（中药学专业论文）小半夏加茯苓颗粒制剂工艺及部分药效学研究.pdf

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明够鼢 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 f 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者：马雯雯 日期：2 0 1 0 年3 月1 5 日 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 、 作者签名：易嘻嚯导师签c 少莎离 蹒洲馋吼产 目 摘要 英文摘要 引言 实验部分 第一部分小半夏加茯苓汤复方的急性 1 实验材料 2 试验方法及结果 2 1 急性毒性实验 2 2 药效学研究 3 讨论 第二部分方中各味药材的质量研究 1 药材来源及鉴定j ” 2 半夏 3 生姜 3 1 仪器与试药 3 2 方法与结果 3 3 讨论o 0 00qo 4 茯苓 第三部分小半夏加茯苓汤颗粒剂制备 第一节小半夏加茯苓汤复方提取工艺 1 复方的方法学考查 1 1 仪器与试药 1 2 色谱条件 1 3 供试品溶液的制备 1 4 专属性考查 1 5 线性关系考察 1 6 精密度试验 1 7 稳定性考察 1 8 重复 1 9 加样 2 提取工 3 药效与 4 验证性 第二节小半 第三节成型 第四节制剂 第五节工艺 第六节中试 第四部分小半夏加茯苓汤颗粒剂的质量标准研究3 l 第一节质量标准起草说明3 1 1 仪器与试药3 1 1 1 仪器3 1 1 2 试药3 2 2 生状3 2 3 鉴别3 2 3 1 半夏的薄层鉴别3 2 3 2 生姜的薄层鉴别3 3 3 3 茯苓的薄层鉴别3 3 4 一般检查3 4 4 1 粒度0 q 3 4 4 2 水分3 4 4 3 溶化性3 4 56 一姜酚含量测定的方法学研究3 4 第二节质量标准草案4 0 第五部分颗粒剂药效学验证4 2 l 实验材料4 2 2 试验方法及结果4 2 总结与讨论：4 3 l 总结4 3 1 1 生姜中6 一姜酚的含量测定4 3 1 2 工艺研究”4 4 1 3 质量标准研究b oo t00 4 4 1 4 存在的问题4 4 2 创新点4 5 参考文献4 5 综述4 6 1 小半夏加茯苓汤的各家论述4 6 2 小半夏加茯苓汤方中各单味药研究概况4 6 3 小半夏加茯苓汤复方化学成分的研究4 8 4 小半夏加茯苓汤药理作用的研究4 9 5 小半夏加茯苓汤临床应用研究4 9 6 小半夏加茯苓汤现有剂型的研究- 5 0 7 小半夏加茯苓汤止呕机制的研究5 1 8 结 吾5 1 附录一生姜中6 一姜酚含量测定图谱0 0 0000 5 6 附录二小半夏加茯苓汤颗粒剂制备工艺图谱7 1 附录三小半夏加茯苓汤颗粒剂含量测定图谱7 5 附录四颗粒细度对于6 一姜酚溶出的正交结果8 8 附录五浸泡时间对于6 一姜酚溶出的f 交结果8 8 附录六伤寒杂病论中使用生半夏的方剂8 9 附录七致谢9 0 附录八个人简历9 1 贵阳中医学院硕士学位论文 摘要 呕吐是临床上多种疾病的常见症状之一，是由于胃失和降，气逆于上，胃中 之物从口吐出的一种症状。胃膳t l 焦，主受纳腐熟水谷，其气以降为顺，无论是外 邪、饮食、情志、脏腑失和，干于胃腑，导致胃失和降，均会导致呕吐的发， 三，但无 论是邪犯胃，或脾胃虚弱，发乍呕吐的基本病机在于胃欠和降，胃气上逆。小半 夏加茯苓汤出自张仲景金匮要略痰饮咳嗽病脉证并治第十二第3 0 、4 1 条n 1 。 原文云：“卒呕吐，心下痞，膈间有水。眩悸者，小半夏加茯苓汤主之”，“先 渴后呕，为水停心下，此属饮家，小半夏茯苓汤主之”。全方由半夏、生姜、茯 苓组成，主治痰饮所致的呕眩悸证。方中半夏辛温，归肺脾胃经，燥湿化痰，降 逆止呕，重用为君；生姜亦辛温。归肺脾胃经，长于温胃涤饮止呕合半夏增强 止呕降逆之功，是为臣；茯苓甘淡渗湿，归心脾肺肾经，引水下行，宁心益脾， 使水去脾健则痰饮无以由生，为佐使药。三药合用，共奏散饮降逆、和胃止呕之 功，由于其临床疗效卓著，本课题组拟将该方开发成中药止吐新药。为此，本课 题对小半夏加茯苓汤进行了复方的安全性考察和药效学研究，颗粒剂的提取工艺 研究、一成型工艺研究、颗粒剂质量标准研究以及药效学验证试验。 关键词：呕吐；小半夏加茯苓汤；生姜；6 一姜酚；制备工艺；质量标准 贵阳中医学院硕士学位论文 - _ - _ _ _ - - i _ - _ - - _ - _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ - - _ 。1 。