质粒目的基因插入及引物设计流程.ppt_第1页
质粒目的基因插入及引物设计流程.ppt_第2页
质粒目的基因插入及引物设计流程.ppt_第3页
质粒目的基因插入及引物设计流程.ppt_第4页
质粒目的基因插入及引物设计流程.ppt_第5页
已阅读5页，还剩21页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）,1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基；2.注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，则说明CDS序列稳定可用；,将查到的CDS序列粘贴至newDNAfile框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该段序列中的可能酶切位点,二.登录,同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）,1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点，否则目的基因会被切掉；2.质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：,选中目的基因序列，复制,在AflI后至BamHI前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1,在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HAtag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：/mol-bio-reference/genetic-code/,三.克隆引物设计1.电脑设计：回到NCBI的primerblast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)，在框中输入|a|和CDS序列，并在Min和Max分别输入1602（表示blastCDS全部基因）；,2.手工设计：遵循GC尽量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个，因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。,5端引物序列即为atggctgtggagtcccag，但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG最后可得Forwardprimer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag,tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct,目的基因的20个碱基,3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向,最后要把引物顺序调整过来，点击“53”既得Reverseprimer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct，同样在5端位置需再加上一段保护碱基AAATATATGGATCC最后Reverseprimer序列为AAATATATGGATCCtcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct,构建表达载体的一般流程：设计primer(如上所述，综合考虑HA，CDS序列)合成引物选择合适的样本细胞（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取mRNA并逆转录成cDNA用设计的primer扩增目的基因（UGT1A1）琼
人人文库> 全部分类> 教育资料 > 课件下载

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论