转基因产品检测.ppt

,转基因产品检测培训,交流的主要内容,全球转基因农作物种植情况国际、国内转基因生物安全管理转基因产品检测技术核酸DNA提取SGSGMO检测报告解读,全球转基因农作物种植情况,1996-2011年全球转基因作物增长趋势,1.48亿公顷，占全球农作物种植面积的10%,主要转基因作物种植情况,大豆玉米棉花油菜,主要转基因农作物种植比例,常规作物转基因作物,转基因农作的主要性状,转基因农作物种植分布,2010年全球转基因植物面积达到1.48亿公顷,涉及24种作物184个品系，种植国家有29个，发达国家占10个。共有59个国家批准转基因作物的种植和进口，包括美国、日本、加拿大、墨西哥、澳大利亚、南非、欧盟、中国等。玉米最多有60个品系批准应用，其次是棉花（35）、油菜（15）、大豆（14）。,国际、国内转基因生物安全管理,国际组织对转基因生物安全管理,国际食品法典委员会（CAC）联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）于1963年联合创立的，其职责在于保护消费者健康，保证开展公正的食品贸易和协调所有食品标准的制定工作。最早提出应用风险分析原则进行食品安全管理。165个成员国。1999年食品法典委员会建立了政府间特设生物技术食品工作组,在转基因领域制定风险分析原则和指南2000年发布了关于转基因植物性食物的健康安全性问题的文件，运用“实质等同性”概念建立有效的安全性评估框架。,并于2003年7月1日，在罗马召开的联合国食品标准署会议上，国际食品法典委员会通过了三项有关生物技术食品的原则和准则，即“现代生物技术食品风险分析原则”（CAC/GL44-2003）“重组DNA植物食品安全评估准则”（CAC/GL45-2003）“重组DNA微生物食品安全评估准则”（CAC/GL46-2003）食品法典委员会设立了食品标签法规委员会(TheCodexCommitteeonFoodLabelling，CCFL)2006年CCFL第34届会议上通过建议一个实体工作组（physicalWorkingGroup）讨论转基因食品标识的主要问题,国际食品法典委员会（CAC）,经济合作与发展组织（OECD）经济合作与发展组织，简称经合组织（OECD），是由34个市场经济国家组成的政府间国际经济组织，旨在共同应对全球化带来的经济、社会和政府治理等方面的挑战，并把握全球化带来的机遇。1986年，蓝皮书重组DNA安全性考虑转基因生物总体指南1992年，生物技术安全性考虑1992明确生物安全的概念和原则1992年，生物技术作物田间试验安全考虑确定分阶段原则和个案原则1993年，现代生物技术加工食品风险评估概念和原理实质等同原则，现在有67个国家把这一原则作为转基因食品安全评估的基本原则。1995年以来，风险评估信息共享，已出版65个生物安全共识文件,/topic/0,3699,en_2649_34385_1_1_1_1_37401,00.htm,国际标准化组织(InternationalOrganizationforStandardization,ISO)是一个全球性的非政府组织，1946年成立于瑞士日内瓦,负责制定在世界范围内通用的国际标准,ISO现有117个成员，包括117个国家和地区。ISO转基因食品检测标准技术委员会（ISOTC34/SC16），主管转基因食品国际标准的制修订工作。技术委员会负责起草国际标准，通过一致的标准来消除现存的贸易壁垒，推进国际商品和服务的交流。目前为止，ISO制订6个转基因生物产品检测标准。,转基因产品成分检测ISO标准,一般性原则和要求,蛋白检测,采样,核酸检测,核酸提取,定性PCR检测,定量PCR检测,核酸检测方法增补原则,ISO24276:2006，Generalrequirementsanddefinitions,ISO21571:2005Nucleicacidextraction,ISO21570:2005Quantitativenucleicacidbasedmethods,ISO21572:2004Proteinbasedmethod,ISO/TS21098:2005InformationtobesuppliedandprocedurefortheadditionofmethodstoISO21569,ISO21570orISO21571,prENISO21568:2005Sampling,21569:2005Qualitativenucleicacidbasedmethods,发达国家转基因生物安全管理规定,各国均以风险分析为基础，理念、内容、方法无明显差异，不同的战略选择和政策导向形成不同的管理模式美国模式，以产品为基础，风险分析中应用“可靠科学原则”只要在科学上无法证明它有危险性，就不应该限制欧盟模式，以过程为基础，风险分析中应用预防原则只要不能否定其危险性，就应该限制日本模式，以过程为基础，风险分析中应用“可靠科学”,美、欧、日等，重视转基因生物的安全管理，通过立法和技术指南规范研发和应用行为,欧盟转基因生物安全管理,法律体系分为指令Directive和法规Regulation两个层次，颁布的法令在各国采纳后对采纳的国家有效，颁布的法规则直接有效。