（临床兽医学专业论文）伪狂犬病病毒gE基因在大肠杆菌中的表达.pdf

摘要 伪狂犬病病毒是疱疹病毒科、q 一疱疹病毒亚科的成员，可以引起猪、牛、羊及野生动物 的伪狂犬病( 又称a u j e s z k y 氏病) ，猪是该病毒的天然宿主、也是主要感染源e 伪狂犬病给 养猪业造成了巨大经济损失，其危害仅次于猪瘟和口蹄疫。作为主要的诊断抗原，伪狂犬病 病毒糖蛋白e ( g l y c o p r o t e i n ，g e ) 在伪狂犬根除计划中发挥重要的作用。 为获得大量的、成本较低的诊断抗原，本研究利用大肠杆菌表达系统对伪狂犬病病毒g e 主要抗原区域进行了表达，为g e - e l i s a 试剂盒的研制提供一定的理论依据和借鉴。本研究 主要内容： 根据g e n b a n k 中伪狂犬病毒g e 基因序列，设计了一对引物，p c r 扩增长度为5 5 8 b p 的 g e 基因去信号肽后的主要抗原区域( 1 5 7 - - 7 1 4 b p ) ，将其克隆进测序载体p g e m - t e a s y 中， 成功构建质粒p g e m t e a s y g e 。用b a m h l 和h i n d l l i 将g e 基因主要抗原区域从p g e m - t e a s y 中切出，然后与同样酶处理的原核表达载体p e t 3 2 a 连接，命名为p e t - # 。 在i p t g 的诱导后，经s d s p a g e 电泳发现4 3 k u 处出现特异性蛋白条带。 研究了目的蛋白表达量与各个培养条件的关系，优化后的最佳表达条件为i p t g 浓度为 l m m ，诱导时问为5 小时时的蛋白表达量最大。 经过w e s t e r n - b l o t 分析，表达产物具有很好的抗原性。 该研究成功表达出具有抗原性的目的蛋白，为血清学鉴别诊断方法g e e l i s a 的建立打 下很好的基础，同时g e e l i s a 也能对野毒和疫苗毒进行鉴别。 关键词；伪狂犬病病毒；主要抗原区域； i p t g e x p r e s s i o no f p s e u d o r a b i e sv i r u sg l y p r o t e i nei nec o l i a b s t r a c t p s e u d o r a b i a sv i r u s ( p r y ) ，i sam e m b e ro fa l p h a h e r p e s v i r i n a e ，h e r p e s v i r i d a e ，w h i c hc a l lc a u s e a u j e s z l q , sd i s e a s ei ns w i n e ，b o v i n e ，s h e e pa n dw i l da n i m a l s p r vi n f e c t i o nc o u l dc a u s ei t sn a t u r a l a n dm a i ns t o r i n gh o s t s w i n e ( a i s oi t sm a i ni n f e c t i o u so r i g i n a t i o n ) ah u g el o s e s ，t h em o s th u g e e c o n o m i c a ll o s ei na l ls w i n ei n f e c t i o u sd i s e a s e se x c e p ts w i n ep l a g u ea n da f t o s a g l y p r o t e i neo f p s e u d o r a b i e sv i r u si sk n o w nt ob ea ni m p o r t a n td i a g n o s t i ca n t i g e ni np s e u d o r a b i e se r a d i c a t i o n c a m p a i g n i no r d e rt oo b t a i nt h e 庐a n t i g e ni nl a r g eq u a n t i t ya n da tal o wc o s t ，ag e n ef r a g m e n te n c o d i n g t h em a i na n t i g t i cd o m a i n ( 1 5 7 7 1 4 b p ) o f p r vg ew i t h o u ts i g n a lp e p t i d ew a se x p r e s s e di nec o l i e x p r e s s i o ns y s t e m t h i ss t u d ym a ys u p p l yt h e o r e t i c a le v i d e n c ef o re s t a b l i s h m e n to f g e - e l i s a u s i n gap