蛋白质相互作用研究方法.ppt

蛋白质相互作用研究方法简介,1,.,基因组序列测定后基因组研究时代编码功能蛋白的基因不到三万条已知蛋白的功能，新基因的功能探索蛋白质功能研究或蛋白质组学研究蛋白质相互作用研究方法作为技术平台蛋白在发挥作用时都不是孤立的，而是相互联系的,2,xx,一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调节或介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入一个新的天地。对于新基因情况也是如此。,3,xx,Yeasttwo-hybridSystem,酵母双杂交系统,4,.,原理,把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子GAL4的调控表达。一旦GAL4蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点，则启动其表达。,5,xx,实际应用中，把GAL4基因分成两个部分：DNA结合区（gal4DNAbindingdomain,GBD）和激活区(gal4activatingdomain,GAD）。分别把GBD和GAD构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（GBD-X和GAD-Y）。自激活作用检测：GBD-X和GADGAD-Y和GBD阴性对照GBD和GADGBD-IL2和GAD-IL2R（例如）阳性对照,6,xx,然后把GBD-X和GAD-Y两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当GBD-X融合蛋白中X蛋白与GAD-Y融合蛋白中Y蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的GBD和GAD蛋白靠近并具有完整的GAL4蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。,7,xx,UASs,upstreamactivatingsequencesAD,activatingdomainBD,bindingdomain,8,xx,AD/library:AfusionoftheGAL4ADwithalibrarycDNA/protein.DNA-BD/bait:AfusionoftheGAL4DNA-BDwithabaitcDNA/protein.,9,xx,YeastPhenotypes,Ade,His,Leu,orTrpRequiresadenine(Ade),histidine(His),leucine(Leu),ortryptophan(Trp)inthemediumtogrow;isauxotrophicforatleastoneofthesespecificnutrients.Ade+ExpressestheADE2reportergene;i.e.,doesnotrequireAdeinthemediumtogrow.His+ExpressestheHIS3reportergene;i.e.,doesnotrequireHisinthemediumtogrow.LacZ+ExpressesthelacZreportergene;i.e.,ispositivefor-galactosidaseactivity.Mel1+ExpressestheMEL1reportergene;i.e.,ispositivefor-galactosidaseactivity.,10,xx,应用,一、筛选相互作用的蛋白可用于对cDNA文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到GBD载体上，作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到GAD载体上。假阳性:人为转染重组体artificial验证实验:进一步验证实验证明其在生理情况下是否真的有作用。,11,xx,二.确定参与结合作用的domain或motif,随机缺失，制备一系列缺失体。对已知的domain或motif进行缺失。对磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作用。,12,xx,Figure1.TheCysSermutationofHPOdestroyingitsenzymeactivitydisturbedneitherHPOdimerizationnorHPO-JAB1interactioninvivo.C)Theindicationofyeastcellscontainingvectorsineachpiesliceofthecultureplate.D)GrowthoftransformantscoexpressingHPOandJAB1onselectiveleu/trpmedium.E)Growthoftransfectedyeastcellsonleu/trp/hismedium.,13,xx,14,xx,15,xx,16,xx,PullDownAssay,17,.,细胞外蛋白质相互作用比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用,18,xx,GST-pulldownassayHIS-pulldownassay,19,xx,原理,将目的蛋白基因克隆到带有GST或HIS基因的原核表达载体中，进行原核表达，得到GST-X或HIS-X融合蛋白。把GST-X挂到Sepharosebeads上,如是HIS-X则挂到Ni-chelatedagarose上。