草莓致腐霉菌的鉴定及其产毒能力研究.pdf

第8 卷第5 期 2 0 1 7 年5 月 食品安全质量检测学报 J o u r n a lo fF o o dS a f e t ya n dQ u a l it y V b l 8N O 5 M a y ，2 0 1 7 草莓致腐霉菌的鉴定及其产毒能力研究 魏超1 ，扩，代晓航1 一，郭灵安1 一，雷欣宇1 ( 1 四川省农业科学院分析测试中心，成都6 1 0 0 6 6 ；2 农业部农产品质量安全风险评估实验室( 成都) ，成都6 1 0 0 6 6 ) 摘要：目的调查草莓表面主要致腐真菌，并研究其是否产生毒素。方法对草莓真菌进行分离，综合利 用菌落形态学观察、显微生殖观察、真菌I T S 序列系统发育学分析鉴定真菌；利用高效液相色谱法检测腐烂 草莓及真菌发酵液中赭曲霉毒素A ( o ch r a t o x in A ，O T A ) 的含量。结果4 种毛霉属真菌和1 种青霉属真菌可引 起草莓腐烂，经分子鉴定分别为易脆毛霉菌、卷枝毛霉菌、多枝毛霉菌、根毛霉菌和草酸青霉菌。腐烂的草 莓和毛霉发酵液检测不出O T A ，但青霉菌发酵液中检测出O A T 毒素存在。结论真菌是致草莓腐烂的主要诱 因，毛霉菌在腐烂过程中占主导地位，但产毒素的青霉菌与其共生，应加强草莓及制品的风险监测。 关键词：草莓：真菌：赭曲霉毒素A I d e n t if ica t io na n dt o x in - p r o d u cin g ca p a b il it yo fca u s in g - s p o il a g ef u n g i ins t r a w b e r r y W E IC h a 0 1 ，扩，D A IX ia o H a n 9 1 一，G U OL in g A n l 一，L E IX in Y u l ( 1 A n a l y s isa n dT e s t in gC e n t e ro f S ich u a nA ca d e m yo f A g r icu l t u r a lS cie n ce s ，C h e n g d u6 1 0 0 6 6 ，C h in a ；2 S e e u r i纱 R is k A s s e s s m e n t L a b o r a t o r yo f M in is t r yo f A g r icu l t u r e ( C h e n g d u ) ，C h e n g d u6 1 0 0 6 6 ，C h in a ) A B S T R A C T ：O b j e ct iv e T oin v e s t ig a t et h em a inca u s in g s p o il a g e f u n g i o nt h es u r f a ceo fs t r a w b e r r ie sa n da n a l y z e w h e t h e ritg e n e r a t e st o x in s M e t h o d sT h ef u n g iw e r eis o l a t e df r o ms t r a w b e r r ie s T a x o n o m ics t a t u so ff u n g iw a s co n d u ct e db yco l o n ym o r p h o l o g yo b s e r v a t io n ，r e p r o d u ct io n m icr o s co p ic o b s e r v a t io na n d I T Sg e n e s e q u e n ce p h y l o g e n e t ica n a l y s is H ig hp e r f o r m a n cel iq u idch r o m a t o g r a p h y ( H C L P ) w a su s e dt od e t e ctt h eco n t e n to fo ch r a t o x in A ( O T A ) ins p o il a g es t r a w b e r r ie sa n df u n g a lf e r m e n t a t io nb r o t h R e s u l t s F o u rk in d so fM u co ra n do n eP e n icil l iu m co u l dca u s es t r a w b e r r yd e ca y , w h ichw e r eid e n t if ie da sM u co rf r a g il is ，M u co rcir cin e l l o id e s ，M u co rr a ce m o s u s , R h iz o m u co rv a r ia b il isa n dP e n icil l iu ms p a tm o l e cu l a rl e v e l O T Aco u l dn o tb ed e t e ct e df o r ms p o il a g es t r a w b e r r ie s a n dM u co rf e r m e n t a t io nb r o t h ，b u tO A