按照预防原则对转基因生物进行单独立法管理欧洲食品安全局负责风险评价，负责GMOs的审批和市场投放,实施从农田到餐桌的的各环节进行监控，保证转基因产品的可追溯性,指令2001/18/EC转基因生物有意环境释放规范任何可能导致转基因生物与环境接触行为法规1829/2003/EC转基因食品和饲料管理条例转基因食品审批和执行制度法规1830/2003/EC转基因生物追溯性及标识办法以及含转基因生物成分的食品及饲料产品的追溯性管理条例转基因食品追踪和标识制度,欧盟法规,美国转基因生物安全管理,1976年，国家卫生研究院（NIH）重组DNA分子研究指南全球首个转基因技术安全管理法规全球首个转基因技术安全管理法规，对重组DNA研究项目的进行审查、评价和监控1986年颁布了生物技术法规协调框架将基因工程工作纳入现有法规进行管理，由农业部、环保署和食品药品管理局在现有的法规框架下协调管理转基因生物。,农业部（USDA），管理目的是确保转基因生物（GMOs）的安全种植。有两个机构涉及该项工作，即：动植物检疫局（APHIS）和食品安全及检查局（FSIS）。环保署（EPA），负责管理转基因生物的环境释放。依照联邦杀虫剂、杀菌剂、杀鼠剂法、联邦食品、药物和化妆品法对杀虫剂（包括植物杀虫剂，即转抗虫、抗病基因产生的蛋白质）进行管理。具体负责杀虫剂对农业的影响和确定或免除杀虫剂在食品中最高残留量的管理。食品与药物管理局（FDA），依照联邦食品、药物和化妆品法，负责食品和食品添加剂的安全管理，确保所转基因生产的蛋白质对人类健康的安全。-负责食品标识管理。,美国管理部门,日本转基因生物管理、法规,日本在1979年制定了重组DNA实验管理条例，开始生物技术的安全管理。所涉及的部门主要是科学技术厅、通产省、农林水产省和厚生劳动省。科学技术厅：依照重组DNA实验准则，规范实验室和封闭温室的研究，负责审批试验阶段的重组DNA研究。厚生劳动省（MHLW)：依照重组DNA准则，负责对重组DNA技术生产药品和食品的管理-食用安全。通产省（MITI)。：依照遗传工程体工业化准则，对将重组DNA技术的成果应用于工业化活动进行管理-饲料安全。农林水产省（MAFF）：依照农、林、渔及食品工业应用重组DNA准则负责管理GMO在农业、林业、渔业和食品工业中应用-环境、饲料安全。MAFF和MHLW分别颁布了食品标识体系，规范转基因食品标识标准。,中国法律法规和制度要求,特点：与国际组织及多数国家的理念、要求、做法一致,中国生物安全网，,2001年，国务院农业转基因生物安全管理条例2002年，农业部农业转基因生物安全评价办法2002年，农业转基因生物进口管理办法2002年，农业转基因生物标识管理办法2006年，农业转基因生物加工审批办法2004年，质检总局进出境转基因产品检验检疫管理办法一个条例，5个办法规范了农业转基因生物安全评价、进口安全管理、标识管理、加工审批、产品进出境检验检疫工作，形成了一整套适合我国国情并与国际接轨的法律法规、技术规程和管理体系。,我国的法律法规制度,国务院部际联席会议，由农业、科技、环境保护、卫生、外经贸、检验检疫等有关部门负责人组成。农业部农业转基因生物安全领导小组农业部科技教育司（农业部农业转基因生物安全领导小组办公室）国家农业转基因生物安全委员会及其秘书处,管理机构,农业部科技发展中心（农业部农业转基因生物安全监管中心、农业部植物新品种测试中心），承办国家生物安全专家委员会秘书处的日常联络工作，是全国转基因标准化技术委员会秘书处挂靠单位，全国转基因检测体系和机构能力建设、检测监测-农业部转基因生物安全监督检验测试中心等。,基因安全管理处，负责生物安全评价等具体技术工作，承办两个秘书处及生物安全网的具体事务。农业转基因生物安全检定处，负责转基因检测体系及机构能力建设、检测标准、全国性监测的具体技术工作。,技术支撑机构,技术标准,转基因产品检测技术,全球主要国家转基因产品标识管理情况,如何进行转基因产品的检测？,染色体水平,转录组水平,蛋白组水平,代谢组水平,GMNon-GM？,转基因产品检测一般流程,基于蛋白的转基因检测方法,1.酶联免疫吸附法（ELISA）,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。