牛乳β-乳球蛋白过敏原表位及其潜在应用.pdf

第3 卷第4 期 2 0 1 2 年8 月 食品安全质量检测学报 J o u r n a lo fF o o dS a f e t ya n dQ u a l it y V 6 1 3N O 4 A u g ，2 0 1 2 牛乳p 一乳球蛋白过敏原表位及其潜在应用 陈红兵1 , 2 4 ( 1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌3 3 0 0 4 7 ； 2 南昌大学中德联合研究院，南昌3 3 0 0 4 7 ) 摘要：过敏原表位是过敏原直接参与免疫反应的物质基础，也是导致过敏反应的“元凶”。牛乳B 一乳球蛋白 是l ip o ca l in 家族的代表和常用模式蛋白，它的表位信息比较完整，拥有7 个人血清I g E 和6 个I g G 的线性表位、 3 个I g E 结合的构象性表位以及7 个T 细胞表位。另外，它的动物源血清I g E 、I g G 和T 细胞表位也在不断被 发现。牛乳B 乳球蛋白的表位信息为基于表位的应用提供了重要的支撑，它们的应用主要涉及到预测食物过敏原的 致敏性，食物过敏的交叉反应，食物过敏的诊断，食物过敏的免疫治疗以及食物过敏原的检测等5 个方面。 关键词：牛乳过敏；表位；3 - 乳球蛋白 E p it o p e so nb o v in eI j - l a ct o g l o b u l ina n d it sp o t e n t ia la p p l ica t io n C H E NH o n g B in 9 1 2 + ( 1 S t a t eK e yL a b o r a t o r yo f F o o d S cie n cea n dT e ch n o l o g y ，N a n ch a n gU n iv e r s it y ，N a n ch a n g3 3 0 0 4 7 ，C h in a ； 2 S in o G e r m a nJ o in tR e s e a r chI n s t it u t e ，N a n ch a n gU n iv e r s it y , N a n ch a n g3 3 0 0 4 7 ，C h in a ) A B S T R A C T ：E p it o p e sist h eb in d in gs it sb e t w e e na l l e r g e na n dt h er e l e v a n ta n t ib o d y , a n ditist h et r ig g e r in g e l e m e n to fim m u n er e a ct io n B o v in e1 3 - l a ct o g l o b u l inb e l o n g st ol ip o ca l inf a m il ya n diso n eo ft h em o d e lp r o t e in s I tw a sf o u n dt h a t7I g Eb in d in ga n d6I g Eb in d in gl in e a re p it o p e s ，3I g Eb in d in gco n f o r m a t io n a le p it o p e s a n d7Tce l l sb in d in ge p it o p e se x is t e dinm il ka l l e r g yp a t ie n t s ，a n dt h eb in d in ge p it o p e so fo t h e ra n im a lr e - s o u r cew e r ea l s or e p o r t e d T h ee p it o p e sin f o r m a t io np l a y sav e r yim p o r t a n tr o l eint h ea p p l ica t io nb a s e do n e p it o p e s ，a n dt h ea p p l ica t io nin cl u d e st h ep r e d ict io no ff o o da l l e r g e na l l e r g e n icit