Tt o x in sw e r ed e t e ct e dinP e n icil l iu mf e r m e n t a t io nb r o t h C o n cl u s io n F u n g i a r et h em a inca u s eo fs t r a w b e r r yd e ca y , a n dM u co rs p p p l a yad o m in a t e dr o l eint h ed e ca yp r o ce s s ，b u tP e n icil l iu m w h ichca np r o d u cet o x in sco e x is tw it hit R is km o n it o r in go fs t r a w b e r r ya n dit sp r o d u ct ss h o u l db es t r e n g t h e n e d K E Y W O R D S ：s t r a w b e r r y ；f u n g i；o ch r a t o x inA 者的喜爱，但因其高含水量和含糖量在增强其食用口感同时 1 引言 也成为微生物的繁殖生长的温床 。目前对草莓等即食果蔬 草莓因其肉多汁、营养丰富、质地柔软，受到广大消费 安全评价的很多研究与管控集中在农药残留等方面，有研究 基金项目：国家农产品质量安全风险评估重大专项( G J F P 2 0 1 6 0 1 3 0 2 ) F u n d ：S u p p o S e db yt h eN a t io n a lM a j o rP r o j e ctf o rR is ko f A s s e s s m e n to f A g r icu l t u r a lP r o d u ct sQ u a l it y a n dS a f e t y ( G J F P 2 0 1 6 0 1 3 0 2 ) + 通讯作者：魏超，硕士，助理研究员，主要研究方向为微生物检测及相关风险评估E - m a il ：ccl 2 3 q q q 1 6 3 co m + C o r r e s p o n d in ga u t h o r ：W E IC h a o ，M a s t e r , R e s e a r chA s s is t a n t ，A n a l y s isa n dT e s t in gC e n t e ro fS ich u a nA ca d e m yo fA g r icu l t u r a lS cie n ce s S e cu r it yR is k A s s e s s m e n tL a b o r a t o r yo f M in is t r yo f A g r icu l t u r e ( C h e n g d u ) ，C h e n g d u6 1 0 0 6 6 ，C h in a E m a il ：ccl 2 3 q q q 1 6 3 co m 1 7 2 2 食品安全质量检测学报第8 卷 表明，草莓表面的微生物也可成为其食用安全的隐患【2 ，3 】。 果蔬表面的霉菌是其致腐的主要原因，会导致严重 的经济耗损，不仅影响其外观品质，也会损失水果中的果 胶蛋白质等营养成分，部分真菌引起的水果腐烂在人食用 后会诱发一系列的疾病【4 。6 】。果蔬表面的致腐真菌也成为果 蔬食用安全的隐患，成为果蔬食用风险评估的主要对象 【_ 7 ，8 1 。常见的致病真菌主要有葡萄孢菌属( B o t r y t in ias p p ) 、 青霉菌属( P e n icil l iu ms p p ) 、链格孢菌属口l t e r n a r ias p p ) 等 9 。赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关 注的霉菌毒素，它是由曲霉属曲霉和青霉属青霉菌产生的 污染食品的真菌毒素 1 0 , 1 1 】。 本研究在草莓表面分离5 种霉菌，用显微鉴定和 I T S ( in t e m a lt r a n s cr ib e ds p a ce r ) i贝l J 序的方法对其进行鉴定， 通过液相色谱法对其腐烂草莓和真菌发酵液产赭曲霉毒素 A ( o ch r a t o x inA ，O T A ) 进行测定，旨在为草莓食用安全及风 险评估提供科学依据。 2 材料与方法 2 1 材料 冬草莓样品2 0 份，采集时间为2 0 1 6 年1 2 月，草莓样 品来自成都2 0 个草莓基地，抽样方式为随机抽样，每份样 品抽样量3k g 。 2 2 仪器与试剂 霉菌培养及显微鉴定：孟加拉红、P D 培养基f 广东环 凯公司) ；Y M 7 5 Z 高压灭菌锅( 上海三申公司) ；M 5 0 0 培养箱( 上海齐欣) 。 霉菌分子鉴定：引物正向引物( 1 T S l ) ：5 - T C C G T A G G T G A A C C T G C G G 一3 ；反向引( I T S 4 ) ：5 一T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C 3 ；引物合成及测序( 成都擎科公司) ；D N A 提取试剂盒( 天根D P 3 3 6 公司) 。 