一 a b s t r a c t a so n eo ft h ec o m m o nd i s e a s e s ，v o m i t i n gi sa l w a y se x p r e s s e di nt h ei n h a r m o n i c o ft h es t o m a c hf o r c e i m p r o p e rf o o d ，e m o t i o n ，c o l da l ea l lr e a s o n st ov o m i t i n g p i n e l l i aa n dp o f i ad e c o c t i o ni sc o m p o s e do fp i n e l l i aa n dp o r i aa n dg i n g e r p i n e l l i ai ss p i c y , f u n c t i o n i n ga st h es t o p p e ro fv o m i t i n g ，a n di ti st h em a i ne l e m e n t s ； g i n g e ri sa l s os p i c y , e n h a c i n gp i n e l l i a sv o m i t i n g - c o n t a i n m e n t ，w h i l e p o f i ai sm i l d ， u p l i f t i n gt h er e p o s et h eh e a r t w h e nt h e ya r ec o m b i n e di n t oap a t e n tm e d i c i n e ，t h e y c a nh a r m o n i z et h es t o m a c ha n ds t e mv o m i t i n g x i a o b a n x i aa d d e df u l i n gt a n gc o m e s f r o mz h a n gz h o n g j i n g ”g o l d e nc h a m b e r t a ny i nc o u g hc l o c kc a r d s a n d g o v e r n a n c e1 2 t h ”a r t i c l e3 0 ，4 1 t e x tg o e s ：”d e a t hv o m i t i n g ，x i n x i ap i ，t h e r ei s w a t e rb e t w e e nt h ed i a p h r a g m s d i z z yp a l p i t a t ew h ox i a o b a n x i aa d d e df u l i n gt a n g l o r d s ，v o m i ta f t e rt h ef i r s t ，t h i r s t yf o rw a t e rs t o p p e dh e a r t ，t h i si sa 嘶1 1 1 ( a th o m e ， s m a l lp i n e l l i a sf ul i n gt a n gl o r d s ”a l lp a r t i e sf r o mp i n e l l i a s ，g i n g e r , p e o r i a c o m p o s i t i o n ，a t t e n d i n g t a ny i n i n d u c e d v o m i t i n gd i z z yp a l p i t a t ec a r d f a n g s e m i s h a h e nt e m p e r a t u r e ，n o r m a l i z e db yt h el u n gs p l e e na n ds t o m a c h ，p h l e g m d a m p n e s s ，j i a n g n iv o m i t i n g ，r e u s ek i n ga n d ；g i n g e ri sa l s ox i nw e n o w n e db yt h e l u n gs p l e e n s t o m a c hw a s h d r i l l kw a r ml o n g e rt h a nv o m i t i n g t ob ed e v e l o p e di n t oan e wc h i n e s em e d i c i n e ，t h i sp a p e rc o n d u c t e dt h es a f e t y f o rc o m p o u n dr e c i p ea n ds o m eo fi t sp