最常见的检测方法是夹心法,将样品提取液加入包被有目标蛋白抗体的微孔板中，转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被检测样品中的外源蛋白结合。,加入用酶（辣根过氧化物酶）标记的目标蛋白抗体，抗原抗体产生特异性结合。,洗涤以后，加入底物显色。辣根过氧化物酶催化底物成有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量分析。,ELISA检测基本原理,标记有蛋白抗体的酶标板,根据转基因标准物质绘制的标准曲线,根据外源蛋白标准绘制的标准曲线,根据抗原抗体特异性结合的原理工作。,2、侧向流动型免疫试纸条方法,快速检测试纸条法应用了双抗体夹心法，首先将CP4EPSPS蛋白特异的抗体，偶连于显色试剂，并参入试纸条。当试纸条被插入含有CP4EPSPS蛋白的植物组织的小量萃取物时，偶连抗体与蛋白之间就发生了结合，与偶连于显色试剂上的某些但不是全部抗体形成夹心物。膜片含有两个捕获区，一个捕获区可捕获结合的CP4EPSPS蛋白，另一个捕获区可捕获显色试剂。当夹心物和未反应的显色试剂被膜片上的特定区捕获时，这些捕获区就显现出红色。若膜片上仅存在一条红色对照线，便说明受检样品为阴性样品，若存在两条线，便说明受检样品为阳性样品。,蛋白检测试剂盒,蛋白检测特点,ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速、费用低等特点，但易出现本底过高的问题，且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，510分钟就可得出结果，不需要特殊仪器和熟练技能。但一种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。,基于核酸的转基因检测方法,检测主要依据是目的DNA链与特定的生物大分子结合或者与特异序列的杂交目的DNA主要由具有特定功能的基因及其相应的调控元件组成。,核酸检测方法策略,启动子,基因,内含子,终止子,筛选检测,基因特异性检测,构建特异性检测,转化体特异性检测,低,植物基因组,高,ArneHAetal.,EuroFoodResTech,2007,植物基因组,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA,DNA模板,+引物,+三磷酸脱氧核苷酸,+TaqDNA聚合酶,+PCR反应缓冲液（盐离子）,定性PCR检测方法原理,November8th2004,DEA/DESBioinformatics2004,42,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA,Step1:变性,94C,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA,Step2:退火,T依赖于引物,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA,Step3:延伸,72C,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA,DNA量加倍,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA,定性PCR产物电泳检测,DNA分子量大小对照,检测产物,定性PCR检测关键因子,引物,设计PCR引物时使用辅助软件既可节省时间，也能避免犯错误。如Oligo、PrimerExpress、PrimerPrimier5.0、VectorNTIsuite9和PrimerSelect(DNASTARINC)等专业的引物设计软件。,引物的碱基组成、长度及靶序列的特异性是决定PCR成败的关键。,引物是指DNA聚合酶启动DNA合成时必需的一段寡核苷酸，是PCR特异性反应的关键因素，PCR反应产物的特异性是由一对上下游引物所决定的。,dNTPs是PCR反应过程中DNA合成的原材料。一般反应中每种dNTP的终浓度为20200mol/L。,三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）,dNTP浓度过高，碱基的错误掺入率增加，低浓度的dNTP可提高特异扩增的精确性。,反应体系中4种dNTPs的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。,TaqDNA聚合酶最早是从一种嗜热水生菌ThermusaquaticusYT-1菌株中分离纯化获得的，后来在嗜热脂肪芽孢杆菌及其它几种耐热菌中也分离提纯到此类DNA聚合酶。,TaqDNA聚合酶,酶量过多会使非特异性扩增产物增加，过少则使产量降低。