中国除了主要围绕枸杞多糖的提取方法、纯化工艺、分离技术、制备治疗脂肪肝胃溃疡药物应用等专利以外，还将得到更多关于枸杞多糖的组分结构、作用机制、药理功效等方面的专利。,拟采取的研究方法及可行性分析,(1)通过HPLC法测定枸杞多糖的分子量可行性分析：严邦干曾采用此法测定香菇多糖的分子量，该方法较其他多糖测定法具有迅速，简便，准确的特点，是目前较为行之有效的测定方法.(2)通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞多糖的单糖组成及其摩尔比可行性分析：采用3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)在碱性条件下与单糖定量缩合生成单糖PMP衍生物,用常规的紫外检测器和C18烷基键合柱,建立适于多糖单糖组成测定的HPLC新方法,达到灵敏、快速、准确、方便和可在线大批量分析的目标。,HPLC法测分子量,色谱柱：proteinkw-804检测器：示差折光检测器温度：室温流动相：醋酸钠缓冲溶液以不同分子质量的标准右旋糖酐分子的分离保留时间与相应的分子质量建立分子质量对数值绘制标准坐标曲线，待测得枸杞多糖经分离后得到不同分子质量峰的保留时间值，通过标准曲线即可计算枸杞多糖的分子质量分布（由分子质量计算辅助软件自行运行）,HPLC检测单糖组分和含量,直接进样检测：柱子：carbohydrate柱氨基键合相柱（SpherisorbNH2，HypersilNH2）检测器：示差检测器缺点：柱子成本高，氨基键合柱易与还原糖生成希夫碱，缩短柱子的寿命示差检测器灵敏度低，不适用于梯度洗脱,柱前衍生化HPLC测枸杞多糖中的单糖组成,前处理：1.样品水解：a.硫酸适合于中性糖的水解b.三氟醋酸适用于植物细胞壁多糖，糖蛋白，糖胺聚糖的水解（1）多糖的水解常用硫酸，其用量不易控制，过多会导致多糖样品的炭化，而产生杂质峰，过少又会水解不完全。本法采用三氟醋酸可较好的实现多糖的水解。（2）实验中要尽量减少样品的水分含量，以免影响衍生化的结果，在衍生化时，适当加大无水醋酸酐的用量也可减小水分的影响。,柱前衍生化,1.糖类衍生的试剂：2-氨基苯甲酸、对甲氧基苯胺、2-氨基吡啶、6-氨基喹啉、对硝基苯甲酰氯和3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)2.步骤：a.对照品各种单糖标准品Ara，Rha，Xyl，Man，Gal，Glc，Fuc按等量混合衍生化b.枸杞多糖水解液衍生化,柱前衍生化反应,PMP的优点：PMP与糖类物质衍生时反应条件温和,产物无立体异构。两分子PMP与一分子单糖缩合，生成的衍生物与各单糖的定量关系明确，线性关系良好。检测灵敏度较高,可同时检测醛糖、酮糖及糖醛酸PMP衍生物在250nm处有强烈的紫外吸收，克服了单糖本身没有紫外吸收的特点，同时使用紫外检测器克服了示差检测器灵敏度低，不适用于梯度洗脱的缺点。,HPLC色谱条件,色谱柱：C18色谱柱检测器：紫外检测器检测波长：250nm柱温：室温进样量：20ul流动相(流速：1.2ml/min)溶剂A：15%乙腈+20mm/L乙酸铵水溶液溶剂B:40%乙腈+20mm/L乙酸铵水溶液梯度模式：时间梯度：0min25min50min浓度梯度：0%50%100%溶剂B,多糖组成分析及计算方法,计算校正因子fx=（mx/Ax）/(mfuc/Afuc)计算样品中各种单糖的比例：m1:m2:m3.mn=A1f1:A2f2:A3f3.AnfnAx,Afuc分别为对照品单糖x衍生物，内标衍生物的峰面积;mx,mfuc分别为对照品单糖x衍生物，内标衍生物的浓度（mmol/L）,方法学的考察,线性范围：取5种不同浓度的标准样品混合液衍生化，进样记录色谱图，看浓度和峰面积的线性关系精密度实验：取标准单糖混合液衍生化连续进样5次，测各单糖面积之比的进样精密度稳定性实验：取枸杞多糖水解液衍生化后的溶液隔两小时进样一次，记录峰面积，测相对误差重复性实验：取枸杞多糖，依前述衍生化和