（中药学专业论文）刺梨多糖铁复合物的合成研究.pdf

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者： 勿而硷 嗍：砂年 夕r 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 同期：力，d 年，月 夕同 目录 中文摘要1 a b s t r a c t 2 第一章前言4 1 刺梨及多糖的研究现状：4 2 缺铁性贫血及其研究现状5 第二章刺梨多糖的提取及多糖含量测定8 l 刺梨多糖的提取工艺研究：8 1 i 仪器、试刺与约材：9 1 2 实验方法l o i 2 1 原料预处理+ 1o 1 2 2 同流提取1 0 1 2 3 止交试验优化水提条件：1 0 2 刺梨多糖的含量测定1 2 2 1 仪器和试捌1 2 2 2 实验方法l3 2 2 1 对照品溶液的配制1 3 2 2 2 测定波长的确定1 3 2 2 3 试验条仆的选择1 3 2 2 3 1 苯酚川鼙的选择1 3 2 2 3 2 硫酸川量的选择：1 4 2 2 3 3 反应时间的选择1 4 2 2 4 标准曲线的绘制1 4 2 2 5 刺梨多糖含苗测定的方法学考察j 1 5 2 2 5 1 精密度试验：15 2 2 5 2 稳定性试验j 15 2 2 5 3 重复性试验16 2 2 5 4 加样同收率试验1 6 2 2 6 样品含鼍的测定：1 7 第三章刺梨多糖铁复合物的合成及理化性质研究1 8 1 刺梨多糖铁复合物的合成1 8 1 1 实验仪器、原料与试刺18 1 2 实验方法与结累18 1 2 1p h 值对反应的影响：1 9 1 2 2 柠檬酸= 钠的加入餐对反应的影u 向1 9 1 2 3 温度对反应结果的影响2 0 1 3 刺梨多糖铁复合物的制备。2 l 2 刺梨多糖铁中含铁量的测定2 1 2 1 仪器与试剂2 l 2 2 试液的配制：2 1 2 3 最人吸收波k 的确定2 2 2 4 标准曲线的绘制2 2 2 5 方法孚：考察：2 3 2 5 1 精密度试验_ j 2 3 2 5 2 稳定性试验。2 3 2 5 3 重复性试验：2 3 2 5 4 加样同收率试验：2 4 2 6 样品含餐测定_ 。2 4 3 刺梨多糖铁的理化性质研究：2 4 3 i 刺梨多糖铁的一般性质。：2 4 3 2 水解实验j 2 5 3 3 还原性实验。2 5 3 4 定性鉴别实验：2 5 3 4 1 溶液颜色：2 5 3 4 2 j 达尔现象2 5 3 4 3 加有机溶剂2 5 3 ，4 4 加亚铁氰化钾试剂。2 6 3 4 5 加氢氧化钠溶液：2 6 第四章总结与展望2 7 1 刺梨多糖提取工艺的优选。2 7 2 刺梨多糖铁的合成及其性质2 7 3 前景展望2 7 附录一综述- 2 9 参考文献：3 7 附录二附图4 1 附录三致谓 j 5 0 附录四个人简介；5 1 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 多糖铁复合物是一种以多糖为配体的新型补铁制剂，能够以分子形式完整地 被机体吸收，且配体多糖具有多方面的生物活性，可以增强人体免疫力，多糖铁 复合物已成为补铁剂研究的重点，、具有广阔的发展前景。 本课题以贵州特产植物刺梨的干燥果实为原料，提取刺梨多糖，并进一步合 成刺梨多糖铁复合物，创新之处在于首次利用刺梨多糖合成多糖铁复合物，有望 为缺铁性疾病提供新的用药选择。 首先，采用水提醇沉法从刺梨粉中提取刺梨多糖，对影响多糖提取得率的溶 剂配比、提取次数、提取时间等因素进行考察，通过f 交试验优选出最佳的提取 工艺为溶剂比为2 0 ：1 ，提取3 次，每次1 h 。通过聚酰胺柱和半透膜透析对刺梨粗 多糖进行分离纯化后，以葡萄糖为标准品，采用苯酚一硫酸法对得到的刺梨多糖 进行含量测定，测得刺梨多糖中多糖含量为4 7 左右。 然后，采用氯化铁共热法合成刺梨多糖铁，以产量和铁含量为主要指标，选 取柠檬酸钠加入量、温度、p h 值三个因素进行单因素考察，优选出合成刺梨多 糖铁的最佳工艺条件为按l ：1 加入催化剂，p h 值8 o ，温度6 0 c 。用邻菲哕啉 分光光度法测定刺梨多糖铁的含铁量，结果为1 9 7 左右。理化性质研究结果表 明，刺梨多糖铁可溶于水，且水溶液中不存在游离的三价铁，该复合物中的三价 铁可被抗坏血酸很快的还原成能被人体吸收的二价铁。 