茶褐素的提取纯化与生理功效研究进展.pdf

第 6 卷 第 4 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 6 No. 4 2015 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr. , 2015 基金项目: 农业技术试验示范项目 (A8289)、中国农业科学院科技创新工程创新团队项目(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS) Fund: Supported by the Demonstration Project of Agricultural Technology of Ministry of Agriculture (A8289) and the Key Innovation Team of Science 2. 中国农业科学院研究生院, 北京 100081) 摘摘 要要: 茶褐素作为黑茶中重要的功能成分, 是一类溶于水而不溶于乙酸乙酯和正丁醇等有机试剂的褐色高 聚物, 属于多酚类物质, 具有酚类物质特性。茶褐素具有显著的降脂减肥功效, 但是茶褐素结构和组成复杂, 导致对其提取纯化和功效研究还不够深入。本文综述了近几年茶褐素的试剂提取、微波和超声波辅助提取、 膜分离和柱层析等提取纯化研究, 以及茶褐素在降脂减肥、抗氧化、抗癌、抗疲劳、调节体内微量元素含量等 功效的研究现状。比较了几种分离纯化方式的优缺点, 展望了茶褐素组成的研究方法、其他功效的研究方向和 相关产品、保健品的开发, 为茶褐素的深入研究提供了参考。 关键词关键词: 茶褐素; 提取; 纯化; 功效 Advances in extraction and purification technology and physiological efficacy of theabrownine WANG Wei-Wei1, JIANG He-Yuan1*, ZHANG Jian-Yong1, YU Lu-Ting1, 2, YANG Liu-Yan1, 2 (1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tea Plants Biology and Resources Utilization of Agriculture Ministry, Key Laboratory of Tea Processing Engineering of Zhejiang Province, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) ABSTRACT: As a vital functional component in dark tea, theabrownine (TBs) has significant anti-hyperlipidemia and anti-obesity effects, which was soluble in water and insoluble in ethyl acetate and n-butyl alcohol and other organic reagents. However, it has the complex structure and unclear definition that lead to the deficient study of TBs on the extraction and purification technology and bioactivities. This paper reviewed the extraction and purification technology in recent years, including the solvent extraction, microwave and ultrasonic assisted extraction, membrane isolation and