h a r m a c o d y n a m i cs t u d i e s ，as t u d yo ne x t r a c t i o n t e c h n o l o g yo fg r a n u l e ，o nm o l d i n gt e c h n i q u e ，o nq u a l i t ys t a n d a r do fg r a n u l e ，a n d o n v e r i f i c a t i o nt e s t i n g k e yw o r d s ：v o m i t i n g ；p i n e l l i a sa n dp e o r i ad e c o c t i o n ；g i n g e r ；6 g i n g e re s s e n c e ； p r o d u c i n gt e c h n o l o g y ；q u a l i t ys t a n d a r d 2 东汉名医张仲 ，方中半夏辛 归肺脾胃经， 渗湿，归心脾 肺肾经，引水下行，宁心益脾，使水去脾健则痰饮无以由生，为佐使药。三药合 用，达散饮降逆、和胃止呕之功。 历代医家广泛将小半夏加茯苓汤用于治疗各种原因引起的呕吐，近几年又有 人用于抗肿瘤化疗呕吐，均取得了较好疗效。鉴于此，对众多中医止呕复方进行 了系统研究，发现小半夏加茯苓汤是中药复方抗呕吐的核心配伍，组成该复方的 3 味中药均是贵州质量优、资源足的地道药材。因此，为将该复方研制开发成中 药止呕新药，前期已经进行了大量的基础研究工作，包括文献研究、止吐药效研 究、制剂制备工艺的优选、化学成分考察及药效物质基础的筛选等，取得较大的 研究进展。前期实验探讨了该复方颗粒剂的制备工艺，其药理实验证明复方颗粒 剂止吐药效达到原方同等药效，实验结果初步表明该复方中总生物碱是其药效物 质基础之一。 由于小半夏加茯苓汤原方为汤剂，有诸多不足，如煎煮时费工费时，服用时 口感欠佳，服用剂量大：不宜贮存，不宜携带等。而颗粒剂能弥补汤剂服药不方 便的缺点，口服后没有崩解过程，药物的溶出、吸收和奏效较快，味道可口、体 积小，服用、贮藏及运输均较方便：加入适当的矫味剂，对于不宜进药的患者， 口感好，更有益于服用。因此，本课题进一步研究该复方的成型工艺，将疗效确 切的小半夏加茯苓汤制成颗粒剂，使其服用方便，携带方便，便于控制药量和质 量。通过工艺筛选，完善质量标准，并进行急性毒理研究与药效学比较。将其研 制开发成一种工艺可行、质量稳定、安全高效及价廉的中药抗呕吐新药。为各种 呕吐患者有效治疗、减少经济负担作努力探索，并为贵州中药资源开发利用奠定 基础，具有极其重大的社会效益和经济效益。 具体研究内容如下： ( 1 ) 小半夏加茯苓汤安全性考察及药效学验证； ( 2 ) 质量控制指标的含量测定方法学研究； 贵阳中医学院硕士学位论文 _ 一一一 ( 3 ) 提取工艺的研究； ( 4 ) 成型工艺的研究； ( 5 ) 质量标准的制定； ： ( 6 ) 颗粒剂药效学验证。 通过以上研究，将小半夏加茯苓汤开发成生产工艺稳定、可行，质量可控， 疗效确切，服用携带方便、价廉的复方止呕颗粒剂，广泛应用于临床，给呕吐患 者带来福音，将产生良好的社会效益和经济效益。 4 安全性及药效 疗效甚佳。全方 中国药典2 0 0 5 版一部记载生半夏有毒，一般内服推荐使用炮制品，生品多为外用，那么，能否 将生半夏入煎内服呢? 虽然古人早有先例，如张仲景在伤寒杂病论中直接使 用生半夏配方，其中用于内服汤剂就有2 7 方( 其中2 l 方配有生姜) ，广泛用于外 感杂病及妇科病，现代关于生半夏内服治病的临床报道也不少，均未见中毒的报 道，但不符合2 0 0 5 版中国药典用药标准，对该方的应用是否安全仍有些疑 虑，严重影响了该方临床运用。为此，本实验按原方配伍成小半夏加茯苓汤给小 鼠灌胃，观察最大用药量，从而探讨小半夏加茯苓汤对小鼠的安全性。同时按原 方配伍给家鸽灌胃，观察呕吐潜伏期和呕吐次数，以确定方中使用哪种半夏为宣。 1 实验材料 1 1 药材 半夏购于贵州省赫章县半夏种植基地，茯苓购于贵州森泰实业有限公司( 贵 州茯苓g a p 生产基地建设实施单位，贵州省高技术产业茯苓复式栽培基地建设 实施单位) ，生姜为市售。经贵阳中医学院生药教研室王世清老师鉴定，半夏为 天南星科植物半夏p i n e l l i at e m a t a ( t h u n b ) b r e i t 的干燥块茎，生姜为姜科植物 姜z i n g i b e ro f f i c i n a l er o s c 的新鲜根茎，茯苓为多孔菌科真菌p o r i ac o c o s ( s c h w ) w o l f 的干燥菌核。 1 2 试剂 2 的硫酸铜溶液自配。化学试剂均为分析纯。 