,反应缓冲液,反应缓冲液一般含有1050mmol/LTrisCl，50mmol/LKCl和适当浓度Mg2+(一般为1.5mmol/LMgCl2)。,Mg2+浓度既影响酶的活性和真实性，又影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体形成等，因此，合适的Mg2+浓度是PCR的关键。,必要时在反应缓冲液中还可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100g/ml的牛血清蛋白（BSA），以稳定Taq酶的活性。,50mmol/L的KCl有利于引物退火，高于75mmol/L时PCR反应明显受到抑制。,转基因产品定性PCR检测方法关键,方法特异性,9种转基因玉米检测方法的特异性示意图(A)：GA21玉米；(B)：NK603玉米；(C)：BT176玉米；(D)：CBH351玉米；(E)：MON863玉米；(F)：TC1507玉米；(G)：T25玉米；(H)：BT11玉米；(I)：MON810玉米；(J)：玉米内标准基因zSSIIb基因。泳道114分别是：空白对照、GA21玉米、NK603玉米、BT176玉米、CBH351玉米、MON863玉米、TC1507玉米、T25玉米、BT11玉米、MON810玉米、非转基因玉米、转基因大豆GTS40-3-2、转基因油菜RT73和转基因MON531棉花；泳道M为DL2000DNA分子量Marker.,方法检测极限（LOD）,相对LOD值，指的是能够检测到的最低转基因植物产品的含量，一般是以“xx%”表示的；以一系列不同转基因含量的标准DNA样品为PCR扩增模板，经过至少三次重复后，确定可以获得PCR扩增到的DNA样品的最低转基因含量为相对LOD值。,绝对LOD值，指的是能够检测的最低转基因植物DNA的质量，一般是以“xxpg”或“xx拷贝”表示的。以纯的基因组DNA为标准样品，以不同浓度梯度DNA样品为PCR模板扩增，经过至少三次重复后，确定可以获得PCR扩增到的DNA样品的最低DNA质量为绝对LOD值。,已有转基因产品定性PCR检测方法,基因特异性：epsps、cry1Ab、Pat、bar、Gox、cry9C、NptII等,筛选特异性：CaMV35s启动子、NOS启动子和终止子、FMV35s等,构建特异性：主要的转基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系,转化体特异性：主要的转基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系,上述方法LOD都达到0.1，且很多已经标准化成为ISO和我国国家标准！,荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,定量PCR检测方法,荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。,闭管反应(lowcontaminationrisk)无需PCR后操作(nogels,filmsetc)自动化高通量单一反应管检测可以同时分析多个反应管,定量PCR检测方法特点,荧光域值（threshold）以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.,荧光信号,PCR循环,real-timePCRamplificationplots(7x10-folddilns.+NTC),Ct值循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；Ct值取决于阈值；Ct值与模板DNA的起始拷贝成反比，与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系；,两个重要概念,定量PCR检测方法,实时荧光定量PCR方法,绝对定量法，测样品中的转指的是利用定量PCR反应及其构建的标准曲线，获得检基因植物基因组或外源目的基因的质量或拷贝数。,转基因产品的定量PCR检测，主要可以分为两种方法：一种是绝对定量法，另一种是相对定量法。,相对定量法，是指利用定量PCR反应和构建的标准曲线，分析获得检测样品中转基因植物基因组或外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量，结果可以用转基因基因组DNA和样品基因组DNA的质量比或者转基因植物和样品的质量比表示。,108,106,102,104,绝对定量法,外源基因标准曲线,内标准基因标准曲线,获得的是样品中的植物基因组DNA或外源目的基因的绝对质量或拷贝数。