毒素检测：免疫亲和柱( 北京中检维康公司) ；O 2 2 “m 滤膜( 津腾公司) ；乙腈、甲醇( 色谱纯，F is h e rS cie n t if ic) ； O T A 标准品( S U P E L C O 公司) ；A g il e n t1 2 0 0 液相色谱仪( 美 国安捷伦公司1 。 2 3 试验方法 2 3 1霉菌的分离培养 2 0 份草莓样品每份随机抽取2 0 0g 均质，取均质浆2 5 g 于1 0 倍生理盐水均质，均质液于1 0 1 1 0 5 稀释，取1m L 稀释液在孟加拉红培养基混茵2 8 培养7 2 1 2 0h ，P D A 培 养基纯化2 3 次，纯化单菌落7 2 9 0h 待其散孢，用针状碳 尖吸附少量孢子点于P D A 平板中心，3 0 培养7 2 9 0h 观 察菌落形态。发酵培养为P D 培养基3 0 震荡培养1 2 0h 。 2 3 2 霉菌的鉴定 f 1 ) 显微鉴定。 将盖玻片斜插入接种单菌落的边缘，2 8 培养1 2d ， 待菌丝刚好攀上盖玻片，在载玻片上滴1 滴染色剂光学显 微镜观察菌丝及生殖情况。 ( 2 ) 分子鉴定。 D N A 提取根据试剂盒使用说明书进行操作。P C R2 5 此体系：M a s t e r M ix1 2 5 此；I T S l 和I T S 4 引物各1 此、模 板D N A l 此、加d d H 2 0 至2 5 此。P C R 反应条件：预变性 9 5 ，3m in ；9 4 ，3 0S 、5 5 ，3 0S 、7 2 ，3 0S ，共进行 3 5 个循环；7 2 ，7m in 。P C R 产物进行双向测序拼接，并 提交N C B I 比对，鉴定相关结果并下载相关序列。采用 P R I M E RP R E M I E R 软件对序列整理后，采用M A G A 6 0 软 件最大简约法( m a x im u mp a r s im o n y ) 构建发育树。 2 3 30 T A 的检测 试验设计对3 份腐烂程度不同的草莓样和5 份真菌发 酵液品进行O T A 检测。草莓样品为2 0 份样品中真菌筛选 后剩余样品，常温保存2 5d 后进行检测，真菌发酵液为 分离纯化真菌在P D 培养基3 0 震荡培养1 2 0h ，4 0 0 0 r m in 离心2 m in 后取上清。 样品前处理：称取2 0g 样品于三角瓶内，加入4g N a C I ( A R ) ，再加入7 0 甲醇1 0 0m L ，震荡I 5h ，滤纸过滤， 取过滤液5m L 加入1 5m Ld d H 2 0 ，涡旋混匀后于4 0 0 0 r m in 离心1 0m in ，使用O T A 免疫亲和柱，直接过柱弃滤液， 2 0m Ld d H 2 0 清洗柱子，吹干柱子后用1m L 甲醇( 色谱纯) 洗脱，加入1m Ld d H 2 0 稀释后过滤膜上机。 仪器条件：C ，8 色谱柱；荧光检测器激发光波长 E x = 3 3 0 ，发射波长点_ = 4 7 7 ；流动相H 2 0 ：乙腈：甲酸 = 5 0 ：4 9 ：1 ( ” 功；流速1 0m L m in ；运行时间7m in ；柱温 4 0 ；进样量2 0 0 皿。 3 结果与分析 3 1 霉菌的分离与显微鉴定 草莓受真菌侵染见图l ，由图1 可以看出，草莓被浸 染部分是籽实嵌入缝隙部分，起初面积很小不易被发现， 随着菌丝生长，果肉表面逐渐塌陷表现有菌丝或无菌丝伴 随腐烂。对分离纯化霉菌菌落形态和生殖状况进行描述， 根据真菌鉴定手册 9 2 对5 种真菌鉴定结果见表1 ，鉴定 结果分别为F 一3 5 4 7 、F 3 5 5 0 、F 3 7 6 6 为毛霉科真菌，F 3 5 8 3 为毛霉科根霉属真菌，F 3 5 2 2 为青霉属真菌。 3 2 霉菌的I T S 鉴定与归类分析 对分离霉菌的I T S 测序结果与G E N EB A N K 比对，比 对结果见表2 ，同时下载亲缘相似序列建立系统发育树，从 系统发育树结果可以看出，F 一3 5 4 7 与易脆毛霉M u co r f r a g il is ) 亲缘性较高，F 3 5 5 0 与卷枝毛霉( M u co rcir cin e l l o id e s ) 亲缘性 较高，F 一3 7 6 6 与多枝毛霉( M u co rr a ce m o s u s ) 亲缘陛高，F 3 5 8 3 与根毛霉( R h iz o m u co rv a r ia b il is ) 亲缘较高，F 3 5 2 2 鉴定为青 霉属青霉。草莓中分离真菌毛霉的系统发育树见图2 ，分离 真菌青霉的系统发育树见图3 。 第5 期魏超，等：草莓致腐霉菌的鉴定及其产毒能力研究 1 7 2 3 图1草莓受真菌侵染图片 F ig 1P h o t o g r a p h so fs p o il a g es t r a w b e r r yin f e ct e db yf u n g i 表1 真菌的菌落形态及显微观察 T a b l e1 C o l o n ym o r p h o l o g ya n dm icr o s co p icid e n t if ica t io no ff u n g i O O o o K Y 0 4 7 1 4 7 1 _ M u irf r a g il is J Q 9 7 2 0 6 3 1 _ M u e o r _ f r a g il is F 3 5 4 7 L N 8 7 4 2 6 7 1 _ M u