y , cr o s s r e a ct iv it y o ff o o da l l e r g e n ，d ia g n o s iso ff o o da l l e r g y , im m u n o t h e r a p yo ff o o da l l e r g ya n da n a l y s iso ff o o da l l e r g e n K E YW O R D S ：m il ka l l e r g y ；e p it o p e ；1 3 - l a ct o g l o b u l in 引言 牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应，是人体 对牛乳中蛋白质产生的一种变态反应。据国外流行病 学调查表明，0 3 7 5 的人群对牛乳产生食物过敏 反应【l 】。虽然国内缺乏大规模流行病学调查数据，但 牛乳过敏仍然是我国常见的食物过敏之一。牛乳过敏 严重影响部分人群的生活质量，尤其危及婴幼儿的 身体健康。 目前，I g E 介导的食物过敏机制表明，过敏原蛋 白激发机体产生特异性I g E 并与之结合的过程是过 敏反应的关键步骤。在此过程中，过敏原蛋白不是通 过它的完整分子发挥功能：而是由过敏原表位的直 接参与来完成的。所以，食物过敏原的I g E 结合表位 是导致食物过敏的“元凶”，也是食物过敏反应的物 质基础。已报道的一些食物过敏原表位研究工作也证 基金项目：国家自然科学基金( 3 1 1 7 1 7 1 6 ) ；国家科技支撑计划项目( 2 0 1 1 B A K l 0 8 0 3 ，2 0 1 2 B A K l 7 8 0 2 ) ；南昌大学食品科学与技术国 家重点实验室项目( S K L F M B 2 0 1 0 0 2 ，S K L F ，T S 一2 0 1 1 0 9 ) + 通讯作者：陈红兵，男，博士，教授，研究领域：食品科学。E - m a il ：ch b g j y h o t m a ilt o m 第4 期陈红兵，等：牛乳B - 乳球蛋白过敏原表位及其潜在应用 2 5 1 实了过敏原I g E 结合表位在食物过敏中的作用。此外， 食物过敏原的免疫学特性最终通过过敏原表位的免 疫特异性体现。因此，过敏原表位的免疫学功能及其 研究价值激起了人们极大的兴趣，人们已把对过敏 原表位的认识视为开启“解决食物过敏问题”的钥匙。 在众多的食物过敏原中，牛乳D 哥L 球蛋白属于 强过敏原l ip o ca l in 家族，是最主要的牛乳过敏原蛋白 之一，8 2 的牛乳过敏患者对牛乳B 哥L 球蛋白过刨2 1 ， 而且人乳中又缺乏B 哥L 球蛋白。另外，它还是蛋白质 科学研究的一种模式材料 3 。因此，牛乳p 哥L 球蛋白 备受关注，已经开展了一些卓有成效的工作，定位出 了牛乳B 哥L 球蛋白一系列表位。同时随着人们对食 物过敏原表位功能的不断认识，基于表位功能的应 用也在不断拓展。 2 牛乳p - 乳球蛋白过敏原表位的研究 目前有关牛乳B 哥L 球蛋白表位的文献报道，大 部分是关于表位定位的工作。在B 细胞线性表位定 位方面，最具有代表性的成果包括$ 6 1 0 课题组和 J 菹r v in e n 课题组的工作。$ 6 1 0 课题组通过酶法“切割” 抗原，开展了牛乳B 乳球蛋白的人血清I g E 结合表位 的定位工作，他们把筛选到的表位划分为最主要过 敏原表位，主要过敏原表位以及次要过敏原表位，一 共8 个表位【4 。最主要过敏原表位有肽片段A A l 0 2 1 2 4 ，A A 4 1 6 0 和A A l 4 9 1 6 2 ，它们分别被9 7 、9 2 和8 9 的牛乳过敏患者血清所识别；主要过敏原表 位有肽片段A A l 8 和A A 2 5 4 0 ，它们分别被5 8 和 7 2 的牛乳过敏患者的血清所识别；次要过敏原表 位有肽片段A A 9 1 4 ，A A 8 4 9 1 和A A 9 2 1 0 0 ，它们仍 被大于4 0 的牛乳过敏患者的血清所识别。J g r v in e n 则通过肽扫描技术定位出了牛乳B 哥L 球蛋白过敏原 的人血清I g E 结合表位，它们分别是肽片段A A l 1 6 ， A A 31 4 8 ，A A 4 7 6 0 ，A A 6 7 - 7 8 ，A A 7 5 8 6 ，A A l 2 7 1 4 4 和A A l 4 1 1 5 2 ，共7 个表位【4 1 。