关键词：刺梨；多糖铁；补铁剂 s e v e r a lp a r a m e t e r st h a te f f e c t so nt h e e x t r a c t i o ny i e l do fp o l y s a c c h a r i d e s ，w h i c h i n c l u d es o l v e n tp r o p o r t i o n s ，e x t r a c t i o nt i m e s ，e x t r a c t i o nt i m e ，e t c w i t hg l u c o s ea st h e s t a n d a r dp r o d u c t ，t h ec o n t e n t so fc i l i p o l y s a c c h a r i d e sw a sm e a s u r e db yp h e n o l - s u l f u r i ca c i dm e t h o d ，t h ea v e r a g ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d e sw a s4 7 o rs o s e c o n d l y ，u s i n gf e r r i cc h l o r i d et os y n t h e s i sp o l y s a c c h a r i d e - i r o nc o m p l e xo u to f c i l i p o l y s a c c h a r i d e s t a k i n gt h ep r o d u c t i o no fp o l y s a c c h a r i d ea n di r o n c o n t e n ta s m a i o ri n d e x ，d e t e r m i n et h eo p t i m a ls y n t h e s i sp r o c e s st h r o u g hi n v e s t i g a t i o n so ft h e a d d i n ga m o u n to fs o d i u mc i t r a t e ，t e m p e r a t u r ea n dp h t h ei r o nc o n t e n to f p o l y s a c c h a r i d e i r o nc o m p l e xw a sd e t e r m i n e db yo v p h e n a n t h r o l i n es p e c t r o p h o t o m e t r y ， 2 贵阳中医学院硕士学位论文 一一 w h i c hw a s1 9 7 o rs o t h e s t u d yo n p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s r e v e a l e d t h a tc i l i p o l y s a c c h a r i d e - i r o nc o m p l e xi sak i n do fw a t e r - s o l u b l ec o m p o u n d ，a n dt h e r ew a sn o f r e et r i v a l e n ti r o ne x i s t e n c ec a nb et e s t e d ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ef e r r i ci r o nc a i lb e q u c i k l yt r a n s f o r m e dt ot w o v a l e n ti r o nf o ra b s o r p t i o ni nh u m a n st h r o u g ht h er e d u c t i o n e f f e c to fa s c o r b i ca c i d k e yw o r d s ：r o s ar o x b u r g h i i ；p o l y s a c c h a r i d ei r o n ；i r o na g e n t 贵阳中医学院硕士学位论文 1 刺梨及多糖的研究现状 第一章前言 刺梨( r o s ar o x b u r g h i it r a t t n o r m a l i sr e h d e tw i l s ) 又称送春归、缫丝花， 是一种蔷薇科蔷薇属多年生落叶丛生灌木，主产于云南、贵州、四川等地，尤其 在贵州山区更为广见。刺梨富含多种营养物质，具有较高的药用价值。