PCR扩增和电泳检测ppt课件.ppt

实验13DNA片段的PCR扩增,1、用PCR技术对DNA进行扩增2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测,1,实验步骤,2,DNA在体内复制的条件是什么？,模板：酶：原料、能量：,解旋酶、DNA聚合酶等。,DNA分子的每条链,dATP、dGTP、dCTP、dTTP,引物：,温和的反应条件,3,DNA分子的结构,4,合成DNA分子的原料脱氧核苷三磷酸,5,合成DNA分子的原料脱氧核苷三磷酸,dATPdGTPdCTPdTTP,6,聚合反应机理：,7,DNA聚合酶,8,不同细胞的细胞周期,PCR技术可在几小时内，将特定核酸序列扩增百万倍!,9,PCR的概念,PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。,10,PCR的反应体系DNA模板原料：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物：（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶,11,PCR技术原理,12,PCR三步曲,13,PCR仪,14,用于PCR的预混液（500L体系）：ddH2O310L10butter50LMgCl240LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25LTaqDNA聚合酶5L,标记一个微量离心管，用取样器取20L的预混液加入到该管中。,15,反应试剂用量PCRSuperMix10L引物（浓度10M）1L引物（浓度10M）1L模板DNA5LddH2O3L总体积20L,16,微量可调移液器（一档吸、二档排）,17,PCR反应参数：,变性9430s,退火5230s,延伸7260s,预变性94300s,保温72600s,循环次数35,18,1、基本概念以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。,琼脂糖凝胶电泳,19,琼脂糖凝胶电泳基本原理,20,21,琼脂糖凝胶电泳的过程,22,将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）,将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。,制胶,23,将梳子从制胶槽中拔出,24,取出凝胶板放入电泳槽中,向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶,25,琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1、增加电导率；2、维持电泳过程中的合适的pH。,26,吸取PCR反应产物10L。注意吸头要插入到管底，才能取到PCR产物。,将PCR产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次）,混样,27,常用的上样缓冲液配方及各成分的作用,蔗糖,使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。,溴酚蓝,增加样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内。,核酸荧光染料,可嵌合入DNA分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。,（需要与加样缓冲液混合）,28,加样,29,进行电泳10-20分钟,电泳,30,实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后，在DNA图谱观察仪的可见光下发射黄绿色荧光。,电泳结果的观察在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。,31,PCR的应用