过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Th1和Th2型免疫应答相关性研究

过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Thl和Th2型免疫应答相关性研究摘要目的探讨TLR2在过敏性紫癜患J LJb周血单核细胞的表达及其与TM和Th2型免疫应答的相关性，探讨TLR2在HSP发病机制的作用。方法选取2011年10月2012年11月于我院收治的过敏性紫癜患儿64例为研究对象，分为HSP无肾损害组(NHSPN，36例)及HSP有肾损害组(HSPN，28例)，另选取我院儿保科健康查体儿童30例作为正常对照组。采用流式细胞术检测外周血单核细胞TLR2蛋白表达阳性率，实时荧光定量PCR技术检测外周血单核细胞TLR2mRNA的基因相对表达量，ELISA法检测血浆IFN一小IL4水平。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSDt检验，相关分析采用Pearson相关检验进行统计学处理。结果1HSP患儿外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)TLR2mRNA相对表达量及TLR2蛋白表达率均显著高于正常对照组(t=4283。P001；t 7=5487，P001)，HSPN组外周血单核细胞TLR2 mRNA相对表达量及TLR2蛋白表达率均明显高于NHSPN组(F=932，P005；F=21522，P001)；2HSP组血浆IL4水平显著高于对照组(t=13446，P001)，IFNY水平显著低于对照组(t=14364，P001)，IVN-vm一4比值显著低于对照组(t=7410，P001)。3HSP组CD4+T细胞TLR2蛋白表达率TLR2mRNA呈正相关；与血浆IL4水平呈显著正相关；与IFN7IL4比值呈显著负相关；与血浆IFN-y水平不存在相关性。结论1HSP患儿外周血单核细胞TLR2 mRNA及蛋白表达均明显增高；HSP有肾损害组患)LCb周血单核细胞TLR2 mRNA及蛋白表达皆显著高于HSP无肾损害组。2HSP病儿存在ThlTh2失衡，Th2优势活化与TLR2蛋白表达升高呈显著相关。3TLR2活化可能参与了HSP的免疫发病机制，TLR2的过度活化可能与HSP的肾损伤有关。硕士研究生指导教师关键词：过敏性紫癜；紫癜性肾炎；Toll样受体；细胞介素4(IL4)程娜(Jh科学)常红副教授7-干扰素(IFN-y)；白Study on the expression of TLR2 in peripheral blood mononuelear celland the balance of Thlfrh2 in of patients with Henoch-SchnleinpurpuraAbstractobi ective We study the expression of Toll like receptor 2(TLR2)mRNA andprotein in peripheral blood mononuelear cell of children with Henoch-Schonleinpurpura(HSP)，and to explore its influence on ThlTh2 balance in order to investigate the rolesof TLR2 in the pathogenesis of liSPMethods 64 children with a clinical diagnosis of HenochSch6nlein purpura wereenrolled in the study at Pediatric Department of the Amliated Hospital of QingdaoUniversity Medical College from October 20 1 1 to November 20 1 2，all patients had activedisease at the time of enrollment，which were divided into 2 groups，36 c11ildren withnon-Henoch-Schonlein purpura nephritis(NHSPN)，28 children with HenochSchonleinpurpura nephritis(HSPN)。30 healthy agematched children served as controls from C11ildHealth Division of this hospitalTLR2 mRNA relative of expression level on peripheralblood mononuelear cells(PBMCs)was detected by real-time fluorescent polymerase chainreaction；TLR2 protein expression level Was detected by flow cytometric analysisThelevels of IFN-v and IL一4 in plasma were determined by ELISAWe used Onewayanalysis