co r _ f ia g il is F 3 7 6 6 A J 2 7 1 0 6 1 1M u e o rr a ce m o s u s K X l 4 6 4 8 8 1M u co r1 - a ce m o s n $ A M 7 4 5 4 3 3 1M u e o rcir cin e l l o id e s F 3 5 5 0 D Q l 1 8 9 9 0 1M u co re ir cin e l l o id e s F J 8 7 5 1 1 9 1R h iz o m u co rv a r ia b il is J N l 0 7 7 3 8 1R h iz o m u e o rv a r ia b il is F 3 5 8 3 H M 6 2 3 3 1 4 1R h iz o m u e o rv a r ia b il is 图2 草莓中分离真菌毛霉的系统发育树 F ig 2P h y l o g e n e t ict r e eo f M u co rs p p f r o ms t r a w b e r r ie s 1 7 2 4 食品安全质量检测学报第8 卷 0 0 0 0 F 一3 5 2 2 H M 2 3 5 9 4 6 1 一P e n icil l iu m _ s p H M 4 6 9 4 1 0 1P e n icil l iu mo x a l icu m K U 5 0 4 3 0 0 1P e n icil l iu m s p K U 5 0 4 3 1 2 1P e n icil l iu m s p K U 5 5 8 9 31 1P e n icil l iu mo x a l icu m K U 5 5 8 9 3 6 1P e n icil l iu mo x a l icu m 图3 分离真菌青霉的系统发育树 F ig 3P h y l o g e n e t ict r e eo fP e n icil l iu ms p p f r o ms t r a w b e r r ie s 表2 霉菌的I T S 鉴定结果 T a b l e 2I d e n t if ica t io nr e s u l t so ff u n g ib yI T S 表3 草莓样品及真菌发酵液的O T A 检测 T a b l e 3O T Ad e t e ct io no fs t r a w b e r r ie sa n df u n g a lf e r m e n t a t io nb r o t h 注：N D 表示未检出。 3 3O T A 的检测 对腐烂程度不同的3 个草莓样品和5 种真菌发酵液进 行O T A 的检测，检测结果见表3 ，检测图谱见图4 ，O T A 的 液相色谱法检测采用单标定量，标准品含量1 0n g m L ，方 法检出限为ln g m L ，在2 3 3 色谱条件下，重复进样6 次， 精密度R S D I o ，符合检测要求【1 ”。实验结果表明，腐烂 的草莓检测不出O T A ，但分离的青霉菌F 3 5 2 2 的发酵液检 测出O T A 为2 2 2n g m L ，表明这株微生物具有产O T A 的 能力，毛霉属的4 株真菌发酵液中均检测不出O T A 。 4 结论 真菌是草莓致腐的主要原因，真菌期初侵染草莓 籽粒嵌入部分，随着菌丝的生长，果肉表面塌陷并伴 随腐烂，样品中毛霉属真菌因其生长快速成为草莓腐 烂过程中的优势株群，青霉属真菌生长较缓慢与其共 生，虽然分离的青霉属真菌具有一定的产毒能力，但 在总体侵染草莓过程中不是优势群体，且毛霉不具备 产O T A 能力，在腐烂和重度腐烂草莓样品中均检测不 到真菌毒素，真菌种群生长状况受空间温度、生长时 间、P H 影响较大，在一定条件下产毒的真菌有可能成 为优势株群，影响草莓及其制品的食用安全【1 2 。15 1 。草莓 腐烂表现明显，真菌和毒素的侵染虽没有明显表征但 可长期存在并不易去除，建议监管部门加强草莓相关 制品的安全监测。 第5 期 魏超，等：草莓致腐霉菌的鉴定及其产毒能力研究 1 7 2 5 L U 0 4 5 0 4 0 3 5 O 3 O 2 5 O 2 L U 0 2 3 2 5 O 2 3 0 2 2 7 5 0 2 2 5 0 2 2 2 5 0 2 2 O 2 1 7 5 O - 2 1 5 L U 0 3 4 O 3 3 0 3 2 O 3 1 O 3 0 2 9 0 2 8 0O 51 5 2 2 53 5 0O 5 参考文献 1 522 5 图4 草莓及真菌发酵液O T A 的液相色谱图 F ig 4 H P L Cch r o m a t o g r a m so fO T Af r o ms t r a w b e r r ie sa n df u n g a lf e r m e n t a t io nb r o t h 注：a ：标准品( s t a n d a r d ) ；b ：腐烂草莓( r o t t e ns t r a w b e r r ie s ) ；c：F 3 5 2 2 发酵液( f im g if e r m e n t a t io n ) 1 】1张宁，郜海燕，房祥军，等草莓采后腐烂真菌病害控制的研究进展 J 浙江农业科学，2 0 1 6 ，5 7 ( 3 ) ：3 9 6 - 4 0 0 Z h a n gN ，H a oH Y , F a n gX J ，e ta 1 A d v a n ce sins t r a w b e r r yp o s t h a r v e s t d e ca yf u n g id is e a s eco n t r o l J 】JZ h e j ia n gA g icS ci，2 0 1 6 ，5 7 ( 3 ) ： 3 9 6 - 4 0 0 2 】魏超，郭灵安，胡莉，等草莓表面农药残留检测及其对微生物群落影 响叫晒南农业学报，2 0 1 4 ，2 7 ( 6 ) ：2 5 3 4 - 2 5 3 8 W e iC ，G u oL A ，H uL ，e td Z P e s t icid er e s id u e sd e t e ct io no fs t r a w b e r r ie s s u r f a cea n dit se f f e ct so nm icr o f l o r a 明S o u t h w e s tC h m aJA g r icS ci， 2 0 1 4 ，2 7 ( 6 ) ：2 5 3 4 - 2 5 3 8 3 5 【3 魏超，郭灵安，代晓航，等草莓表面典型微生物鉴定、1 6 S r D N A 同源 性分析及附着能力研究( I ) 闭西南农业学报，2 0 1 6 ，2 9 ( 1 2 ) ：2 9 3 9 - 3 9 4 3 W e i C ，G u oL A ，D a iX H ，e ta l R e s e a r chO ilt h em icr o o r g a n is m id e n t if ica t io n ，h o m o l o g ya n a l y s iso f1 6 S r D N Aa n da d h e s io no ft y p ica l m icr o o r g a n is m so nt h es u r f a ceo fs t r a w b e r r y ( 1 ) J 】S o u t h w e s tC h in aJ A g r icS ci，2 0 1 6 ，2 9 ( 1 2 ) ：2 9 3 9 - 3 9 4 3 4 A n t o n ioB ，B a r b a r aS ，D a n ie l aC ，e ta 1 I n h ib it io no fs p o il in gy e a s t so f f r u itj u ice st h r o u g hcit r u se x t r a ct s J 】JF o o dP r o t e ct ，2 0 1 3 ，7 6 ( 1 0 ) ： 1 7 5 3 - 1 7 6 0 5 】R o s aM R a y b a u d i- M ，J o n a t h a nM M ，e ta 1 C o n t r o lo fp a t h o g e n ic a n d s p o il a g em icr o o r g a n is m sinf r e s h - cu tf r u it sa n df r u itj t r ice sb yt r a d it io n a l a n da l t e r n a t iv en a t u r a la n t im icr o b ia l s J 1 C o m p r e hR e vF o o dS ciF o o dS a f , 1 7 2 6食品安全质量检测学报第8 卷 6 】 8 】 9 1 0 】 1 1 1 2 】 2 0 0 9 ，8 ( 3 ) ：1 5 7 1 8 0 N a s uH ，H a t a m o t o C o n t r o lo f f in itm o l do f p e a ch 明JA 弱cF o o dC h e r n , 2 0 1 3 ，6 1 ( 2 5 ) ：6 0 6 9 - 6 0 7 6 M e n f l eP GR is ka s s e s s m e n ta n dt h eim p o r t a n ceo fo e h r a t o x in s J I n t B io d e t e r io rB io d e g r a d ，2 0 0 2 ，( 5 0 ) ：1 4 3 1 4 6 M o s sM O R is ka r s e s s m e mf o ra f l a t o x in sinf o o d s t u f f s 叨I n tB io d e t e r io r B io d e g r a d ，2 0 0 2 ，( 5 0 ) ：1 3 7 1 4 2 李俊英，高喜源水果腐败关键病源微生物检测研究进展 J 】食品安 全质量检测学报，2 0 1 6 ，9 ( 7 ) ：3 5 1 0 - 3 5 1 5 L iJ Y , G a oX Y R e s e a r chp r o g r e s s0 1 1t h ed e t e ct io no fk e yp a t h o g e n ic m icr o o r g a n is m so ff r u its p o il a g e J 】JF o o dS a fQ u a l ，2 0 1 6 ，9 ( 7 ) ： 3 5 1 0 一3 5 1 5 杨家玲，岳田利，高振鹏，等赭曲霉