column chromatography, etc. In addition, the efficacy of TBs was investigated, including anti-hyperlipidemia, anti-obesity, anti-oxidation, anti-cancer, anti-tired, and adjust micronutrient levels in body, etc. This paper made a comparison about the extraction and purification technology on relative merits, and looked ahead at the research method on TBs structure, research direction on other efficacy and development of TBs products and health products, which would promote the further study and utilization of TBs. 1188 食品安全质量检测学报 第 6 卷 KEY WORDS: theabrownine; extraction; purification; efficacy 1 引 言 茶褐素是一类溶于水而不溶于乙酸乙酯和正丁醇等 有机试剂的褐色高聚物, 属于多酚类物质, 具有酚类物质 特性, 包括多酚类化合物氧化聚合及其与生物碱、 蛋白质、 糖类、氨基酸、咖啡因等结合的产物, 含有羟基、羧基、 烷基和苯环类似物, 具有较强的耐氧化性, 在酸、 碱、 热条 件下不稳定1-4。普洱茶中大部分茶褐素的分子量大于 25000 Da5。 近年来, 由于普洱茶降三高、 减肥等功效显著, 引起了人们对茶褐素的广泛关注, 研究表明茶褐素具有抗 氧化、抗肿瘤、降脂减肥等功效, 被誉为普洱茶中的黄金, 茶褐素含量与黑茶的品质呈显著的正相关, 加工过程中随 着黑茶渥堆时间的延长逐渐积累6,7。 茶褐素的提取纯化研 究目前仅停留在试剂提取、膜分离、超声波和微波辅助提 取、柱层析等阶段。由于茶褐素结构复杂, 其分离纯化和 功效尚处于初步探索中, 本文对茶褐素的提取纯化与生理 功效研究进展进行了综述, 为今后茶褐素的深入研究提供 参考。 2 茶褐素的提取与纯化 2.1 试剂提取 由于茶褐素溶于水而不溶于乙酸乙酯、正丁醇、三氯 甲烷等, 现有茶褐素的提取方法, 通常是水提取结合有机 试剂萃取除去杂质得到的。樊蓉8将茶汤经正丁醇萃取 3 min 后的水层真空浓缩干燥即得到茶褐素粗提取物, 李连 喜9在此基础上采用氯仿脱咖啡碱、乙酸乙酯除茶黄素和 茶红素后浓缩干燥, 得到的茶褐素纯度更高。 秦谊、 何英姿和易恋等10-12通过正交实验对六堡茶和 普洱茶茶褐素提取工艺中的料液比、提取温度和时间及提 取次数进行了优化, 秦谊优化后的工艺为料液比 1:10, 提 取温度 83 、时间 20 min, 提取 3 次, 该条件下产率可达 到 16.86%; 何英姿优化后的工艺为料液比 1:30, 提取温度 100 、时间 80 min, 提取 4 次, 该条件下产率可达到 22.92%; 易恋优化后的工艺为料液比 1:25, 提取温度 100 、时间 60 min,该研究以提取率为评价指标, 在优化 条件下提取率可达到 93.15%。与秦谊相比, 何英姿采用了 高料液比、高温、长时间和多提取次数, 在提取效率上低 于秦谊, 但是也得到了较高的茶褐素产率。 徐甜13研究了萃取温度对四川边茶茶褐素纯化的影 响, 设定提取条件为料液比 1:50.751:43.58, 提取温度 65.69 77.88 时, 对萃取条件进行了优化, 得到萃取 温度 13.65 17.48 时茶褐素的得率较高。 贺国文14以益阳茯砖茶为原料, 采用索氏提取法得 到粗茶褐素, 再使用乙酸乙酯、 正丁醇各萃取 3 次后, 增加 了 sevage 法除蛋白的处理, 该处理可以除去与茶褐素结合 紧密的蛋白质(占粗茶褐素的 42.2%)。 