（参考课件）结核、PCR培训.ppt

一、结核分枝杆菌基础知识二、分子诊断PCR技术基础知识三、生产操作程序,1,结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染病。结核菌能侵入全身各个器官，但80%发生在肺部，常称肺结核。常见肺外结核：淋巴结核（最常见）、结核性脑膜炎（最严重）、结核性胸膜炎、肠结核、肾结核、附睾结核、女性生殖系统结核（引起不孕不育）、骨关节结核等。,结核病,2,中国结核病流行现状,3,4,5,肺结核,确诊病例,临床诊断病例,疑似病例,仅培阳肺结核,肺部病变标本病理学诊断为结核病变者,标本查到结核分枝杆菌,5岁以下儿童TB密切接触史或PPD强阳性伴有肺结核病临床症状者,3份痰标本涂片阴性,或结核中毒症状胸部影像学检查怀疑有活动性TB可能性,影像符合活动性TB,PPD强阳性具有可疑症状,血清免疫学检查阳性;,疑似TB经诊断性治疗和/或排除类似疾病,结核病诊断标准（WS288-2008）,5,在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链5-3合成反应。通过特殊的仪器不断满足上述条件，则DNA单链的5-3合成反应可不断进行下去，直到条件不复存在。实际上是模拟天然DNA复制过程。,PCR技术原理,6,PCR技术原理,基本过程1.变性：双链DNA解链成为单链DNA2.退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合3.延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,7,可能造成的污染1.纯化限制性酶切的目标片段2.包含目标序列的质粒DNA3.处理PCR产物过程造成的反应后污染,PCR技术原理,8,防止污染的操作1.实验室要求：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区；提取或加样用的超净台或安全柜有排风管直通室外。2.操作要求：使用滤芯吸头；10ul吸头使用细长吸头、在准备新反应前更换手套；试验用器材高压消毒或10次氯酸钠消毒、清洁实验台面、254nm波长紫外线照射；减少开盖次数。不用移液器吹吸混匀试剂，以防止产生气溶胶污染移液器。3.设置对照：阴性对照、阳性对照、内对照；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。4.UNG防污染：在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG敏感，在PCR前对新配制的反应用UNG处理以破坏残余产物，杜绝污染。,PCR技术原理,9,普通PCR技术的优点及缺点优点：高灵敏度高特异性简便、快速缺点：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量。无法对扩增反应实时检测。开盖检测“气溶胶”污染问题。,PCR技术原理,10,配制标准环境：十万级洁净生产区。提前准备好配置所需的容器、化学试剂、原料等按照表中成分称取需要的化学试剂，并核对后置于适当的配制容器中。加入部分纯化水搅拌直至完全溶解，记录溶解开始时间；溶解结束时间；溶解持续时间。如需调节PH值，必要时可用HCl或NaOH调pH值至规定的范围内。加纯化水定容到终体积，充分搅拌均匀，搅拌时间不少于20分钟并记录。根据不同液体所需要的不同规格滤膜进行过滤，除去杂质。贴标签（注明名称、批号、批量、贮存温度、配制日期和配制人及保存期限）后于适当的条件保存。自检：确认核对制备程序符合工艺要求；确认核对配液记录填写真实、正确。按相关SOP执行清场，填写清场记录。,生产操作程序,11,分装操作程序环境：十万级洁净生产区根据生产指令领取试剂瓶、盖和规定批号的耗材。检查分装机工作状况，按BT00-300T兰格蠕动泵标准操作规程先调整相关的参数并进行试分装，分液量达标稳定后，按相关指令进行分装。或者用移液器吸取规定的量与试剂瓶中。实施分装，每分装完总批量的20%后，至少取一瓶进行分液量检验。如超出此范围，则刚分装过的总批量的20%应倒回原液中，并调整分装机的参数，重新分装。边分装边拧盖，并紧固瓶盖。分装完毕，清点分装数量，计算得率并记录后，装箱贴标识（注明名称、批号、批量、规格、贮存温度、分装日期和分装人及保存期限）后移入一般生产区粘贴标签，如不能及时粘贴标签，应于适当条件保存。按分装机清洁SOP进行清洁。自检：确认分装程序符合工艺要求；确认分装记录填写真实、正确。按相关SOP执行清场，填写清场记录,生产操作程序,12,贴签环境：一般生产区。根据生产指令填写标签制备通知单。领取已打印好的标签和待贴签液体。按相关SOP执行标签粘贴。更换不同产品时要清除上批次的剩余物