分子与基因工程实验七.ppt

实验七农杆菌介导的叶盘法转化,目的及要求：通过叶盘法将带有报告基因的农杆菌转入烟草中，诱导获得转基因植株。了解农杆菌转化植物的原理，掌握农杆菌的培养和侵染植物的方法。,二、实验原理农杆菌重组子中携带经改造的Ti质粒（含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的Vir区）和包含T-DNA的双元载体pBinGUS，质粒pBinGUS上T-DNA上插入了报告基因（GUS）和卡那霉素筛选标记基因NPTII。叶盘法转化是通过人为在烟草叶片上产生伤口，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位，受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。共培养可使T-DNA上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了的烟草外植体可在含有相应抗生素的培养基上生长。,植物基因转化受体系统,指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。具备条件：（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性,外植体的种类,叶片、叶柄、子叶、子叶柄茎、花茎、块茎、茎尖分生组织根合子胚成熟种子,叶盘法转化,双子叶植物以叶片作为外植体，在叶片上产生伤口，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位;受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。,农杆菌与外植体共培养,接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之为共培养。是整个转化过程中非常重要的环节。因为农杆菌吸附，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成。,EventsAneventistheinsertionofaparticulartransgeneintoaspecificlocationonachromosome.,Conceptions,TransformationfrequencyIndependenttransgenicplants/inoculatedimmatureembryoorcallus.LineTheseedlingsfromonetransgeniccell,namely,oneindependentsuccessfullytransformationevent,belongtooneline,alsoarecalledclones.GenerationThesetransgenicseedlingsareT0generationseedlings,T0generationmatureseedsareT1generationMeiosisorpollinationistheboundaryofdifferentgenerations.,实验仪器、材料和试剂,仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器及吸头，无菌滤纸；材料：携带质粒植物表达(pBI121)载体土壤农杆菌LBA4404烟草无菌苗试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O0.5g,pH7.0MS盐：MS大量元素、微量元素、pH7.0；MS基本培养基：MS大量元素、微量元素、有机物，3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8；,实验步骤,1.从平板上挑取含有pBI121的农杆菌LBA4404单菌落，接种于50mlYEB液体培养液(含有100mg/LKan和125mg/LSm)中，28C振荡培养至OD600为0.6-0.8；2.4000rpm，室温离心10分钟，倒掉上清.3.用MS盐溶液（pH7.0）重新悬浮菌体，侵染时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。4.在超净台上从烟草无菌苗上切下叶片,切去边缘和主要叶脉，切成0.40.6cm2大小；,5.侵染：将切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出外植体置于无菌滤纸上吸去材料表面的菌液。6.共培养，将侵染过的外植体接种在上铺一层滤纸的MS基本培养基，28C暗培养三天。7.外植体暗培养三天后，转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+Kan100mg/L+Cb500mg/L）上，在光照为2000-10000lx，25C条件下进行选择培养。8.三天观察一次，发现污染，立刻转入新的相同培养基中,注意事项,1烟草无菌苗上切下