这些研究结果显示，大 部分肽片段在这两个研究小组中均可以找到。由于酶 法“切割”抗原定位法的操作过程复杂，测定结果所 受影响因素更多。而肽扫描定位法相对简单，其研究 结果的可靠性更高。 在B 细胞线性表位定位方面，除开展了I g E 结合 表位的工作，还定位出了牛乳B 一乳球蛋白的人血清 I g G 的6 个结合表位 5 ，它们分别是肽片段A A l 16 ， A A 5 1 - 6 4 ，A A 6 7 - 7 8 ，A A 8 5 - 9 6 ，A A l 2 9 1 4 4 和A A l 3 9 - 1 5 6 。其中A A l 1 6 和A A 5 8 9 6 为次要识别表位，其 余为主要识别表位。另外，笔者课题组通过对噬菌体 随机七肽库进行亲和淘选和采用肽扫描定位的方法， 寻找到了水牛乳B 哥L 球蛋白的8 个兔I g G 结合线性 表位，与已报道的牛乳B 乳球蛋白的I g G 结合表位相 比，发现了2 个兔I g G 结合的新表位，分别为A A l 3 4 1 4 3 和A A l 5 0 1 5 9 卅；在此基础上，确定了主要表位 中有1 4 个为关键氨基酸 7 1 。同时也获得了7 个水牛 乳B 哥l 球蛋白的I g G 结合的构象性表位以及3 个牛 乳B 一乳球蛋白的I g G 结合构象性表位，尤其是定位出 了3 个人血清的I g E 结合表位【8 9 1 。 在牛乳D 哥L 球蛋白的T 细胞表位定位研究方面， 比较突出的研究结果有一组人源性T 细胞表位和一 组鼠源T 细胞表位。T o t s u k a 用三种品系的小鼠开展 了牛乳B 哥L 球蛋白的T 细胞表位定位工作 1 ，用 B A L B c小鼠确定了3 个主要T 细胞表位A A 6 7 7 5 ， A A 7 1 7 9 和A A 8 0 8 8 4 个亚主要T 细胞表位A A 8 1 6 ， A A 3 0 3 8 ，A A 3 9 4 7 和A A l 0 7 11 7 以及4 个次要T 细 胞表位A A l 2 2 6 ，A A 4 4 5 6 ，A A 4 9 6 3 和A A l l 0 1 2 4 ； 用C 5 7 B L 6 小鼠定位的T 细胞主要、亚主要和次要 表位分别是A A l l 5 1 3 6 ，A A l l 3 0 和A A l 0 7 1 2 2 ；用 C 3 H H e 小鼠定位了2 个主要T 细胞表位A A l 3 1 1 5 4 和A A 8 6 1 0 5 ，1 个亚主要T 细胞表位A A 7 3 9 3 以及2 个次要T 细胞表位A A 9 8 1 1 3 和A A l 2 7 1 4 3 。I n o u e 则通过对牛乳过敏患者的研究，筛选到了7 个牛乳B 乳球蛋白的人源T 细胞结合表位A A l 一2 1 ，A A l 4 2 9 ， A A 3 6 4 7 ，A A 4 7 6 7 ，A A 7 7 9 7 ，A A 9 7 1 1 7 和A A l 4 2 1 6 2 1 1 。其中A A 7 7 9 7 在B A L B c小鼠和C 3 H H e 小 鼠中均能找到相应的片段，说明存在免疫应答的相 似性。 在牛乳B 一乳球蛋白过敏原表位研究方面，还有 一些关于表位与牛乳过敏免疫耐受，终生过敏与过 敏患者表位差异以及表位与肥大细胞关系的研究 结果 1 2 - 1 4 】。目前这些研究还有一些局限性，有待深入 探索。， 3过敏原表位的潜在应用 3 1预测食物过敏原的致敏性 为食物过敏患者提供安全的食品激发了科学家 浓厚的兴趣，也是亟待解决的关键问题，其中食物致 敏性的预测与评估则是待突破的关键技术之一。迄今 2 5 2 食品安全质量检测学报第3 卷 为止，基于基因组学和蛋白质组学水平的过敏原信 息推动了一些计算工具在致敏性预测中的应用。尽管 评估蛋白质致敏性的标准还在形成阶段，甚至只是 在讨论阶段，但世界卫生组织( W H O ) 和国际粮农组 织( F A O ) 提出了评估转基因食品潜在致敏性的指导 方针，其评估方法主要是基于筛查与已知过敏原蛋 白I g E 线性结合表位至少有6 个连续的氨基酸序列相 似性。另外，根据食品法典委员会，与已知过敏原相 比，待鉴定蛋白若含有6 个或以上的连续氨基酸，或 在8 0 个氨基酸中有 3 5 序列相似性，则该蛋白为潜 在的过敏原 15 | 。 3 2 食物过敏的交叉反应 通过比较食物蛋白与已知过敏原蛋白结构的相 似性是评估蛋白质存在潜在交叉反应的有效途径。