1 3 实验动物 家鸽，体重( 3 0 0 + _ 5 0 ) g ，购于贵阳市新路口蔬菜市场。小白鼠，体重 ( 2 0 0 5 0 ) g ，雌雄各半，购自贵阳医学院医学实验动物中心，合格证：0 2 0 0 3 7 2 ， 饲料为实验动物全价营养饲料，购自贵阳医学院医学实验动物中心。 2 实验方法及结果 5 2 1 急性毒性实验 2 1 1 受试动物的配 将小鼠雌雄分开 自然光源，排风扇通 自由摄取选择行为活 2 1 2 供试品溶液的 生半夏复方供试品溶液的制备：小半夏加茯苓汤处方：生半夏1 8 9 ，茯苓9 9 ， 生姜1 5 9 ，取3 剂，加水8 倍量，第一次煎煮1 5 h ，第二次和第三次煎煮1 h ，合并 煎煮液，浓缩至6 0 m l ，制备成每毫升含生药量2 1 9 的清膏，备用。 姜半夏复方供试品溶液的制备：小半夏加茯苓汤处方：姜半夏1 8 9 ，茯苓9 9 ， 生姜1 5 9 ，取3 剂，加水8 倍量，第一次煎煮1 5 h ，第二次和第三次煎煮l h ，合并 煎煮液，浓缩至6 0 m l ，制备成每毫升含生药量2 1 9 的清膏，备用。 生半夏单味药供试品溶液的制备：生半夏5 4 9 ，加水8 倍量，第一次煎煮1 5 h ， 第二次和第三次煎煮l h ，合并煎煮液，浓缩至7 0 m l ，制备成每毫升含生药量0 7 5 9 的清膏，备用。 2 1 3 方法及结果 2 1 3 1 方法 将小白鼠6 0 只，雌雄分丌，分为3 组，每组2 0 只，即生半夏单煎组，生半 夏复方组，姜半夏复方组，给药前禁食1 2h ，2 4h 内给药3 次，连续观察1 4 天。 详细观察记录小鼠行为活动、状态、饮食、大便、小便、毛色、分泌物及死亡等 情况。 2 1 3 2 结果 一般情况：灌胃给药后三组小鼠的外观体征未见异常，活动自如，迸食、饮 水、粪便呈湿润颗粒状均f 常，皮毛光洁，口、鼻、眼及肛门清洁无分泌物。1 4 天内无一只死亡，也无明显中毒反应，提示本品难以测出l d 5 0 。 体重变化情况：灌胃给药1 4 天，体重增加，生半夏单煎组、生半夏复方组 和姜半夏复方组给药前体重分别是( 1 9 0 9 + 3 5 0 ) g 、( 1 8 9 3 士2 3 2 ) g 、( 1 8 3 7 4 - 3 0 4 ) g ， 给药后体重分别是( 2 4 5 8 士5 5 2 ) g ，( 2 8 5 9 + 2 1 4 ) g ，( 2 3 0 1 + 2 8 5 ) g 。结果见表l 所 示。 6 贵阳中医学院硕士学位论文 表l小、| ，夏加茯苓汤人剂量给药对小鼠体莲影响的统计( x _ 4 - s d ) 结果：全部动物健存，测得小半夏加茯苓汤在受试药物量为每次给药7 0 9 k g 时也无明显中毒反应，为临床患者拟用量的1 0 0 倍。结论：小半夏加茯苓汤不管 方中使用生半夏还是姜半夏均对小鼠无明显急性毒性反应。 2 2 药效学研究 2 2 1 供试品溶液的制备 生半夏复方供试品溶液的制备：小半夏加茯苓汤处方：生半夏1 8 9 ，茯苓9 9 ， 生姜1 5 9 ，取5 剂，加水8 倍量，第一次煎煮1 5 h ，第二次和第三次煎煮1 h ，合并 煎煮液，浓缩，制备成每毫升含生药量1 9 浓缩液，备用。 姜半夏复方供试品溶液的制备：小半夏加茯苓汤处方：姜半夏1 8 9 ，茯苓9 9 ， 生姜1 5 9 ，取5 n ，加水8 倍量，第一次煎煮1 5 h ，第二次和第三次煎煮1 h ，合并 煎煮液，浓缩，制备成每毫升含生药量l g 浓缩液，备用。 2 2 2 家鸽呕吐模型的建立 采用硫酸铜溶液建立鸽子呕吐模型，以2 硫酸铜溶液1 4 0 m g k g 胃。在灌胃 后1 0 分钟左右，呕吐开始，说明造模成功。 2 2 3 实验方法及结果 家鸽。”2 0 只，随机分成3 组，姜半夏组7 只，生半夏组7 只，空白组6 只，实验 f i l f 4 h 禁食不禁水，均先以2 硫酸铜溶液1 4 0 m g k g 灌胃n 1 ，硫酸铜灌胃后立即用姜 半夏组以及生半夏组提取液以2 0 9 k g 生药量灌胃，空白组以凉开水灌胃。以家鸽 两翼稍抬，头部向前，上下伸脖，吐食或不吐食，继后抬头，恢复平静记为一次 呕吐。观察家鸽的呕吐潜伏期以及2 h 内的呕吐次数，作记录。实验结果用s p s s 软件多重比较进行分析，如表2 所示。 表2 药效学研究实验结果( x x ) 注：与空白对照组比较( 料p 0 0 1 ) 贵阳中医学院硕士学位论文 结果表明，在灌以硫酸铜以后，不给药而给予凉丌水，家鸽呕吐剧烈，造模 成功。经过s p s s 统计软件多重比较得出：在呕吐次数方面姜半夏复方组与生半 夏复方组对空白组都有显著性差异( p o 0 1 ) ，但是姜半夏组和生半夏组无明 显差异；在呕吐潜伏期方面生半夏组与空白组无差异，姜半夏组和空白组有显著 性差异( p 0 0 1 ) 。