a i ro fp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt o t h er e v e l a n tn u c l e o t i d es e q u e n c ef r o m g e n b a n k , t h es p e c i f i cg e n e se n c o d i n gt h em a i na n t i g e t i cd o m a i n so fp r v 醴w e r ea m p l i f i e d t h e p c rp r o d u c t so f5 5 7 b pw e r ec l o n e di n t ot h e s e q u e n c i n gv e c t o r sp g e m - t e a s y t h ep l a s m i d p g e m t e a s y g ew a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y c u to u tt h em a i na n t i g e t i eo fp r vg ef r o m p g e m t e a s y - g ew i t hb a m h ia n dh i n d l l i ，a n dl i n k e dw i t hp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 a w h i c hh a sb e e nc u tb yt h et w oe n z y m eb e f o r e h a n d t h ep l a s m i dc o n s t r u c e dw a sn a m e dp e t - 蛆 a f t e ri n d u c e db yi p t g as p e c i f i cs t r i po f 4 3k ua p p e a r di ns d s p a g e a c c o r d i n gt ot h es t u d yo nt h er e l a t i o n s h i pb w t e e ne x p r e s s i o nq u a n t i t yo fp r o t e i na n dr e v e l a n t c u l t i v a t i n gc o n d i t i o n s , t h eo p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o nw e r e ：5h o u r si n d u c i n gr a n g e , t h e1m m c o n c e n t r a t i o no f l p t g o na n a l y s i sb yw e s t e r n - b l o t ，t h ee x p r e s s i o np r o d u c th a sg o o da n t i g e n i c i t y t h et a r g e t p r o t e i n w i t ha n t i g e n i c i t yw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi nt h es t u d y 1 tl a i dt h e f o u n d a t i o nf o rt h ee s t a b l i s h m e n to ft h ed i a g n o s t i cm e t h o do fs e r o l o g yg e - e l i s a ，w h i c hc a nt e l l v a c c i n ev i r u sf r o mv i r u l e n c ev i r u s k e yw o r d s ：p r v m a i na n t i g t i cd o m a i n i p t g p o s t g r a d u a t e ：s u nd e g a n g s p e c i a l i t y ：c l i n i c a lv e t e r i n a r ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：h u a n gb a n x u i i 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 饱人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；如塑直基地盘噩缱别直盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 日期：z ，辟朋6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：西归诚 导师签名： 秀备缮 厂 6 月 月 厂，6 年 年 0 f 唧 矿 弘 肌 期 日 日 1 引言 1 1 伪狂犬病病毒研究进展 伪狂犬病( p s e u d o r a b i e s ，p r ) 是由伪狂犬病病毒( p s e u d o r a b i e s v i r u s ，p r v ) b i 起的多种家畜 和野生动物的以发热、奇瘁( 除猪外) 、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病，可引发妊娠母猪 流产，死胎以及呼吸道症状。