这 种策略不仅考虑了线性表位，还考虑了构象性表位， 因而可以克服简单的比较线性表位的缺点。以B e tv1 为例，该蛋白是导致花粉关联的食物过敏的主要过 敏原，它的三级结构与其它多种食物，如樱桃，苹果， 榛子，桃，胡萝卜，芹菜和大豆等，有三个相同的曲 面片【1 。另外，为了确定临床相关的I g E 交叉反应， 可以通过各过敏原蛋白的三维结构来比较它们构象 性表位的相似性。但是，在过敏蛋白质结构数据库 ( S D A P ) 中只有5 ( 4 5 8 2 9 ) 的实验数据可以使用 17 1 。 由于上述方法的局限性，最近又出现了一种新技术， 即综合考虑过敏原蛋白模拟的3 维结构、已知过敏原 的3 维结构以及过敏原表位氨基酸的特性，可以用于 提高预测交叉过敏反应的准确性 1 7 】。 3 3 食物过敏的诊断 现代生物技术推动着免疫化学朝着食物过敏原 表位定位和合成多种过敏原I g E 结合表位的方向发 展。这些进步使得通过定量检测I g E 抗体与过敏原蛋 白线性表位的结合可以实现基于单一组分的食物过 敏诊断。这种诊断可以获得新的致敏信息：( 1 ) 一种 过敏食物含有多种致敏蛋白；( 2 ) 不同食物中含有同 系的致敏蛋白；( 3 ) 同一过敏原蛋白含有不同表位【1 引。 另外，I g E 结合的过敏原表位可以作为临床过敏的标 志。比如，过敏原表位与患者血清结合的强度与众多 食物过敏反应的程度相关 1 9 】。以牛奶过敏为例， J f ir v in e n 等对比了老年和年轻牛奶过敏患者的过 敏原线性表位，发现今后可能对牛奶产生耐受的年 轻牛奶过敏患者的血清具有不同的识别表位，他们 能识别0 【乳清蛋白上的3 个I g E 结合表位而不能识别 D 一乳球蛋白上的I g E 结合表位，该结果表明，识别乳过 敏原多个I g E 表位可能是终生牛乳过敏的标志【5 ，聆 2 0 】。 3 4 免疫治疗 尽管过敏原特异性免疫治疗已被广泛应用了近 1 0 0 年，但这种治疗方式仍在发展。目前，一种有前 途的治疗方法是T 细胞表位的使用，该T 细胞仅仅作 用于目标过敏原特异性T 细胞，不会造成不良的ig E 介导的过敏反应。到目前为止，基于T 细胞表位肽的 免疫治疗在蜂毒过敏和猫皮屑过敏中得到了成功应 用，而类似的食物过敏策略尚未达到临床试验水平 2 1 1 。 然而，含有T 细胞表位而不含I g E 结合表位的花生 过敏原片段却已显示了潜在免疫治疗花生过敏的可 能性2 2 1 。 3 5 过敏原的检测 食物过敏原的抗原性与食品过敏原的免疫学检 测息息相关，食物过敏原与其激发的抗体的特异性 结合奠定了灵敏、特异的免疫学检测体系。在乳蛋白 过敏原免疫检学测研究中，开展了酶吸附实验、放射 免疫测定、酶联免疫吸附测定、斑点免疫印迹等研究【2 3 1 ， 并针对部分乳过敏原开发出了基于夹心E L I S A 和竞 争E L I S A 原理的免疫检测试剂盒。已有的信息显示， 不同的研究者和开发商得到的过敏原检测限差别较 大，这种差别既存在于同种乳过敏原之间，也存在于 不同乳过敏原之间。如K a r a w o v a 采用夹心E L I S A 检 测一乳白蛋白和p 一乳球蛋白( A 、B 两个变异体) 的检 测限分别是1 3I t g L 、2 7l - t g L ( A ) 1 ) 2 及2 01 t g L ( B ) 2 4 1 。 虽然在实际工作中，免疫学检测是公认的食物过敏 原检测的最有效的方法，但已有的商业化免疫学检 测试剂盒并没有得到联合论证许可，而且已有的过 敏原免疫学检测体系均局限于过敏原完整分子的检 测，不能检测到加工食品中所有的过敏原片段 2 5 1 。而 针对于过敏原表位单抗的制备则为实现检测过敏原 致敏性片段提供了关键支撑，但由于多个致敏性表 位的存在，如何实现基于表位检测过敏原的工作值 得进一步研究开发。 