综合以上，姜半夏组的呕吐效果优于生半夏组。 3 讨论 3 1 在安全性实验中，一般来说，小鼠的给药量是人的1 0 0 倍以上而无毒性反应 才能算是安全的，在本实验中小鼠的给药量达到人最大给药量的1 0 0 倍，无半数 致死量。说明生半夏在方中的用量是安全的，为进一步研究小半夏加茯苓颗粒奠 定了基础。 3 2 在药效学研究中，姜半夏组和生半夏组与空白对照组比较，均有显著性差 异( p 0 0 1 ) ，说明姜半夏组和生半夏组均具有防治呕吐的作用。姜半夏组和 生半夏组比较，在呕吐次数方面没有显著性差异，但是姜半夏组能明显减少呕吐 潜伏期，总体来说，小半夏加茯苓汤方中用生半夏或姜半夏均具有防治呕吐的作 用，但姜半夏的止呕效果稍优于生半夏，因此在本课题的研究中，均使用姜半夏。 第二部分方中各味药材的质量研究 对小半夏加茯苓汤颗粒剂研制之前，我们首先对小半夏加茯苓汤中半夏、生 姜以及茯苓三味药材的质量进行了研究。 1 药材来源及鉴定 半夏购于贵州省赫章县科技局半夏g a p 生产基地，茯苓购于贵州森泰实业 有限公司( 贵州茯苓g a p 生产基地建设实施单位，贵州省高技术产业茯苓复式 栽培基地建设实施单位) ，生姜为市售。三味药经贵阳中医学院生药教研室王世 清老师鉴定：半夏为天南星科植物半夏p i n e l l i a 纪聊口幻( t h u n b ) b r a t 的干燥块 茎，生姜为姜科植物姜z i n g i b e ro f f i c m a & r o s e 的新鲜根茎，茯苓为多孔菌科真 菌p o r i ac o c o s ( s e h w ) w o l f 的干燥菌核。 2 半夏按照中国药典2 0 0 5 版一部“半夏”项下对半夏进行鉴别，符合要 求。由于本实验中使用姜半夏，因此将生半夏按照2 0 0 5 版中国药典一部要 贵阳中医学院硕士学位论文 求将其炮制成姜半夏。炮制方法如下：将生半夏分成大中小三档，分别置于3 个盆里，加水至淹没半夏2 e m - - 3 c m 处，浸泡3 天4 天，每天换水3 次，浸泡 至内无干心即可。另取生姜切片煮成姜汤，加入半夏和自矾共煮( 其中半夏：生 姜：白矾= 8 ：2 ：1 ) ，煮至半夏内无白心时，取出，拣出生姜片，晾至半干，干 燥即可。 3 生姜在中国药典2 0 0 5 版一部“尘姜”项下，只有对于生姜的外观性状 的说明，而对于其他项目并没有收载；通过文献资料显示，生姜中6 一姜酚是其 效用物质之一，也是止吐的主要有效成分，因此在本实验中对其有效成分6 一姜 酚进行了含量测定的方法学考察。 3 1 仪器与试药 仪器：c b 2 0 a 型高效液液相色谱仪，s p d 2 0 a 型紫外可见检测器；手动 进样；h t 2 0 型柱温箱；j a 2 0 0 3 型电子天平( 上海良平仪器仪表有限公司) ； a u y 2 2 0 型电子天平； 试药：6 姜酚标准品购于天津马克生物技术有限公司，经面积划一法测定纯 度为9 8 5 7 ，生姜均购于贵阳市蔬菜市场，经贵阳中医学院生药教研室王世清 老师鉴定为姜科植物姜z i n g i b e ro f f i c i n a l er o s c 的新鲜根茎。 试剂：甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余均为分析纯。 3 2 方法与结果 3 2 1 色谱条件嘲。 色谱柱：迪马d i a m o n s i lc 1 8 ( i i ) ( 5 9 m ，2 5 0 m m x 4 6 m m ) ；流动相：甲醇： 水= 6 5 ：3 5 ；检测波长：2 8 0 n m ；柱温：3 0 ；理论踏板数：不低于7 0 0 0 ；流速： 0 8 m l m i n 进样量：1 0 9 l 。 3 2 2 标准品溶液的制备 精密称取6 一姜酚标准品3 2 2 m g 于1 0 m l ，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得 浓度为0 3 2 2 m g m l 的6 一姜酚标准品溶液。 3 2 3 提取方法的研究 3 2 3 1 提取方法的确定 回流法：取生姜未o 5 9 ，精密称定，加入甲醇1 5 m l ，在水浴回流3 0 m i n ， 过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。 9 贵阳中医学院硕：上学位论文 超声法：取生姜末0 5 9 ，精密称定，j n 3 , o 醇1 5 m l ，超声3 0 m i n ( 6 0 k h z ) ， 过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。 取上述两种样品溶液1 0 9 l 注入到高效液相色谱仪中，测定峰面积，并计算 含量。