of variance and Pearson correlation test for Statistical AnalysisResults 1Compared witll the control group，the expression level of TLR2 mRNAwere remarkably increased in children with HSP；The level of TLR2 mRNA in HSPNgroup was higher than that of the NHSPN group2The levels of IFNY and the ratio ofIFN一3IL-4 in plasma of HSP children were significantly lower than those of the controls，respectively while the levels of IL一4 were remarkably higher than those of normalchildren-3the expression of TLR2 mRNA and protein in PBMCs of children with HSPshowed a significant positive correlationThe TLR2 protein expression rates of CD4+T inHSP children had positive correlation wim the plasma levels of IL-4 and negativecorrelation with the ratio of IFN-7IL一4，but had no correlation with the levels of IFNYConclusions 1In children with HSP，The expression levels of TLR2 mRNA andprotein in PBMCs were remarkably increased；The expression of TLR2 mRNA andprotein in PBMCs of children with HSPN showed significantly higher than that of theNHSPN group；2 there iS a imbalalice of Th lTh2 in HSP childrenand the function ofT112 relatively prevails over Th 1The increase of Th2 functions correlates closely withhigh expression of TLR2 Oil PBMCs3The aberrant activation of TLI也may be correlated、itll immunological pathogenesis of HSP,the excessive activation of TLR2 may beassociated with renal injury of HSR4The activation of TLR2 may mediate immuDepathogenesis of liSP by up-regulation T112 immulle responseKey words：HSP；HSPN；TLR2；IFN吖；IL一4Postgraduate student：Cheng Na(Pediatrics)Directed by Prof：Chang Hong目录引言1第一章材料与方法311主要器材312主要试剂3l-3引物314研究对象及分组415研究方法416统计学处理9第二章结果1021血浆IFN-Y、IL-4水平及IFN-y IIL一4比值比较1022外周血单核细胞TLR2 mRNA及蛋白表达变化1023 HSP患儿外周血单核细胞TLR2mRNA与TLR2蛋白表达的相关性1l24 TLR2蛋白表达与血浆IFNY、IL一4水平及IFNYIL一4比值的相关性分析11第三章讨论1431 HSP发病机制1432 TLRs与免疫介导1433 TLRs与相关疾病1533 TLRs与HSP及HSPN16结论18参考文献19综述22参考文献32攻读学位期间的研究成果35致谢36学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明37引言过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Thl和Th2型免疫应答相关性研究引言过敏性紫癜(henoehschonlein purpura，HSP)是儿童时期常见的系统性血管炎性疾病，临床表现可累及皮肤、胃肠道、关节，肾脏等多个系统，肾脏受累的严重程度往往直接影响到本病的病程和预后。迄今其病因及发病机制尚未完全阐明。目前认为，感染为主要的发病诱因，发病机制主要为免疫功能紊乱，体液免疫异常表现为B细胞异常活化，导致大量免疫球蛋白增加，尤其是lgA的作用可能在HSP的发病过程中发挥了重要作用；细胞免疫异常主要表现有ThlTh2免疫应答失衡(即Thl功能降低，Th2优势活化)，Th2类细胞因子中的IL一4、IL5及IL6明显增高，而Thl类细胞因子IL2及IFN一丫分泌减少。