参考文献 1 1E l A g a m y E I T h ech a l l e n g eo fC O Wm il kp r o t e ina l l e r g y 【J 】 S m a l lR u m in a n tR e s ，2 0 0 7 ，6 8 ( 1 - 2 ) ：6 4 7 2 ， 2 】A o k iT I s k a n d a rS ，Y o s h id aT ，e ta 1 R e d u ce dim m u n o g e n icit yo f 第4 期 陈红兵，等：牛乳B - 乳球蛋白过敏原表位及其潜在应用 2 5 3 3 1 【4 】4 5 】 6 】 【8 】 【9 】 【l O 】 【1 2 【1 3 】 【1 4 】 【1 5 】 b e t a l a ct o g l o b u l inb yco n j u g a t in gw it hch it o s a n 【J 】B io s ci B in - t e ch n o lB io ch e r n , 2 0 0 6 ，7 0 ( 1 0 ) ：2 3 4 9 - 2 3 5 6 B e l l o q u eJ ，C h ic6 nRL 6 p e z F a n d if l oR U n f o l d in ga n dr e f o l d in g o fb e t a - l a ct o g l o b u l ins u b j e ct e dt oh ig hh y d r o s t a t icp r e s s u r ea t d if f e r e n tp Hv a l u e sa n dt e m p e r a t u r e sa n dit sin f l u e n ceo np r o t e o l y s is J 】JA g r icF o o dC h e m , 2 0 0 7 ，5 5 ( 1 3 ) ：5 2 8 2 - 5 2 8 8 $ 6 1 0I ，C 1 6 m e n tQB e m a r dH ，e la 1 A l l e r g yt ob o v in e b e t a - l a ct o g l o b u l in ：s p e cif icit yo fh u m a nI g Et ot r y p t icp e p t id e s 【J 】C l inE x pA l l e r g y , 1 9 9 9 ，2 9 ( 8 ) ：1 0 5 5 - 1 0 6 3 J a r v in e nK M ，C h a t ch a t e eP ，B a r d in aL ，e ta 1 I g Ea n dl g Gb in d - in ge p it o p e so na l p h a - l a e t a l b u m ina n db e 诅- l a e t o g l o b u l ininco w s m il k a l l e r g y 阴I n t A r ch A l l e r g y l “砌啪L 2 0 0 1 ，1 2 6 ( 2 ) ：l l l 一1 1 8 X inL i，H o n g b in gC h e n ，T o n gP in g ，e ta 1 E p it o p em a p p in go f b u f f a l ob e t a - l a ct o g io b u l ina g a in s tr a b b itp o l y cl o n a la n t ib o d yf o l l o w in gp h a g ed is p l a yt e ch n iq u e J 】JF o o dB io ch e m , 2 0 1 2 ，3 6 ( 1 ) ： 5 6 6 5 X inL i，H o n g b in gC h e n ，J in y a nG a o ，e la 1 E p it o p em a p p in ga n d id e n t if ica t io no fa m in oa cid scr it ica lf o rr a b b it sI g G b in d in gt o l in e a re p it o p e so nb u f f a l ob e t a l a ct o g l o b u l in J 】P r o t e inP e p t L e t t ( E p u ba h e a do f p r in t , P P L E P U B 2 0 1 2 0 6 0 1 - 4 ) 李欣水牛乳p _ 乎L 球蛋白的I g G 结合表位的定位研究( 博士论 文) ，2 0 0 8 ，南昌大学：南昌 武涌牛乳p 孚L 球蛋白构象性表位定位及结构特征研究( 硕士 论文) ，2 