结果如表3 所示。 表3 提取方法的确定 方法 取样鼍( g ) 峰面积含颦( m g g )平均值( m g g ) 0 5 0 7 27 3 7 6 9 0 2 4 2 01 同流法 0 5 0 5 37 2 0 4 8 82 3 7 4 0 2 3 4 2 9 0 4 9 6 06 6 2 2 7 32 2 218 0 4 9 9 9 3 2 8 5 411 0 9 3 5 超声法0 4 9 9 8 3 3 2 81 61 1 0 8 0 1 0 7 9 2 0 4 9 8 93 0 8 8 8 2 1 0 3 0 2 从表中直观分析可以看出，水浴回流提取6 姜酚的含量比超声提取时高将近 1 倍，因此采用回流法提取6 姜酚的含量。 3 2 3 2 回流时间的确定 取o 5 9 生姜末9 份，精密称定，加入5 0 倍溶剂甲醇( 2 5 m l ) ，1 ，2 ，3 号 回流0 5 h ，4 ，5 ，6 号回流l h ，7 ，8 ，9 号回流1 5 h ，放冷后补重，过滤，弃去 初滤液，取续滤液，注入高效液相色谱仪中，测得生姜中6 一姜酚的含量( 如表4 所示) 。 表4同流时间的确定 同流时间( h )取样龉( g )峰面积6 一姜酚含量( r a g g ) 平均值( r a g g ) r s d ( ) 0 5 1 7 93 2 4 1 5 1 2 6 0 3 6 0 50 5 0 0 131 4 4 6 9 2 6 l5 82 6 4 7 6 2 3 7 0 5 0 9 6 3 318 4 62 7 0 8 8 0 4 9 9 23 0 9 2 7 5 2 5 7 7 2 10 4 9 8 7 3 0 7 0 9 72 5 615 2 58 0 50 6 4 0 5 0 8 9 31 6 7 0 l2 5 8 8 7 0 5 0 0 53 2 8 8 8 7 2 7 3 3 4 1 50 5 0 3 33 2 6 7 6 7 2 7 0 0 7 2 7 2 310 6 0 0 5 0 4 63 2 9 9 8 0 2 7 2 0 2 从表中直观分析可以看出：5 0 倍溶剂回流时，回流1 5 h 的含量高于回流0 5 h 和1 h 。鉴于此，需要考察1 5 h 和2 h 的含量，结果如表5 所示。 表5 同流时间1 5 h 和2 h 比较 同流时间( h ) 取样昔( g ) 峰面积 6一姜酚含鼍(mgg- ) w 1 5 0 5 0 3 2 3 2 4 2 8 32 7 1 0 4 20 5l9 7 3 3 9 2 7 5 2 7 4 9 9 从表中可以看出，当回流时间为1 s h 和2 h 时，生姜中6 一姜酚的含量没有显 l o 贵阳中医学院硕士学位论文 著性差异，鉴于提取效率和经济方面的考虑，6 一姜酚的回流时间确定为1 5 h 。 3 2 3 3 溶剂浓度的确定 取生姜术o 5 9 9 份，精密称定，加入5 0 倍溶剂( 2 5 m l ) ，1 ，2 ，3 号用5 0 9 6 甲醇回流1 5 h ，4 ，5 ，6 号用7 0 甲醇回流1 5 h ，7 ，8 ，9 号用9 0 甲醇回流1 5 h ， 补重，过滤，弃去初滤液，取续滤液，备用。测得尘姜中6 一姜酚的含量( 如表6 所示) 。 表6溶剂浓度的确定 从表中直观分析以及多重比较得出：5 0 甲醇、7 0 甲醇和9 0 甲醇回流时6 一 姜酚的含量没有显著性差异，出于经济方面的考虑，选用浓度为5 0 的甲醇作为 提取溶剂。 3 2 3 4 溶剂倍数的确定 取0 5 9 生姜木9 份，精密称定，用5 0 9 6 甲醇溶液，1 ，2 ，3 号用3 0 倍溶剂 回流1 5 h ，4 ，5 ，6 号用4 0 倍溶剂回流1 5 h ，7 ，8 ，9 号用5 0 倍溶剂回流1 5 h ， 补重，过滤，弃去初滤液，取续滤液，备用。测得生姜中6 一姜酚的含量( 如表7 所示) 。 表7 溶剂倍数的确定 贵阳中医学院硕士学位论 从表中直观分析可以看出：5 0 倍溶剂回流时，6 倍溶剂，因此需要考察6 0 倍溶剂时6 一姜酚的含量，实验结果如表8 所示。 表85 0 倍溶剂和6 0 倍 容荆的比较 从表中可以看出，5 0 倍溶剂和6 0 倍溶剂提取出的6 一姜酚的含量没有显著性 差异，从经济可行的角度考虑，本实验采用5 0 倍溶剂作为6 姜酚提取溶剂倍数。 综上可以得出，提取生姜中的6 一姜酚时最佳的提取方法是：加入取样量5 0 倍的5 0 甲醇，回流1 5 h ，过滤，弃去初滤液，取续滤液。 3 2 3 5 验证性实验 以优选出的最佳的提取工艺，即加入5 0 倍的5 0 甲醇，回流1 5 h ，取生姜 末3 份，每份o 5 9 ，精密称定，加入2 5 m l 5 0 的甲醇，精密称定，回流1 5 h ， 放冷，补足失重，过滤，弃去初滤液，取续滤液，测定峰面积，并计算6 一姜酚 的含量，结果如表9 所示。 