2.2 微波和超声波辅助提取 微波是频率在 0.3 GHz300 GHz 的电磁波, 具有波粒 二象性, 可用于水和食物的加热, 超声波是频率高于 20000 Hz 的声波, 具有方向性好、穿透力强和易于集中声 能的特点。微波和超声波作为辅助条件在茶叶(茶多酚等) 及其他植物功能成分的提取中已有广泛的应用, 并取得了 显著效果15,16。 关于微波和超声波在茶褐素提取中的应用, 张水花17 采用微波辅助提取普洱茶中的茶褐素, 证实了微波辅助提 取效果显著, 采用正交实验对提取工艺进行优化, 得到料 液比 1:15、 提取时间 10 min, 微波功率 320 W, 提取 2 次的 优化条件, 产率达到 16.83%。陈丽如18采用超声波辅助提 取法提取红茶中的茶色素, 该方法操作简单, 提取效率提 高, 优化提取条件为料液比 1:20, 时间 30 min, 温度 60 , 提取 3 次。微波和超声波辅助应用于茶褐素的提取中, 缩 短了提取时间和提取次数, 提高了提取效率, 是茶褐素提 取工艺中理想的辅助手段。 2.3 膜分离 膜分离技术是以半透膜为障碍层, 通过膜两侧的能 量差让某种组分透过而保留其他组分, 从而达到分离目 的。膜技术同时具有分离、浓缩、纯化和精制的功能。 膜分离技术在茶褐素分离纯化中的应用也有报道。 张 钦19以普洱茶为原料, 通过试剂提取后, 对提取的茶褐素 进行膜分离, 发现茶褐素透析样中分子量大于 100 kDa 的 占 76.87%, 小于 3500 Da 的占 17.03%, 鉴定分离出的两个 主要部分, 均属于酚类物质, 分子量大于 100 kDa 的部分 含有酸性基团、羧基、酚羟基、茶多酚和多糖等成分, 且 含量均高于 3500 Da 部分。赵书青20以青砖茶为原料, 水 提后过 0.45 m 微滤膜, 再用 100、50、30、10 和 5 kDa 等超滤膜过滤, 得到 50、10 和 5 kDa 截留液中能有效富集 茶褐素。对这两个茶褐素膜分离实验进行对比分析, 可以 看出, 茶褐素的组分较为复杂, 且不同原料提取得到的茶 褐素在分子量上也有较大差异。 2.4 柱层析 柱层析技术是一种根据样品混合物中各组分在固定 相和流动相中的分配系数不同, 多次反复分配将组分分离 开来的技术。 柱层析技术在儿茶素和茶黄素单体的分离纯化上已 有研究和应用, 且能分离得到纯度较高的单体21,22, 但在 第 4 期 王伟伟, 等: 茶褐素的提取纯化与生理功效研究进展 1189 茶褐素分离中的应用则较晚。竹尾忠一等23使用葡聚糖凝 胶 LH-20 柱从红茶中分离出褐色物质、 茶红素和茶黄素等, 该褐色聚合物即是茶褐素。杨新河等24使用葡聚糖凝胶 LH-20 柱对普洱茶水提物经试剂纯化后的水层色素(即茶 褐素)进行分级, 实验结果显示, 以 40%丙酮为洗脱剂时茶 褐素的分离效果最好, 柱子中出现了 6 条明显的分离条带, 获得了 6 组分子量大小不同的组分, 并证实了这 6 组聚合 物在色差、还原力、pH 值、光谱扫描等方面存在的差异。 杨大鹏25选取硅胶粉为填料, 以不同浓度的甲醇溶液为洗 脱剂, 对茶褐素提取物进行分级处理, 其中 60%甲醇浸出 的茶褐素含量和吸光值高于其他处理, 约占总量的 50%。 迄今为止, 柱层析法分离茶褐素仅得到分子量或极性相近 的几类混合物, 这些化合物的组成仍不清晰, 有待进一步 深入研究。 2.5 其他制备方法 房贤坤等26的研究首先筛选了一株霉菌 fxk-01, 将该 霉菌接种到普洱生茶上, 在 35 条件下培养 8 d, 得到的 普洱茶茶褐素比发酵前提高了 8.23 倍, 以发酵后的普洱茶 为原料进行水提取, 乙酸乙酯、 氯仿和正丁醇纯化, 得到的 茶褐素提取物质量分数为 826.4 mg/g。 几种分离纯化方法相比, 试剂提取方法的分离效果 好、 成本低, 是目前主要的提取纯化方法, 但是去除试剂时 较为困难, 容易在提取物中形成残留。膜分离方法的目标 性强、 操作简单, 但是成本高, 膜材料容易堵塞。 柱层析技 术能得到纯度较高的茶褐素, 但是色谱柱制备复杂, 提取 量小, 较难实现工业化。 