0 1 2 ，南昌大学：南昌 T o t s u k aM ，A m e t a n iA ，K a m in o g a w aS F in em a p p in go fT - ce l l d e t e r m in a n t so fb o v in eb e t a l a ct o g l o b u l in 【J 1 C y t o t e ch n o l o g y , 1 9 9 7 ，2 5 ( 1 - 3 ) ：1 0 1 1 1 3 I n o u eKM a t s u s h it aS ，K a n e k oH ，e ta 1 I d e n t if ica t io no fb e t a l a ct o g l o b u l in - d e r iv e dp e p t id e sa n dcl a s sI IH L A m o l e cu l e sr e c- o g n iz e db yT ce l l sf r o mp a t ie n t sw it hm il ka l l e r g y 【J 】C l inE x p A l l e r g y , 2 0 0 1 ，3 l ( 7 ) ：1 1 2 6 一1 1 3 4 M iz u m a ch iK ，K u r is a k iJ I n d u ct io no fo r a lt o l e r a n ceinm iceb y co n t in u o u sf e e d in gw it hb e t a - l a ct o g l o b u l ina n dm il k 【J 】B io s ci B io t e ch n o lB io e h e m ，2 0 0 2 ，6 6 ( 6 ) ：1 2 8 7 - 1 2 9 4 J t r v in e nK M ，B e y e rK ，V il aL ，e ta 1 B - ce l le p it o p e sa sas cr e e n - in gin s m m a e n tf o rp e r s is t e n tC O W Sm il ka l l e r g y 【J 】JA l l e r g y C l inl m m u n o l ，2 0 0 2 ，1l0 ( 2 ) ：2 9 3 - 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3 7 4 7 S t e ck e l b r o e ckS ，B a l l m e r - W e b e rB K ，V ie t h sS P o t e n t ia l ，p it f a l l s ， a n dp r o s p e ct so ff o o da l l e r g yd ia g n o s t icsw it hr e co m b in a n ta l l e r g e n so rs y n t h e t ics e q u e n t ia le p it o p e s J 1 JA l l e r g yC l inl m - m u n o l ，2 0 0 8 ，1 2 1 ( 6 ) ：1 3 2 3 1 3 3 0 A l b r e ch tM ，K 0 h n eY B a l l m e r - W e b e rB K ，e la 1 R e l e v a n ceo f I g Eb in d in gt os h o r tp e p t id e sf o rt h ea l l e r g e n ica ct iv it yo ff o o d a l l e r g e n s 【J 】JA l l e r g yC l inI m m u n o l ，2 0 0 9 ，1 2 4 ( 2 ) ：3 2 8 3 3 6 B e y e rK ，J a r v in e nK M ，B a r d in aL ，e ta 1 1 9 E - b in d in gp e p t id e s co u p l e dt oaco m m e r cia lm a t r ixa s ad ia g n o s t ic in s t r u m e n tf o r p e r s is t