表9 验证性实验 从表可以看出，实验结果较为理想，说明该工艺条件稳定可行。 3 2 4 含量测定的方法学考察 3 2 4 1 供试品溶液的配制 取生姜末0 5 9 ，加入5 0 的甲醇溶液5 0 m l ，在下回流1 5 h ，补重，过滤后 弃去初滤液，取续滤液，即得样品溶液。进样前用0 4 5 n 的微孔滤膜过滤。色 谱图如图1 所示，样品溶液在与6 一姜酚标准品出峰时间相同的地方出峰。 m 榆v 泓嶙a ：2 8 0 n m 4 0 c 3 0 j 1 2 m i 二d一一 一 嘛爵酊r l _ 二=；a 芦 ：n一一爱 2 ； 舱 伧一 o 贵阳中医学院硕士学位论文 $ o r n f v t 溯i 器a ：2 8 0 n m + 一一一 一一 j 2 5 禽 j耐 j t - o 上二一二二_ 一一二二= = 二二：二二。一 一 一 二 o o5 o 1 0 o 1 5 0 2 0 o 2 5 om i n b 图1a 为样品的色谱图b 为标准品色谱图 3 2 4 2 线性关系的考察 取同一浓度的6 一姜酚标准品溶液( o 3 2 2 m g m l ) ，分别吸取0 1 m l ，0 2 5 m l ， o 5 m l ，o 7 5 m l 于l m l 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得不同浓度的 标准品溶液，每一浓度分别进样i o l a l ，以峰面积( y ) 为纵坐标，以进样量( x ) 为横坐标做线性回归，得回归方程为y - - 6 0 9 5 5 9 2 2 2 x 2 2 7 0 4 ( f 0 9 9 9 9 ，n = 5 ) ， 表明6 一姜酚的含量在进样量为0 3 2 2 9 9 - - 3 2 2 斗g 范围内与峰面积呈良好线性关 系。数据及标准曲线图如表1 0 及图2 所示。 、 表l o 线性关系峰面积表 z b u u u u u 2 0 0 0 0 0 0 l i 撵 曲1 5 0 0 0 0 0 拳1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 o0 5l1 522 533 5 进样量x ( 鹏) 图2 标准曲线图 3 2 4 3 精密度试验 吸取浓度为0 0 8 0 5 m g m l 的对照品溶液，重复进样6 次，每次为1 0 9 l ，记 录峰面积，计算r s d 值为0 6 8 。结果如表1 1 所示。 表l l 精密度试验 从表l l 中可以看出，仪器的精密度良好。 表1 4 加样闸收率试验结果 取样簧( g ) 样晶中6 一姜酚加入标品的耸测定结果 【亓l 收率平均同收r s d 的含鼙( m g ) ( r a g ) ( r a g ) ( )率( ) ( ) 0 2 5 9 9 1 0 7 4 70 9 6 6 02 0 6 0 3 l0 3 0 0 0 2 5 8 4 1 0 6 8 50 9 6 6 02 0 5 7 5 1 0 3 4 0 0 2 5 7 6i 0 6 5 2 0 9 6 6 02 0 2 9 0 1 0 0 7 0 0 2 4 8 61 0 2 8 0 1 0 4 6 52 0 3 0 4 9 6 8 4 o 2 5 31 1 0 4 6 61 0 4 6 5 2 0 6 0 89 7 9 29 9 4 8 2 7 8 0 2 5 9 11 0 7 1 4 1 0 4 6 52 1 2 6 9 1 0 1 9 0 0 2 4 3 01 0 0 4 81 2 0 7 52 16 4 1 9 7 0 l 0 2 4 8 21 0 2 6 3 1 2 0 7 52 1 7 8 69 6 4 2 o 2 4 9 91 0 3 3 31 2 0 7 5 2 2 0 5 49 8 i1 - l _ _ - _ - l _ l i 一- _ _ - _ _ - _ _ _ _ l _ _ - - i _ - - - l l - _ _ _ - l 一- _ _ l _ _ _ _ _ - i _ i _ _ _ _ 一- _ i l _ _ _ i - _ - - i _ _ _ - i - _ 一 1 4 贵阳中医学院硕士学位论文 结果表明，平均回收率分别为9 9 4 8 ，r s d 值分别为2 7 8 ，方法回收率良 好。 3 2 4 7 药材的含量测定 在贵阳市蔬菜市场不同时间不同地点购买6 批生姜。按照供试品溶液制备方 法，配置6 个不同批次生姜的供试品溶液，按2 1 所示色谱条件测试，记录峰面 积，计算6 一姜酚的含量见表1 5 。 表1 5样品测定结果 从表1 5 中可以看出，不同批次的生姜因为其产地、保存和采收季节的不同 而有很大差异，其平均值为2 9 2 9 9m g g 。 