该病在猪群中具有传播快、死亡率高、流行范围广、传播途径 多、病原体顽固等特点 1 9 世纪在美1 哥( 1 8 1 3 ) 、瑞士( 1 8 4 9 ) 报道了这种类似于狂犬病的“伪狂犬病”。1 9 0 2 年由匈 牙利学者a u j e s z k s 证明本病不是狂犬病；1 9 1 0 年确定为病毒；1 9 3 4 年确定为疱疹病毒。1 9 6 2 年以前，伪狂犬病对猪还是相当温和的，病例也比较少见，在7 0 年代初期，p r 流行有所增 加。现在己有4 0 多个国家报道4 0 多种动物感染该病，遍及欧洲、东南亚、南美洲、中美洲 和非洲我国自1 9 4 7 年首次发现本病，己有2 0 多个省市报道发生此病。我国是世界上养猪 最多的国家之一，养猪业在国民经济中占有重要的地位。猪是该病的主要宿主和传染来源， 目前给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟和口蹄疫( 彭志领，1 9 9 7 ) 此病的发生和流行有以 下特点：孕母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎；新生仔猪在生后两周内大量死亡：断奶仔猪的 腹泻及神经症状；母猪返情屡配不孕；育肥猪生长迟缓，饲料报酬降低。任何年龄的猪耐过p r v 急性感染后，均能形成潜伏感染，在一定的条件下。潜伏状态的病毒能被激活，引起再次感 染并向外散毒，世界动物卫生组织( o i e ) 将其列为b 类传染病。导致母猪繁殖障碍的病毒性疾 病都是国际生猪贸易的重要检疫对象，经常成为国际贸易壁垒的口实，严重制约了我国生猪 及其产品的对外出口。根据发达国家的经验，对于疫病的根本防制措施是实施扑灭计划，培 养清净猪群以伪狂犬病为例，该病十年前在许多国家流行率很高，经过十余年的努力，欧 盟部分成员国、新西兰、我国台湾、美国大部分少州，均成功地消灭了此病。这些国家和地 区无不受惠于扑灭计划的成功，不仅节省了大量的防疫费用，而且抢滩了生猪和猪肉制品的 国际市场。 1 1 1 病原学 1 1 1 1 病原分类 根据国际病毒分类委员会o c t v 摘毒分类报告，伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科，a 一疱 疹病毒亚科，猪疱疹病毒i 型( 陆承平，2 0 0 1 ) 伪狂犬病病毒的宿主包括除高等灵长类动物 和人以外的所有哺乳动物及其它脊椎动物，自然条件下约4 0 种动物可感染发病。猪是该病重 要的病毒贮存宿主和传染源。 东北农业大学农学硕士学位论文 l 1 1 2 病毒粒子结构 p r v 的病毒粒子结构与所有其它疱疹病毒一样，是由含有基因组的核仁、含有1 6 2 个 壳粒的正二十面体的衣壳、蛋白质的皮层以及来自细胞膜的含有病毒编码( 糖) 蛋白的腊质 双层囊膜构成。衣壳是在1 2 个顶3 0 个棱的支架结构基础上形成的，这个支架结构可被蛋 白酶水解，并失去与其相伴形成衣壳前体的基因组d n a 。p r v 皮层在电镜照片中表现为 不定形的电子致密结构，位于衣壳和囊膜之间。 1 1 1 3 病毒基因组 p r v 的基因组是双股线性d n a ，其基因组估计能编码1 0 0 多种蛋白质，成熟的病毒粒 子携带有约5 0 多种蛋白质，大小约1 5 0 k b ，g + c 含量高达7 3 。病毒基因组由长独特n ( t r b ) 和短独特区叫s ) ，以及u s 两侧的末端重复序列( 1 r ) 与内部重复序列( 1 r ) 所组成。u s 区的方 向可与u l 区一致，也可以相反，从而有两种异构体。 目前p r v 基因组中已有6 5 种基因被定位，其中大多数基因的功能己搞清。这些基因可 编码结构蛋白、转录调节因子、毒力蛋白、酶类与病毒d n a 复制、病毒释放有关的蛋白以 及作为复制结合起点。在i l l 区已被定位的基因有5 6 种。包括了已被测序的糖蛋白g b 、g c 、 g h 、g k 、g l 、g m ，g n 基因、t k 基因等；u s 区己被全部测序，其中被定位的基因有7 种：糖 蛋白g d 、g e 、g g 、g l 基因等；在i r 区段中已被鉴定和测序的基因是立即早期基因( i e l 8 0 ) 和 r s p 4 0 。接近一半的a 一疱疹病毒的基因被认为是非必需的，即他们对病毒的复制是不必要 的。 1 1 2 病毒囊膜与糖蛋白 p r v 囊膜是从高尔基体跨膜区的囊泡中获得的，多数经糖基化修饰，形成糖蛋白。