各方法均有优缺点, 可根据不同的 目的, 采用不同的提取纯化方法。 3 茶褐素的生理功效 作为普洱茶中一类重要的营养成分, 茶褐素具有降 脂减肥、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、提高免疫力等功 效8, 因而与茶褐素相关的保健食品与固体饮料也得到了 推崇。 3.1 降脂减肥 肥胖是体内脂肪(尤其是甘油三酯)堆积过多而导致超 重的一种状态, 常会引起多种并发症, 加速衰老和死亡。 脂 肪酸合成酶(FAS)是体内合成脂肪酸以及能量代谢的重要 酶, 它可以催化长链脂肪酸的合成, 与肥胖的形成有紧密 关系。Huang 等27研究采用普洱茶、绿茶和红茶提取物激 活高脂大鼠体内对AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)来抑制高 血脂和脂肪酸合酶的活性, 结果发现普洱茶抑制效果优于 其他茶类。陈智雄28进一步深入研究, 发现四川边茶的茶 褐素提取物也能抑制 FAS 的活性, 姜波等29比较了茶褐素 抑制 FAS活性的能力, 结果表明红茶茶褐素抑制 FAS 的半 抑制浓度(IC50)值为 7.07 g/mL, 远高于表没食子儿茶素没 食子酸脂(EGCG)的 20 g/mL。 陈婷等30通过动物实验验证了茶褐素的降脂减肥功 效, 结果表明普洱茶茶褐素能显著降低高脂大鼠的总胆固 醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-胆固醇水平, 提升高密度脂 蛋白-胆固醇水平, 减少肝脏沉积, 预防脂肪肝的形成。与 陈婷的实验结论相同, Peng31、Gong 等32采用普洱茶为原 料提取茶褐素, 应用于动物实验, 并检测了大鼠粪便中的 胆固醇和胆汁酸含量, 发现茶褐素不仅可以促进胆固醇的 转化, 还可以促进大鼠体内胆固醇的排泄。王秋萍等33以 紫娟普洱茶茶褐素饲喂小鼠, 发现茶褐素对大鼠的进食、 饮水无显著影响, 但是能显著抑制大鼠体重的增长速度, 减少脂肪肝的沉积, 预防脂肪肝的形成。郭韦韦34、熊昌 云等35也通过实验证实了茶褐素的降脂减肥功效。茶褐素 降脂减肥功效的机制不仅仅是调控 FAS 酶活性, 高斌36研 究发现, 茶褐素可以通过增强大鼠肝脏和附睾脂肪组织的 激素敏感性甘油三酯脂肪酶活性及其 mRNA 的表达来加 快血脂成分的分解, 从而达到降血脂的效果。 茶褐素的降脂减肥功效机制已在动物实验中得到验 证, 是一类天然的降脂减肥功能成分, 具有深入研究开发 终端产品的潜力, 有利于人们在生活水平日益提高的条件 下控制膳食中油脂的过多吸收。 3.2 抗氧化 氧化是肌肤衰老的最大威胁, 不健康饮食、日晒和环 境污染等均可导致肌肤自由基泛滥的氧化作用, 从而产生 肤色黯淡、缺水等症状。倪德江等37以普洱茶为原料, 对 其水提物进行乙酸乙酯和正丁醇的萃取, 研究了普洱茶茶 褐素提取物的抗氧化能力, 结果表明该提取物具有一定的 抗氧化活性, 并且抗氧化活性高于普洱茶水提物。何英姿 11以六堡茶为原料, 对其水提物经氯仿、乙酸乙酯和正丁 醇萃取后得到茶褐素提取物, 证明该提取物对羟自由基的 清除率高达 74%, 对亚硝基的清除率高达 73%, 对超氧自 由基的清除率达到 60%以上, 且清除羟自由基的能力高于 Vc。周向军38以乌龙茶为原料, 采用试剂提取法得到茶褐 素提取物, 证明其对羟自由基、 超氧阴离子自由基和 DPPH 自由基均有一定的清除效果, 并且随着提取物浓度的增大 清除率也增加, 与同类提取物相比具有明显优势。董文明 等39研究了普洱茶不同加工和贮藏条件下茶褐素提取物 的抗氧化能力, 结果表明, 发酵时间、 工艺、 贮藏年限以及 茶褐素提取物的浓度和 pH 值等均能影响其清除自由基的 效果, 茶褐素提取物随着浓度的增加, 自由基清除能力也 逐渐提高, 且发酵时第四次翻堆样清除率最高。陈玉琼等 40研究了普洱茶不同成分的抗氧化性, 得到了茶褐素具有 较强的清楚羟自由基能力。