3 3 讨论 3 3 1 提取方法的选择本实验比较超声提取法和回流提取法，数据显示回流提 取法时6 一姜酚的含量约为超声提取法的两倍。因此采用甲醇回流提取法。 3 3 2 流动相的选择本实验中通过比较乙腈：水= 4 5 ：5 5 ，甲醇：水= 6 5 ：3 5 两个流动相，两者均出峰时间适当，分离度好，但出于经济的考虑，乙腈价格昂 贵，所以不采用乙腈：水= 4 5 ：5 5 ( 1 0 m l m i n ) ，而采用甲醇：水= 6 5 ：3 5 ( 0 8 m l m i n ) 作为流动相。 3 3 3 生姜质量差异及所含水分实验中的生姜均为市售，产地和批次有很大差 异，通过试验中的数据显示，不同产地和批次以及含水量对生姜中6 一姜酚的含 量有极大影响。对于这些应该进行深一步的研究。 3 3 4 生姜中6 一姜酚含量限度通过对6 批生姜中6 一姜酚的含量测定表明，6 一 姜酚的平均含量应为2 9m g g ，在此基础上向下浮动2 0 ，作为生姜质量的最低 限度，即不低于2 3m g g 。 4 茯苓按照0 5 版中国药典“茯苓”项下要求对其进行鉴别，符合要求。 贵阳中医学院硕士学位论文 第三部分小半夏加茯苓汤颗粒剂的制备工艺研究 第一节小半夏加茯苓汤复方提取工艺的研究 按照新药的研究和申报的要求，复方的提取工艺的研究必须综合有效成分的 含量测定和药效的考察两部分内容，因此本课题中小半夏加茯苓汤复方的提取工 艺的优选以6 姜酚的含量与药效学指标呕吐潜伏期和呕吐次数的综合加权总分 为指标。本课题先对小半夏加茯苓汤中6 姜酚的含量测定做了方法学考察，然后 在6 姜酚的含量和药效两方面对其最佳的提取方法进行优选。 1 复方的含量测定方法学考察 1 1 仪器与试药 1 1 1 仪器 同本岛津a u y2 2 0 电子天平，同本岛津l c 一2 0 a t 高效液相色谱仪( 检测 器：s p d - 2 0 a 检测器) ，j a 2 0 0 3 型电子天平( 上海良平仪器仪表有限公司) ； 1 1 2 试药 半夏购于贵州省赫章县科技局半夏g a p 生产基地，茯苓购于贵州森泰实业有 限公司( 贵州茯苓g a p 生产基地建设实施单位，贵州省高技术产业茯苓复式栽培 基地建设实施单位) ，生姜市售；甲醇( 色谱纯，江苏汉邦科技有限公司) 、甲醇 ( 分析纯，江苏汉邦科技有限公司) 、纯净水、6 一姜酚标准品( 天津马克生物技 术有限公司，批号：2 0 0 8 1 0 1 5 ，经校f 纯度= 9 8 5 7 ) 。 1 2 色谱条件 色谱柱：安捷伦t c - c 。( 2 5 0 m m x 4 61 t i m ，5 1 , t i n ) ；流动相：甲醇：水( 6 5 ：3 5 ) ； 检测波长：2 8 0 n m ；流速：0 8 m l m i n ；柱温：3 0 ；理论塔板数：不低于7 0 0 0 。 1 3 供试品溶液的制备 1 3 1 标准品溶液的制备 取6 一姜酚标准品2 2 7 m g 置于1 0 m l 的容量瓶中，加入甲醇，摇匀，得到浓 度为0 2 2 7m g m l 的标准品溶液。取浓度为0 , 2 2 7m g m l 的标准品溶液8 m l ， 置于1 0 m l 容量瓶中摇匀，制成浓度为o 1 8 1 6 m g m l 的6 一姜酚标准品溶液。 1 3 2 样品溶液的制备 取半夏、生姜、茯苓各1 8 9 、1 5 9 、9 9 ，将生姜切成细丝，加8 倍量水，浸 1 6 贵阳中医学院硕士学位论文 泡半个小时，煎煮提取3 次，每次1 5 h ，过滤，合并提取液，定容至5 0 0 m l ， 进样前用0 4 5 9 m 的微孔滤膜过滤。 1 3 3 阴性对照溶液的制备 由于方中使用经过炮制的姜半夏，通过试验得出，姜半夏中含有少量6 一姜 酚，色谱图如图3 所示。因此，本实验采用双阴性作为阴性对照。取茯苓9 9 ， 按照样品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。 a b 图3a 为姜、卜复色谱图b 为含姜半夏的阴性对照溶液色谱图 1 4 专属性考查取标准品溶液、样品溶液以及阴性对照溶液各1 0 1 t l ，注入到高 效液相色谱仪中，结果表明，供试品溶液在与6 一姜酚相同的时间出峰，阴性对 照无干扰峰出现。色谱图如下。 1 7 a 贵阳中医学院硕士学位论文 b c 图4a 为标准品色谱图b 为样品溶液色谱图c 为阴性对照溶液色谱图 1 5 线性关系考察 将浓度为0 1 8 1 6 m g m l 的6 一姜酚标准品稀释成浓度分别为0 0 1 1 3 5 m g m l 、 0 0 2 2 7 m g m l 、0 0 4 5 4 m g m l 、o 0 9 0 8 m g m l 、0 1 3 6 2 m g m l _ 五个浓度，精密吸取 不同浓度6