此PbT细胞功能改变、细胞因子和炎症介质、易感基因等因素在其发病中也起着重要作用。Toll样受体(Toll1ike receptor，TLRs)蛋白家族是一种I型跨膜蛋白，通过识别病原微生物上的病原模式相关分子，激活细胞内的信号传导机制，最终产生一系列炎症细胞因子释放和启动适应性免疫应答，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁【1】oTLRs主要表达在单核巨噬细胞、中性粒细胞、村突状细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞表面。根据TLRs的配体来源不同，我们将其分为外源性配体及内源性配体，外源性配体主要为病原微生物的共有成分，如细菌的脂多糖、脂蛋白、肽聚糖及核酸等；内源性的配体主要为宿主凋亡细胞或其裂解产物，如热休克蛋白、细胞外基质及细胞降解的成分等。不同的TLRs识别不同的配体：TLR2主要识别细菌的脂蛋白；TLR3主要识别病毒RNA和人工合成RNA；TLR4可以识别细菌脂多糖、多种热休克蛋白、纤维蛋白原、肝素等12】。TLRs的信号途径分泌的细胞因子一方面可以介导炎症反应，使多种炎症细胞因子、趋化因子等表达上调，诱导或加重异常炎症反应，另一方面可以促使T细胞的分化及成熟。有研究发现TLRs可以调节Thl、Th2型免疫应答，不同的TLRs表型、不同的TLRs的配体以及树突状细胞表面共刺激分子的差异，均可使Th细胞向不同的方向分化。Fabio Re研究显示TLR2活化可以诱导Th2细胞的分化，TLR4途径可能与Thl细胞的分化有关3“J。近年研究发现15ITLRs细胞信号转导在自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、川崎病等)、炎症反应、超敏反应、细胞凋亡及移植排斥反应等疾病中有着非常重要的作用，TLRs信号通路还介导多种感染性和非感染性肾脏疾病，如尿路感染、病毒性相关性肾炎、IgA肾病、新月体性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、微小病变性肾病等51。1青岛大学硕士学位论文但TLRs在HSP及HSPN的发病机制中的作用鲜有报道。本研究的目的为，通过检澳,OHSP患儿外周血单核细胞TLR2基因及蛋白表达和HSP患儿血浆中IL-4、IFN-7水平以及IFN一3IL4比值，以观察HSP病)I,TLR2表达与辅助性T细胞亚群的功能之间的相关性，为进一步研究儿童HSP的发病机制及为HSP的治疗提供新思路。2第一章材料与方法第一章材料与方法11主要器材(1)SW-CJ1F型净化工作台(苏州净化设备厂)(2)LD52A型低速离心机(北京医用离心机厂)(3)925型超低温冰箱(最低达80)(美国Forma Scientific公司)(4)移液器(法国Eppendorf公司)(5)凝胶成像仪(北京赛智创业科技有限公司)(6)电泳仪及电泳槽(Power Supply PAC300 B10一RAD)(7)振荡器 (XHDVORTEX MIXER)(8)K5600超微量紫外分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司)(9)低温合式高速冷冻离心机(Neofuge 13R型上海力申科学仪器有限公司)(10)逆转录PCR机(杭州博日有限公司)(11)梯度PCR仪(杭州博日有限公司)(12)Cytomics FC500型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)(13)微量离心机(SIGMA 113型)(Sigma公司)(14)制冰机(AFIO型)(Scotsman公司)(15)微量电子天平(BP3100S和BP21 Id型)(Sartorius公司)(16)立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)(17)550型酶标仪(BIORAD公司)f18)1575型洗板机(BIOm如公司)12主要试剂(1)RPMI1640培养液(北京索莱宝生物技术有限公司)(2)人淋巴细胞分离液(北京索莱宝生物技术有限公司)(3)RNAiso Plus(大连宝生物有限公司)(4)RNAiso Reagent总RNA提取试剂：75乙醇；三氯甲烷； 异丙醇； 超纯水；(5)琼脂糖(Agarose)；loading buffer缓冲液：6X溴酚兰：50500bp Marker；Gelred(EB)；荧光定量反转录试剂盒(DRR037A)；两步法嵌合荧光RTPCR试剂盒，(大连宝生生物公司)(6)Tip头：10ul、200ul、1000ul(美亘Axygen公司)(7)15ml Ep管、200ulPCR反应管(美雪Axygen公司)(9)磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffered saline，PBS)(ebioscience公司)(10)PE标记的抗人TLR4抗体及其同型对照PE标记的Mouse IgG2a，K Isotype。3青岛大学硕士学位论文FITC标记的抗人CDl4抗体(ebioscience公司)(11)IFNv、IL4 ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)13引物：根据Genebank中人的TLR2、GAPDH序列，选定目标片段，并由此设计合成引物(上海生工生物工程技术