,20,xx,加入另一种蛋白Y复合物GST-X-Y(HIS-X-Y)Wash,elution,detectionbySDS-PAGEandwesternblotting.,21,xx,GST/HIS融合蛋白与重组蛋白的相互作用,重组蛋白X,Y均为原核表达蛋白GST-X-Y，用anti-Yantibody进行westernblotting检测,22,xx,23,xx,GST/HIS融合蛋白与体外TNT系统合成的多肽或蛋白的相互作用体外TNT系统合成Y，且可在Y上加上标签anti-Yantibody或标签抗体检测X-Y结合力弱时,S32标记Y,放射自显影,24,xx,GST/HIS融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用,细胞提取物中的内源性蛋白（提取细胞总蛋白与GST/HIS-X融合蛋白孵育）S32标记,25,xx,GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用,构建Y的真核表达载体，转染细胞，瞬时表达（过表达）。,26,xx,待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响,GST/HIS-X融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关。,27,xx,Co-Immunoprecipitation(co-IP),免疫共沉淀,28,.,co-IP,细胞内蛋白质相互作用原理技术,29,xx,原理,形成X,Y两种蛋白的复合物用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来用另一种蛋白的抗体检测proteinA/Gagarose,30,xx,细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀,高效瞬时过表达系统大量表达，增加复合物的量标签抗体,31,xx,32,xx,Figure3.TheCysSermutationofHPOdestroyingitsenzymeactivitydisturbedneitherHPOdimerizationnorHPO-JAB1interactioninvivo.COS7cellswerecotransfectedwithJAB1andeitherMyc-taggedHPOs(wildtypeormutants)orMyccontrolvector.Thecellslysateswereincubatedwitharabbitanti-JAB1antibodythenwithproteinA/GAgarose.Theimmuno-complexwasresolvedon15%SDS-PAGEandanalyzedbyimmunoblottingwithanti-Mycantibody.AsanindicationoftherelativeexpressionlevelforMyc-HPO,someofthetotalcelllysateusedinimmuno-precipitationwasloadedontolanes8(pCMV-Myc-HPOwt)and9(pCMV-Myc).Lanes2to7arefromcellsexpressingJAB1/MycandJAB1/Myc-HPO(HPOwt,HPOC67S,HPOC70S,HPOC67S/C70SandHPOC90S),respectively.Lane1isacontrolforlane3withrabbitmockantibody(normalIgG).Aduplicateblotwasalsoprobedwithanti-JAB1antibodytomonitortheamountsofJAB1protein(bottom).IP,immuno-precipitation;IB,immuno-blotting.,33,xx,细胞内源性蛋白的免疫共沉淀,生理条件下的蛋白相互作用内源性蛋白含量低条件温和,34,xx,组织内蛋白的免疫共沉淀,组织提取，切碎，匀浆，提取组织蛋白co-IPassay,35,xx,蛋白质细胞内定位实验,36,.,直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布以及共定位的部位蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋白在细胞内的活动状态,37,xx,蛋白质定位及共定位研究必不可少。因为相互作用的蛋白在功能上相互关联。通过蛋白共定位研究，能够确定两种蛋白在细胞内生理条件下相互作用的区域。,38,xx,有色荧光蛋白标记技术,也可称为活细胞定位分别克隆X，Y至荧光蛋白载体中共转染表达GFP/RFP，绿/红色荧光蛋白融合蛋白confocalmicroscopy共聚焦显微镜法也可同时进行核染色,39,xx,Fig.21CellularlocalizationofHPOandJAB1.COS7cellsweretranfectedwithGFP-HPOorRFP-JAB1constructs,respectively.ThenucleiwerestainedbyHoechst33342(blue).Allcellsampleswerevisualizedbyconfocalmicroscopy(Leica).,40,xx,Fig.22CellularcolocalizationofJAB1withHPO.COS7cellswerecotransfectedwithRFP-JAB1andGFP-HPOconstructs.ThenucleiwerestainedbyHoechst33342(blue).Arrowheadsindicatethefieldofcolocalization.Allcellsampleswerevisualizedbyconfocalmicroscopy(Leica).,41,xx,利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用。一抗，二抗（荧光素标记）“靶蛋白-一抗-二抗”免疫复合物对照的严格设置,42,xx,Fig.23EndogenousJAB1colocalizeswithendogenousHPOinHepG2cells.HepG2cellswerefixedin30%paraformaldehyde,permeabilizedin0.5%TritonX-100