,绝对定量法,相对定量法,内标准基因,外源基因,CT(CT=参照基因的CT转基因的CT值）VS转基因含量之间的标准曲线,定量PCR方法的关键参数,特异性Specificity灵敏度Sensitivity准确度Accuracy重复性Repeatability重演性Reproducibility,特异性与灵敏度,只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号!需要测试不同植物品种需要测试不同的转基因植物足够低的检测灵敏度，满足转基因标识的要求检测极限（LOD）定量极限（LOQ）,定量PCR方法可接受和应用基本要求,荧光染料：SYBRGreenI、EvaGreen,引物特异性探针：Amplifluor(Intergen)Scorpions探针通用模板探针（AUDP,UT）LUX（LightUponExtension）探针,序列特异性探针：荧光能量共振转移探针（FRET)双标探针（TaqMan、TaqManMGB、LNA、Allglo）分子信标（MolecularBeacons，MB),实时荧光定量PCR荧光探针类型和基本原理,SYBR-GreenI原理,荧光染料法,优点：（1）高度的通用性，几乎可以用于任何型号的定量PCR仪和任何目标DNA序列的扩增。（2）无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低。（3）PCR反应后可以进行融解曲线分析，分析反应的特异性和目标序列的突变等。,缺点：（1）不具备目标序列特异性，不能用于MultiplexPCR反应，容易受污染物，非特异性扩增产物和引物二聚体的干扰。（2）定量的准确性不高，重复性不强。（3）高浓度的染料会抑制PCR反应。,Oligo1:Fluorescein,Oligo2:LCRed640,荧光共振能量转移探针（FRETProbe）,序列特异型探针,优点：（1）为杂交型探针，自身不被降解，其荧光信号是可逆的，PCR反应后可以进行融解曲线分析，突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。（2）包含两条探针，具备很高的目标序列特异性，不受引物二聚体和非特异扩增的影响。缺点：由于需要合成两条探针，探针的末端要封闭以避免延伸反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。,双标记探针（TaqManProbe）,优点：（1）具备目标序列特异性，良好的稳定性和灵敏度。（2）有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测MultiplexPCR，降低成本也提高效率和准确性。（3）探针自身对PCR反应的影响较小，定量的准确性高。,TaqMan是应用最广泛，最成熟的荧光定量技术，广泛的应用于人类传染病诊断、动物疾病检测以及转基因作物定量检测等。,缺点：（1）探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高。(2)探针较长使得两端基团距离较远，导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，本底信号偏高，信噪比不高。（3）其为水解型探针，反应中探针会水解，荧光信号不可逆，不能用于融解曲线分析。,TaqManMGB,针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针,即TaqManMGB，其工作原理与TaqMan探针相同。,TaqManMGB优点,（1）3端采用了非荧光性的淬灭基因。（2）MGB探针的3端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值，提高探针的特异性。（3）探针可以设计得更短，荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。（4）MGB探针对于等位基因的区分比较理想，可以检测单碱基突变。现在它也是转基因作物定量检测中的一种常用的定量技术。,X,分子信标（MolecularBeaconProbe）,序列特异型探针,缺点:(1)杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。(2)探针合成时标记较复杂。分子信标是转基因定量检测的常用的技术，它还可以用于突变检测，SNP检测，在其基础上发展的技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等。,目前常用的序列特异性探针比较,完成验证方法44个，正在进行中31个！,2.3.1Amplifluor,引物特异性探针,优点：1它是引物特异性探针，不需要引