过去民间 以果实和根入药，具有消食健脾、收敛止泻与解毒【j 】等功效，用于食积腹胀、痢 疾、肠炎、高血压、血管破裂出血、维生素c 缺乏症等疾病的治疗。 本草纲 木拾遗( 1 9 8 3 ) 已有记载， 中药大词典( 上册，1 9 7 7 ) 刃i 收载该品种。 2 0 世纪4 0 年代，著名营养学家罗登义丌始从营养学角度研究刺梨，8 0 年代 梁光义等曾对刺梨的化学成分作过全面的研究【2 一】，国内外对刺梨的化学成分进 行了大量的分析，发现其营养成分十分丰富，特别是维生素c ，含量高居蔬菜水 果榜首。贵州农学院报道了刺梨中3 5 种营养成分含量【4 i ，其中维尘素包括维生 素c 、e 、b i 、b 2 、叶酸、k l 胡萝b 素等、蛋白质及氨基酸、糖类、微量元素、 超氧化物歧化酶( s o d ) 、以及其它成分b 谷甾醇、硬脂酸、刺梨酸、刺梨甙、 野蔷甙、原儿茶酸等。8 0 年代以来，贵州省十分重视刺梨产品的丌发。经过科 研部门与生产企业的合作，先后研制生产了刺梨原汁、浓缩刺梨汁、各种刺梨饮 料、刺梨酒系列产品、带有刺梨风味的糖果糕点、多维刺梨啤酒、刺梨果酱、，刺 梨休闲食品。近年又丌发了含有刺梨s o d 的老来福口服液、口宝含片等产品， 这些产品问世后，受到了广大消费者的欢迎与好评，也由此带动了西南省区农民 的种植积极性【5 l ，刺梨作为西部发展循环经济的新兴果树产业己见端倪。 对刺梨黄酮的研究表明，刺梨果实中主要含有杨梅素、槲皮素、山萘素三种 黄酮甙元，刺梨黄酮通过保护胰岛细胞免受a u o x a n 的氧化损伤，可在一定程度上 预防a l l o x a n 诱导的高血糖：在f 常和病理条件下刺梨黄酮能够调节脂质代谢紊 乱，降低血清甘油三酯水平，提示其对高甘油三酯血症具有一定的预防和治疗作 用，具有防治动脉粥样硬化疾病及糖尿病血管并发症的功能前景。 近年来，国内外对多糖的研究进入迅速发展与空前活跃的阶段。通过研究， 人们发现多糖除了具有为机体提供能量、参与组织结构等作用外，还具有多种生 4 贵阳中医。学院硕士学位论文 物学功能，在生命活动中起到重要的作用。绝大多数的多糖均为无定形化合物， 可溶于水，不溶于乙醇、丙酮、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂。多糖一般 由几十至几千个单糖分子脱水缩合而成，故分子巨大，例如纤维素的分子量为2 0 力至2 0 0 力道尔顿，淀粉约为1 力至1 0 0 万，不同柬源的糖原约为1 0 0 万至4 0 0 万。 虽然多糖分子中含有半缩醛羟基，但由于它在分子中所占的比例太少因而浓度 低，与试剂接触的机会较少，因此多糖一般都没有还原性和变旋现象，也不具甜 味，没有醛、酮的其它性质。多糖与硫酸一葸酮、硫酸一苯酚反应呈阳性，可与部 分有机、无机离子络合，如与十六烷基三甲基溴化胺( c t a b ) 、氢氧化钡等结合 沉淀。 贵州大学杨江涛从刺梨汁提取得到刺梨多糖，并对其生物活性进行研究，研 究结果显示，刺梨多糖具有清除氧自由基的作用，其对自由基的清除效果大于同 浓度的v c 溶液，且刺梨多糖粗品对自由基的清除效果大于同浓度时的纯组分： 刺梨多糖还有较好的抗衰老作用，能提高衰老小鼠的体内抗氧化能力。抗缺氧活 性实验研究表明，刺梨多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤和神经干细胞谷氨酸损 伤有明显的保护作用，另外刺梨多糖还具有神经营养活性【6 】。 2 缺铁性贫血及其研究现状 。铁是动物体所必需的微量元素，在动物体代谢过程中起着极其重要的作用， 能够在一定程度上影响机体的免疫机能，是维持各种f 常生理过程不可或缺的物 质【7 l 。铁在人体中的分命根掘其作用分为两大部分：一部分为功能铁，主要存在 于红细胞内的血红蛋白中以及肌红蛋白和各种含铁酶中；另一部分为贮存铁，其 主要以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在于骨髓、肝、脾以及肝实质细胞中，其主 要作用为将膳食中吸收的机体暂时不需要的铁储备起来，当功能铁代谢消耗时可 以动用这部分铁及时予以补充。 人们研究发现，人体对铁的吸收主要是在肠道内完成，铁主要在十二指肠和 空肠上段被吸收8 9 1 ，胃吸收铁的能力不强，但是胃液坏境对铁吸收起重要作用。 如胃液中的胃酸含量对于非血红素铁的溶解是非常重要的，当胃酸分泌降低时， 非血红素铁吸收明显降低【1 0 】。 缺铁影响免疫机能，根据人体与动物实验证实，缺铁主要影响两项免疫功能： 贵阳中医学院硕士学位论文 中性白血球吞噬细菌能力降低，t 淋巴细胞对细胞增生剂或抗原的反应降低。