预处理和菌体的破碎.ppt

第二章预处理和细胞的破碎,2.1固液分离的分类2.2发酵液的组成2.3悬浮液的预处理预处理的目的预处理方法2.4细胞破碎方法2.5细胞破碎理论2.6细胞破碎技术2.7细胞破碎方法的选择及评价,2.1固液分离的类型,1、过滤:重力过滤器、压滤器、真空过滤器2、离心3、重力沉降4、气浮分离：在水中通入或设法使水体产生大量微细气泡，附着于杂质颗粒上，密度小于水而浮至水面，从而获得分离的一种澄清方法。固液分离：处理固体颗粒粒度细小，很难用沉淀法分离。液液分离：用于从污水中分离回收石油，有机溶剂的微细油滴、表面活性剂及各种金属离子。,2.3悬浮液的预处理,凝聚剂:指的是让不稳定的胶体微粒（或者凝结过程中形成的微粒）聚合在一起形成集合体的过程中所投加的药剂的统称。种类：A、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeCl3、AlCl3、ZnCl、硫酸镁等；B、无机碱，如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；C、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10mm大小的絮凝团过程。絮凝剂种类：A、阳离子类，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺；B、阴离子类，如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-)；C、非离子类，如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用,细胞产物,2.4细胞破碎方法,细胞破碎物理法和化学法的比较,物理破碎法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离。化学破碎法缺点：A、费用高；B、引起新的污染，尤其是其他化学方法；C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。,2.7细胞破碎技术,1)、固体剪切法(珠磨法,最有效的物理破碎法)操作简介,2.7细胞破碎技术,计算破碎遵循一级动力学定律,即对上述方程积分得对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。,2.7细胞破碎技术,影响因素a)转盘外缘速度(见下图)：适合条件：圆盘外缘速度20m/s,一般在5-15m/s。b)珠粒添量和大小添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%)粒径：一般在0.2mm(实验室),0.4mm(工业)。最终由实验确定,2.7细胞破碎技术,c)温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热，功率，温度。如产物热不稳定，必须控温。d)细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗。e)破碎效率：R：每kg成品细胞(如酵母)释放的蛋白量，Q：物料流量，P：珠磨机消耗的功率。f)流量Q：破碎为一级反应。,2.7细胞破碎技术,计算服从一级反应定律式中，R为pro释放量，Rm为pro最大释放量.影响因素操作压力p：p,R;相反,R。温度2C/10MPa。破碎次数N：N，R。温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌=2.1。细胞种类：影响k值。细胞浓度：Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，：细胞浓度的参数。,2.7细胞破碎技术,阀门底座：刃缘阀座，平边阀座优点A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多;B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌;C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.,2.7细胞破碎技术,4)超声破碎法(1525kHz),2.7细胞破碎技术,机理在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。优点：适合于多种细胞的破碎缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。,2.7细胞破碎技术,5)化学破碎法酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键，使细胞壁破碎。优点：A、产品释放的选择性；B、提取速度和收效高；C、产品的破坏小；D、对外界环境，如pH和温度等要求低；E、不残留细胞碎片。,2.8破碎方法的选择,选择的一般原则A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法破碎技术杂交研究应注意的问题A、杂交技术可产生很大优势。B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响D、菌种的培育，胞内产物胞外产物,2.8细胞破碎的评价,破碎率定义N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。直接计数法方法：样本稀释-染色-上样计数。计算：同上。优点：方法简单。缺点：A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细胞聚集时，不利计数，D、染色误差。,2.8细胞破碎的评价,间接计数法方法：样本离心-取上清液-测特定蛋白质或酶-与理论的最大值比较。计算：Rm：理论最大值，R：实验测得值。优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。,基因工程表达产物,存在的问题A、包涵体B、N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌）C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母）D、大肠杆菌的内毒素包涵体的解决方法（一般步骤）A、包涵体的分离B、包涵体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDSC、蛋白质的复性和重新氧化D、一般的分离纯化,习题,固液分离的类型:过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器);离心;重力沉降;气悬浮凝聚：在凝聚剂(如铝盐、铁盐、石灰和NaCl)作用下,细胞蛋白质等(准)胶体去稳定，并聚集成1mm大小的凝聚块的过程。凝聚机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10mm大小的絮凝团过程。气浮分离：在水中通入或设法使水体产生大量微细气泡，附着于杂质颗粒上，密度小于水而浮至水面，从而获得分离的一种澄清方法。预