不同茶类以及不同工艺茶叶中 茶褐素提取物分子大小和结构不同, 但由于具有相似的基 团, 使得其茶褐素提取物均具有抗氧化功能。 1190 食品安全质量检测学报 第 6 卷 3.3 抗 癌 癌症是细胞生长调控机制失常引起的疾病, 癌细胞 自身生长失控, 会侵入周围正常组织甚至经体内循环转移 到身体其他部位。目前世界上尚无有效治疗癌症的药物, 所以防癌抗癌就显得尤为重要。韩驰41的研究表明, 茶色 素能诱导醌还原酶和谷胱甘肽硫转移酶的活性, 显著降低 HeLa 细胞的存活率和抑制小鼠 S180 细胞的生长, 表明茶 色素有抗肿瘤作用。茶色素的抗肿瘤机制研究显示, 茶色 素主要通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节细胞周期 和调控细胞信号转导等发生作用。茶色素还可对大鼠的乳 腺组织、呼吸道上皮细胞的肿瘤转移有较强的抑制作用, 普洱茶提取物也可以在一定程度抑制脂肪酸合成酶在肝癌 HepG2 细胞上的蛋白质和 mRNA 水平的表达42,43。 3.4 其他功效 茶褐素具有抗疲劳的功效, 龚加顺等44研究了普洱 茶茶褐素、茶多糖、蛋白质等对小鼠抗疲劳的影响, 实验 中以小鼠在 28水浴中的游泳时间为参考指标, 证实了茶 褐素等成分能显著提高小鼠的抗疲劳能力, 效果优于普洱 茶水提物, 同时验证了该提取物无毒性、无致突变作用。 茶褐素可以调节体内微量元素含量。 微量元素仅占人 体重量的 0.05%, 但与新陈代谢有重大关系, 摄入过多或 过少均会引起生理异常或疾病。周花香45研究了普洱茶茶 褐素与 Ca2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和 Mg2+五种金属离子络合 作用, 结果显示, 茶褐素具有一定的络合金属离子能力, 当 pH 值为 7.0、温度 37、反应 200 min 时络合吸附能力 最强。当茶褐素的摄入量为 0.2 g/kg bw 时, 可显著降低小 鼠体内 Ca、Mg、Fe、Zn 四种元素的含量。 茶褐素具有抑制 -淀粉酶活性的作用, 聂坤伦等46 的研究结果表明, 雅安藏茶中的儿茶素、茶褐素和咖啡碱 均能抑制 -淀粉酶的活性。 4 展 望 进入21世纪, 随着普洱茶的“升温”, 使得其主要功能 成分茶褐素也逐渐成为研究热点。现阶段, 我国对茶褐素 的提取和生物活性已有了初步的探索研究, 但是由于茶褐 素是一类混合物, 化学结构较为复杂, 组成尚未完全明确, 在较多方面还有待深入研究和开发。 (1)不同茶类, 或者同类茶中不同产地和不同加工方 式制得的茶叶, 其茶褐素提取物在组成和结构上均有较大 差异。 普洱茶茶褐素提取物经高温裂解后主要是二氧化碳, 而云南滇红红茶中茶褐素提取物经高温裂解后 48.23%是 二氧化碳, 35.39%是氮氧化合物47。通过不同膜孔径大小 截留不同分子量大小的茶色素, 有针对性地对茶褐素组分 的结构组成进行探索研究, 可能是一种较为理想和有效的 方式。 (2)黑茶(主要是普洱茶)的抗氧化、抑菌、降“三高”、 抗癌、 保肝、 抗诱变等功效都已有研究报道48-50, 但是, 这 些功效与茶褐素的直接关联性仍需要进一步深入探讨。 (3)胰岛 细胞是型糖尿病发病的重要影响因子, 型糖尿病患者胰岛 细胞的分泌能力不足, 后期胰岛 细 胞的数量大为减少, 甚至衰竭。 有研究结果表明, 茶褐素添 加量在0.04 mg/mL时胰岛细胞INS-1存活率有一定下降, 并且随着浓度的提高存活率逐渐减少51,52, 说明茶褐素对 大鼠胰岛 细胞 INS-1 有一定的毒害作用。因此, 茶褐素 的毒理学研究也显得很有必要。 (4)肥胖正是全球面临的重要难题, 而茶褐素最为显 著的功效是降脂减肥, 显然, 茶褐素在保健品及临床药品 上的应用研究迫在眉睫。 (5)作为天然的功能成分和染色剂, 茶褐素在食品和 生活用品的着色上也有一定的应用前景, 茶褐素的相关产 品也有待开发。 参考文献 1 Peng C, Liu J, Liu H, et al. 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