缺 铁还会增加铅中毒的危险，美国儿章中缺铁者铅中毒的比例较健康者高出3 - - - 4 倍。因为缺铁时小肠负责铁吸收的蛋白质d m t l 表现增加，但是它缺乏专一性， 故对其他会属元素，包括铅、铬等重金属的吸收率也伴随增高。 贫血发生之前，通常没有明显易辨之症状。贫血发生之后，多种生理机能不 良之症状就明显可辨，诸如：肌肉劳动效力明显降低，体力和耐力下降，易出现 严重的心动过速，智力发育降低等。缺铁性贫血与婴幼儿精神性运动能力不良有 关，并且有行为异常的现象，使心智发展明显较差，包括：语言能力差，运动协 调与平衡不佳，注意力、反应灵敏度与情绪的分数均明显较低，甚至有长期的影 响。 无贫血性缺铁也会降低认知能力，缺铁之高中女生经过铁补充之后，可以提 升其语言学习与记忆能力。美国的一项调查中发现，6 1 6 岁青少年中，缺铁者的 数学得分显著较健康者为低。发达国家中无贫血性缺铁发生率仍然居高，由于涉 及学习发展，故对青少年的铁营养状况必须密切注意。 缺铁性贫血可发生于下列几种情况： 一、铁的需要量增加而摄入不足：生长快速的婴幼儿、儿章以及月经过多、 妊娠期或哺乳期的妇女，铁的需要量增多，如果饮食中缺少铁则易致铁性贫血。 二、铁的吸收不良：因铁的吸收障碍而发生缺铁性贫血，这类原因的缺铁比 较少见。 三、失血：失血，尤其是慢性失血，是缺铁性贫血最多见、最重要的原因。 消化道出血如溃疡病、癌、钩虫病、食道静脉曲张出血、痔出血、服用水杨酸盐 后发生胃窦炎以及其他可引起慢性出血的疾病，妇女月经过多和溶血性贫血伴含 铁血黄素尿或血红蛋白尿等均可引起缺铁性贫血。 从1 7 世纪丌始，人们就丌始以饮用加入铁屑的葡萄酒的方法束治疗缺铁性贫 血，硫酸亚铁是治疗缺铁性贫血的传统药物，但服用以后刺激胃肠道导致呕吐、 便秘、腹泻，且有不利于铁的消化吸收等问题【l i 】。对于重症缺铁性贫血的治疗， 新一代的硫酸亚铁缓释胶囊和缓释片剂具有比硫酸亚铁更好的效果和较小的副 作用【l2 1 。但二价铁易产生内源性自由基，导致细胞膜脂质过氧化而造成细胞膜损 伤l l3 。 自2 0 世纪9 0 年代以来，右旋糖酐铁在美国广泛使用，右旋糖酐铁仅注射 6 贵阳中医学院硕士学位论文 用，适用于不能耐受口服铁剂或需要迅速补充铁剂剖m 】。葡萄糖酸亚铁、乳酸亚 铁、柠檬酸亚铁、富马酸亚铁、枸橼酸亚铁、琥珀酸亚铁等小分子有机铁盐也相 继上市，这些补铁剂口感不佳，具有肠道刺激作用，可引起恶心、呕吐、上腹疼 痛等。此外，掘报导，亚铁离子在体内易产生内源性自由基，导致细胞膜脂质过 氧化造成细胞损伤【1 5 1 引。自由基是机体f 常或异常生化反应的产物，正常状态时， 其产生和清除处于平衡：病理情况下，体内自由基产生过多或清除障碍，便会造 成机体损害。超氧阴离子自由基( o d 及羟自由基( o h ) 是引起脑脂质过氧化损害 的主要有害物质1 1 7 j 。 2 0 世纪术，大分子复合物补铁剂相继出现，如多糖铁、糊精铁、白蛋白铁、 硫酸软骨素铁、聚麦芽糖铁等，这些新型补铁剂在国外研究比较早，且技术比较 成熟，但在国内市场上，由于成本过高，还难以普及。多糖铁( i i i ) 复合物 ( p o l y s a c c h a r i d e i r o nc o m p l e x ，p i c ) 作为补铁剂不仅有合适的络合稳定性， 对胃肠道无或甚少刺激性，而且当其释放铁之后，多糖本身具有多方面的生物活 性，是对机体有益的成分，可被吸收利用。因此，p i c 是一类很有前途的口服补 铁剂。目前国内已有多种多糖铁配合物的文献报道，主要有：化橘红多糖铁( i i l l 配合物【1 8 l 、银耳多糖铁( i i i ) 配合物【f 9 】、茶叶多糖铁( i i i ) 配合物【2 0 】、当归多糖铁( i i i ) 配合物【2 i l 、地黄多糖铁( 】i 】) 配合物 2 2 】、南瓜多糖铁( i i i ) 配合物【2 3 1 、紫菜多糖铁( i i i ) 配合物【2 4 | 、白芍多糖铁( i i i ) 配合物【2 5 1 、大枣多糖铁配合物【2 6 】等，都有望发展成为 新型的高生物利用度补铁剂，为缺铁性疾病患者提供新的治疗用药选择。 一童堕! 垦兰堕堡主兰垡笙茎 一 _ - - _ _ - _ _ - 一一 第二章刺梨多糖的提取及多糖含量测定 1 刺梨多糖的提取工艺研究 多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，大多为 无定形化合物，无甜味和还原性，难溶于水，在热水中形成胶体溶液。广泛存在 于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与 生命功能的维持密切相关。多糖按来源不同可分为植物多糖、动物多糖、藻类多 糖及微生物多糖。 大量的研究表明，多糖在生物体内不仅仅只提供能量和参与结构组织，同时 还具有多种生物活性。它广泛参与细胞识别! 细胞生长、分化、代谢、胚胎发育、 细胞癌变、病毒感染、免疫应答等各项生命活动。目前，多糖已作为药物和功能 食品广泛用于临床治疗和保健，植物多糖有调节免疫机能、抑制或杀死癌细胞、 清除自由基与抑制脂质过氧化、双向调节血糖、降低血脂、抗肿瘤、抗辐射、抗 凝血、改善肠道微生念活性等药理作用。 多糖的提取纯化是研究多糖的基础。多糖的提取方法很多，传统的方法是水 提醇沉法。近年来，随着新的提取分离方法的发展，人们对多糖的研究更为深入， 酶提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、超滤膜技 术提取法等提取技术都已应用于多糖的提取。 水提醇沉法：目前在植物活性多糖提取中应用最多。多糖常与其它分子共存 于植物中，可利用多糖不溶于有机溶剂的性质，在水提取液中加入乙醇使多糖从 提取液中沉淀出柬，达到初步分离纯化的目的，该法操作简单、成本较低。 酶提取法：酶是生物催化剂，能降低化学反应的活化能，加速反应。在中草 药多糖的提取过程中，利用酶促反应，降低体系中的活化能，使反应在较低f j - - 匕e , 量 水平上进行，在比较温和的条件下分解植物组织，加速多糖的提取或释放【2 7 1 ，酶 提取法是在进行常规水法提取d 玎，添加酶制剂，进行酶解。 微波辅助提取法：微波是频率介于3 0 0 m h z 和3 0 0 g h z 之白j 的电磁波，在微波 场中，高频电磁波穿透萃取介质，由于溶剂及细胞液吸收微波能，细胞内部温度 迅速升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，压力增大使细胞壁破裂， 贵阳中医学院硕士学位论文 位于细胞内部有效成分从细胞中释放出柬，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解，再 通过进一步过滤和分离便获得提取物【2 8 1 ，与加热的提取方法相比较，微波辐射使 整体温度均匀而迅速的升高，对活性物质的破坏和损失大大降低。 超声波辅助提取法：超声波辅助提取技术是利用超声波辐射压强产生的骚动 效应、空化效应和热效应来加速物质的扩散溶解，有效地提高化合物提取的得率 和含量。有研究者采用超声波辅助提取多糖，超声技术应用于植物细胞破壁，大 大的加快了反应速度，提高了得率【2 9 】。但超声波可能会导致可溶性多糖发生降解。 超临界流体是指物体处于其临界温度和临界压力状态时，性质介于气体和液 体之间的流体。它既有类似气体的良好扩散能力，可以快速流动和传递，又具有 类似液体的良好溶解能力。在临界点附近，温度和压力的微小变化都会引起流体 性质的巨大变化，溶解的亲和力也会随之变化，从而可以使不同性质的溶质被分 段萃取出来，达到萃耿、分离的目的。 超滤膜技术提取法：多糖提取过程通常不能完全除去杂质，故纯度不高。采 用超滤膜技术脱豁、分级和浓缩，得率高、能耗低、设备简单、无污染。多糖的 生物活性破坏少，还无传统有机溶剂法的试剂残留问题，现已经成为活性多糖研 究的重要手段川。 ， 本部分采用水提醇沉的方法提取刺梨中的多糖，通过正交试验优选提取条 件。 1 1 仪器、试剂与药材 g b cc i n t r a2 0 紫外可见分光光度计( 澳大利亚照生公司) ：a g l 3 5 型电子天 平：r e 一3 0 0 a 旋转蒸发器( 上海亚荣公司) ：d z f 一6 2 1 0 型真空干燥箱( 上海齐欣 科学仪器有限公司) ； 苯酚溶液( 分析纯重蒸馏试剂) 、浓硫酸、无水乙醇、石油醚，葡萄糖等均 为国产分析纯试剂；蒸馏水( 本实验室自制) ： 刺梨，产于贵州龙罩，经贵阳中医学院尘药教研室刘艽教授鉴定为蔷薇科蔷 薇属植物刺梨( r o s ar o x b u r g h i it r a t t fn o r m a l i sr e h d e tw i l s ) 的果实。 贵阳中医学院硕士学位论文 1 2 实验方法 1 2 1 原料预处理 干燥刺梨果实一4 0 条件下烘干一粉碎一过4 0 目筛一于索氏提取器中用石 油醚提取4 h ，脱除脂肪类物质一药渣挥干溶剂一于索氏提取器中用乙醇提取4 h ， 脱除单糖和部分水溶性色素一药渣于4 0 c 条件下烘干一置于干燥器中保存备用。 1 2 2 回流提取 准确称取5 0 0 9 经过预处理的刺梨粉，加入一定量的蒸馏水，摇匀后置于 8 0 c 恒温水浴锅中回流提取，抽滤，所得滤液为刺梨多糖粗提液。将粗提液过聚 酰胺柱脱色，然后在6 0 c 条件下置旋转蒸发器中浓缩，浓缩液用半透膜扎袋透析 过夜以脱去蛋白类成分，透析液中加入4 倍体积的无水乙醇，摇匀，溶液立即变 浑浊，冰箱中静置过夜使沉淀完全，溶液中有大量絮状沉淀生成，3 0 0 0 r p m m i n 离心，倾去上清液，将沉淀真空干燥得刺梨多糖。 1 2 3 正交试验优化水提条件 根据文献和预实验结果发现水提醇沉法的主要影响因素有提取次数、提取时 间、和加水量，故按照表l 选取因素和水平进行正交试验，正交试验设计表见表 2 。 表l多糖提取的止交试验冈素水平 贵阳中医学院硕士学位论文 表2止交试验设计表 试验号abc 分别称取9 份经过预处理的刺梨粉1 0 o g ，分别按照表1 、表2 中设定的条件 进行水浴回流提取，提取液稀释至1 0 0 0 m l ，用苯酚硫酸法测定提取液中多糖含 量，以多糖提取率为考察指标，进行正交试验，结果及分析见表3 、表4 。 表3 i l 交试验的结果 试验号 abc 多糖提取率脯 k 3 1 4 7 21 3 2 5 1 0 8 3 1 2 3 6 1 2 8 1 1 5 9 3 1 2 1 5 1 3 8 7 1 4 9 3 1 6 1 8 1 3 0 6 2 3 3 l 2 2 3 l i 2 3 2 3 ， ， 2 2 2 3 3 3 2 3 4 s 6 7 8 9 2 7 2 3 3 ， 2 2 3 1 o 一 歹 互 3 乱 1 1 2 3 ， 2 3 姗 弼 船 ， ， 2 2 2 3 3 3 乏 3 2 3 4 5 6 7 8 9 k k 贵阳中医学院硕士学位论文 注：k i 为各冈素同一水平试验指标的平均数，t 为各冈素同一水平试验指标之和t 为 9 个试验号的试验指标之和，f o0 5 ( 2 2 ) = 1 9 。 表4方筹分析表 以多糖提取率为考察指标，各因素主次为c a b 。方差分析表明，因素c 和a 对结果有显著影响，因素b 对结果无显著影响，依据直观分析和方差分析 结果，并根掘实际情况，选择刺梨多糖的水提条件为a 2 b i c 3 ，即加水量为2 0 倍， 提取时i 自j 为1h ，提取次数为3 次。 2 刺梨多糖的含量测定 本实验采用苯酚硫酸法测定刺梨多糖中的多糖含量，其反应原理是多糖或寡 糖被浓硫酸在适当温度下水解，生成单糖，并迅速脱水成糖醛衍生物，该衍生物 在强酸条件下与苯酚起显色反应，在4 9 0 n m 波长处有最大吸收，通过吸光度计 算可得到多糖的含量。 2 1 仪器和试剂 g b cc i n t r a2 0 紫外可见分光光度计( 澳大利亚照生公司) ： a g l 3 5 型电子天平； 5 苯酚溶液( 分析纯重蒸馏试剂) 的制备：取重蒸馏苯酚2 5 9 ，罨于5 0 0 m l 的容量瓶中，加水溶解并定容至刻度； 浓硫酸、葡萄糖均为国产分析纯试剂 贵阳中医学院硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 对照品溶液的配制 精密称取1 0 5 干燥至恒重的葡萄糖0 4 0 5 8 9 ，置2 0 0m l 容量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为2 0 2 9 0 m g m l 1 葡萄糖标准储备液，精密吸 取上述溶液1 0 0m l 置于l o o m l 的容量瓶中，用水定容至l o o m l ，得浓度为 0 2 0 2 9m gjm l 葡萄糖对照品溶液。 2 2 2 测定波长的确定 精密吸取0 2 0 2 9 m g m l j 的葡萄糖溶液2 o m l ，置于2 5 m l 的比色管中， 依次加入2 0 m l 蒸馏水、5 苯酚溶液1 o m l 、浓硫酸5 0 m l ，迅速振摇混匀， 置于6 0 c 水浴中反应3 0 m i n ，将4 o r a l 水同法操作作空白，在3 0 0 n m - - - 7 0 0 n m 波 长做全波长扫描，结果在4 9 1 n m 处有最大吸收，故选择4 9 1 n m 作为测定波长。 2 2 3 试验条件的选择 参考相关文献，显色剂苯酚的用量、浓硫酸的用量、显色反应的时间对含量 测定结果均有影响，本部分将对影响测定结果的各因素分别进行单因素考察，以 选择最佳测定条件。 2 2 3 1 苯酚用量的选择 精密吸耿0 2 0 2 9 m g ml 1 的葡萄糖溶液2 0 m l6 份，分别置于2 5 m l 的比 色管中，各加入5 苯酚溶液0 5 m l 、0 8 m l 、1 o m l 、1 2 m l 、1 5 m l 、1 8 m l ， 分别加入5 o r a l 浓硫酸，补水至1 0 o r a l ，迅速振摇混匀，置于6 0 c 水浴中反应 3 0 r a i n ，分别取相应体积的苯酚溶液，加入5 o r a l 浓硫酸，补水至1 0 o m l ，作为 空白液，照分光光度法于4 9 1 n m 波长处测定吸收度。结果见表5 。 表5 苯酚心鸷与吸光度的关系 结果表明，加入1 o r a l5 苯酚时吸光度最大。 贵阳中医学院硕士学位论文 2 2 3 2 硫酸用量的选择 精密吸取0 2 0 2 9 m g m l j 的葡萄糖溶液2 0 m l6 份，分别置于2 5 m l 的比 色管中，加入5 苯酚溶液1 0 m l ，再分别加入4 0 m l 、4 5 m l 、5 0 m l 、5 5 m l 、 6 0 m l 、6 5 m l 浓硫酸，迅速振摇混匀，补水至1 0 o m l ，置于6 0 c 水浴中反应 3 0 m i n ，分别取相应体积的硫酸，加入1 0 m l5 苯酚溶液，补水至1 0 o m l 作为 空白液，照分光光度法于4 9 1 n m 波长处测定吸收度。结果见表6 表6 硫酸川鹫与吸光度的关系 结果表明，加入5 0 m l 硫酸时吸光度最大。 2 2 3 3 反应时间的选择 精密吸取0 2 0 2 9 m g ml - l 的葡萄糖溶液2 o r a l 6 份，分别置于2 5 m l 的比色 管中，加入5 苯酚溶液1 o m l ，再加入5 0 m l 浓硫酸，迅速振摇混匀，补水至 1 0 o m l ，分别置于6 0 水浴中反应2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、9 0 m i n ，将4 0 m l 水同 法操作作为空白液，照分光光度法于4 9 1 n m 波长处测定吸收度。实验结果见表7 。 表7 反应时间与吸光度的关系 结果表明，本显色反应在2 0 - 9 0 m i n 时间段内稳定，选择3 0 m i n 作为检测时 间，可得到理想的测定结果。 2 2 4 标准曲线的绘制 精密吸取0 2 0 2 9 m g m l 。葡萄糖溶液0 6 m l 、1 0 m l 、1 5 m l 、2 0 m l 、2 5 m l 、 3 o r a l 、3 5 m l ，分别置于2 5m l 比色管中，补水至4 0 m l ，以4 0 m l 水作为空 白液，分别加入5 苯酚溶液1 0 m l ，再加入5 o r a l 浓硫酸，迅速振摇混匀，置于 6 0 水浴中反应3 0 m i n ，测定吸光度，以吸光度( a ) 为纵坐话，以浓度( c ) 为横坐 标，绘制标准曲线。实验结果见表8 、图1 。 一一 贵阳中医学院硕士学位论文 = 二二二 表8 标准曲线结果表 吸收度a0 1915 0 2 5 61 0 3 4 6 80 4 4 5 8 0 5 4 9 6 0 6 5 2 90 7 5 3 5 一一 图l 多耱含繁测定标准曲线 计算得回归方程为：a = 0 0 0 9 7 c + 0 0 6 1 9r = 0 9 9 9 4 ( n = 7 ) 结果表明对照品溶 液在1 2 1 7 7 1 0 2l a g m l 。范围内吸收度与浓度呈良好的线性关系。 2 2 5 刺梨多糖含量测定的方法学考察 2 2 5 i 精密度试验 精密吸取样品溶液3 0 m l ，按照样品含量的测定方法操作，重复测定吸光度 6 次，计算相对标准偏差r s d ，即得陔测定方法的精密度，结果见表9 。 表9 精密度试验测定结果表 = 一一 样号l 2 34 5 6 一一一 吸光| 文a0 3 9 61 0 3 9 6 6 0 3 9 6 8 0 3 9 6 9 0 3 9 7 30 3 9 7 9 = = _ 一一 计算得r s d = 0 1 3 ，结果表明仪器的精密度良好。 2 2 5 2 稳定性试验 精密吸取样品溶液3 o r a l ，按照样品含量的测定方法操作，每隔2 0 分钟测 定一次吸光度，共测6 次，观察吸光度有无明显变化。实验结果见表l o 。 表1 0 稳定性试验结果表 样号 l2 34 56 吸光度a o 3 9 210 3 9 3 6 0 3 9 4 90 3 9 7 00 3 9 9 3 0 4 0 19 计算得r s d = 0 8 7 ，结果表明该测定方法在1 2 0 m i n 内稳定性良好。 2 2 5 3 重复性试验 按照样品含量的测定方法重复操作6 次，测定吸光度，计算相对标准偏差 r s d ，既得含量测定方法的重复性。结果见表11 。 表il重复性试验结果表 计算得r s d = i 0 7 ，结果表明该测定方法重复性良好。 2 2 5 4 加样回收率试验 精密称取同一样品6 份，每份约o 0 6g ，分别精密加入一定量的葡萄糖对照 品，按样品液溶的制备方法制备供试品溶液，按照标准曲线项下的相同测定条件 操作，测定吸光度，计算回收率及相对标准偏差r s d 。结果见表1 2 。 表1 2同收率试验结果( n = 6 ) l6 1 2 26 0 8 36 1 7 46 0 1 56 1 2 2 8 9 5 2 8 7 6 2 9 1 9 2 8 4 3 2 8 9 5 2 0 2 9 2 0 2 9 2 0 2 9 2 0 2 9 2 0 2 9 4 8 6 6 4 8 8 2 5 0 1 0 4 8 4 2 4 8 3 0 9 8 8 2 9 9 5 3 1 0 1 2 59 9 0 2 9 9 3 8 9 8 0 9 66 0 62 8 6 6 2 0 2 94 7 9 99 8 0 4 1 6 贵阳中医学院硕士学位论文 2 2 6 样品含量的测定 精密称取1 2 1 0 m g 样品多糖，置于5 0 0 m l 容量瓶中j 加水溶解并稀释至刻 度，得浓度为0 2 4 2 0m g m l 一的样品溶液，精密量取该样品溶液3 0 m l ，照标准 曲线项下自“补水至4 0 m l 起操作，测定吸光度，由回归方程计算，即得。平 行实验3 份。测得样品中多糖的平均含量为4 7 3 1 ，r s d = 1 9 7 。 贵阳中医学院硕士学位论文 _ 一 第三章刺梨多糖铁复合物的合成及理化性质研究 多糖铁复合物由糖基和配糖铁两部分构成，配糖铁是三价铁，不以游离状态 存在，故不存在肠胃刺激问题，在体内可被还原剂还原成二价铁后吸收利用。一 般通过化学合成的方法制备，也有通过复合膜在温和的条件下模拟生物矿化过程 制备多糖铁的新方法。从原料的结构特点、生产周期和质量可控性等方面考虑， 化学合成法仍然是主流。本部分采用氯化铁共热法合成刺梨多糖铁，其原理是在 碱性条件下，三氯化铁和柠檬酸三钠反应液中，f e 3 + 极易通过o 桥或o h 桥聚合而 形成聚合铁核，聚合铁核微粒表面可以结合亲水性配体而形成“增溶”的微粒表 面络合物，最后柠檬酸和多糖络合于聚合铁核的表面，随着反应的进行，多糖与 铁核络合产物增加，柠檬酸会逐渐从多糖铁上解离，参与新的合成。 1 刺梨多糖铁复合物的合成 1 1 实验仪器、原料与试剂 g b cc i n t r a2 0 紫外可见分光光度计( 澳大利亚照生公司) ：a g l 3 5 型电子 天平：l d 1 0 1 磁力搅拌恒温水浴锅( 上海科伟公司) ：r e 一3 0 0 a 旋转蒸发器 ( 上海亚荣公司) ：d z f 6 2 1 0 型真空干燥箱( 上海齐欣科学仪器有限公司) ： l d 4 2 型离心机( 北京医用离心机厂) ； 刺梨多糖为本实验室自制： 三氯化铁、柠檬酸三钠、抗坏血酸、硫酸亚铁铵、氢氧化钠、无水乙醇均为 国产分析纯试剂。 1 2 实验方法与结果 称取刺梨多糖o 5 9 溶解于6 0 m l 水中，加入一定量的柠檬酸三钠，置水浴中 加热并不断搅拌。在不断搅拌的过程中，先滴j j 1 2 0 氢氧化钠溶液调节溶液的碱 性至试验所设定的p h ，然后缓缓! j l ：1 ) k l t 0 0 1 l - t 三氯化铁溶液，控制二者的滴加 速度和滴加的量，使反应液碱性一直保持在试验所设定的p h 。至溶液中出现不 再溶解的沉淀时停止滴加，继续搅拌反应】h 。反应结束后离一c 、，上清液减压浓缩， 贵阳中医学院硕士学位论文 醇沉，真空干燥即得刺梨多糖铁络合物。 根据相关文献报道和预实验可知，刺梨多糖铁的合成反应受p h 值、柠檬酸 三钠的加入量、反应温度等因素的影响，故本部分以刺梨多糖铁的产量和含铁量 为考察指标，对这些影响因素进行具体研究，以选择反应的最佳条件。 1 2 1p h 值对反应的影响 分别称取3 份干燥刺梨多糖0 5 9 、柠檬酸- - 宅f l o 5 9 加入到2 5 0 m l 的三颈瓶中， 用6 0 m l 蒸馏水溶解。在7 0 c 水浴中不停搅拌1 0 r a i n 使充分溶解，调节溶液的p h 值为7 o 、8 0 、9 0 ，缓慢滴加l m 0 1 l 一三氯化铁溶液，并同时滴j 口2 0 氢氧化 钠溶液使反应液的p h 值保持稳定，滴加完毕继续在热水浴中搅拌lh ，趁热离心。 取上层深红棕色液体，按体积比1 ：1 加入无水乙醇，冰