到 目前，在p r v 中己发现1 1 种糖蛋白，根据疱疹病毒糖蛋白的命名法统一命名为g b 、g c 、 g d 、邸、g g 、g h 、寸、g k 、g l 、g m 和g n g - r a n z o w , 1 9 9 7 w h e r l y , 1 9 9 1 ) 研究发现，他们 在病毒与细胞的相互作用，病毒感染的病理过程和免疫原性中各具特殊作用。除了g g 在 p r v 感染细胞过程中大量产生并分泌至培养基外。所有其它这些糖蛋白都是病毒囊膜的构 成成分。 1 1 1 2 1 必需糖蛋白 g b 位于p r v 基因组的u l 区，长约2 8 k b ，为g n a 、g l i b 、g i l c 三种糖蛋白通过二硫 键连接的复合体，均来源于g b 基因编码的同一蛋白前体。g b 是在所有糖蛋白中最保守的， 为p r v 的一种主要糖蛋白和主要免疫原。g b 是病毒的一个重要囊膜组分和中和抗原，对 于病毒的感染必不可少( f a v o r e e l ，2 0 0 2 ) 。不同病毒株的g b 存在抗原差异。g b 主要作用：( 1 ) 病毒穿入过程中非感染细胞膜与细胞膜的融合；( 2 ) 核衣壳向细胞质中释放时，病毒粒子囊膜 与外膜的融合；感染细胞与非感染细胞之间细胞膜的融合。研究表明抗g b 的免疫学反应 在保护猪免受p r v 感染中起着重要作用。 g d 为病毒的主要中和抗原，g p 基因的开放阅读框( o r f ) 长为1 2 0 6 b p ，其o r f 编码 2 4 0 2 氨基酸的蛋白质，分子量大小为5 0 - - 6 0 k d ( k a r g e r ，1 9 9 6 ) 。g o 具有糖蛋白固有的特征( 包 括信号肽，跨膜区以及与细胞膜受体结合部位) 。g o 能识别另类细胞表面受体一脊髓灰 质炎病毒受体家族，介导病毒与靶细胞的稳定结合，参与病毒感染的穿入过程，是病毒复 制和细胞融合所非必需的( g e r a g h t y ，1 9 9 8 ) 。研究推断g d 不舍n 一糖基化结构，而是以 。一糖基化形式存在的( e l i o i t ，1 9 8 8 ) 。p r v 在感染细胞时，首先是g c 与细胞表面的蛋白 多糖结合，其次是g d 与之牢固结合，所以g d 为病毒感染必须的结构蛋白。并参与病毒的 穿透过程，而且是病毒囊膜与胞浆膜融合必不可少的，但与其它疱疹病毒的g d 相反， p r v g d 对于感染细胞与邻近非感染细胞的融合是非必须的g d 是一种重要的中和抗原， 是保护性抗体的主要目标抗原。 g l 糖蛋白的基因位于p r v u l 区，大小为2 0 5 8 b p ，编码6 8 6 个氨基酸，g h 糖蛋白为 病毒复制所必需的结构蛋白，对于病毒侵入靶细胞或感染细胞与邻近细胞的融合，以及在 小鼠神经系统中的增殖均是必需的( p e e t e r s ，1 9 9 2 k l u p p ，1 9 9 7 ) 。 西对应于u u ，紧邻艰区段，其o r f 编码1 5 6 个氨基酸，分子量为2 0 k d 。g l 对病 毒的穿入和在细胞间的传递是必需的g l 与g h 样，均为疱疹病毒共同的保守膜糖蛋白。 g k 对应于u l 5 3 ，对其功能的研究还较少，仅知道g k 是病毒必需的结构成分，g k 对 抑制刚刚释放的病毒子再次融合原细胞起重要作用，而对病毒豹吸附、导入等无明确作用 ( k l u p p ，1 9 9 8 ) 最近的研究表明，g b 、g d 、g h 和g l 是病毒进入细胞所必需的t 尤以g d ，g h 二聚体 的作用最为重要( c a i r n s ，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 2 非必需糖蛋白 g c 基因位于p r v 基因组的u l 区，长为1 4 3 7 b p ，含4 7 9 个氨基酸残基，在感染细胞中 以具有n 一糖基化的7 4 k d 前体及9 2 k d 成熟糖蛋白两种形式存在。g c 是病毒的一种主要糖 蛋白但并不是病毒感染所必需的，能诱导细胞的免疫应答且为病毒的主要中和抗原之一。g c 的主要作用是通过吸跗感染靶细胞，影响病毒在传播中的释放，g c 的缺失或细胞上肝素结构 的破坏都可明显降低p r v 的吸附能力，g c 对病毒吸附和释放这两个功能的影响是相互作用 的。g c 虽然不是病毒体外生长的必需成分，但在病毒分子生物学上占有非常重要的地位。 g g 糖蛋白基因位于p r v 基因组的u s 区，长为1 4 9 4 b p ，编码4 9 8 个氨基酸。g g 不在病 毒粒子上，而由感染病毒的细胞分泌。对于病毒的吸附，穿透以及从细胞到细胞的扩散均是 非必需的( w a t h e n ，1 9 8 6 c r a b b , 1 9 9 2 ) 。与缺失g e 基因相比缺失g g 基因的疫苗受母源抗体的 影响很小( f i r k i n s ，1 9 9 7 ) 。g g 对毒力的影响目前还缺乏进一步的详细资料( d e m m i n ，2 0 0 1 ) 。 g m 与g n 是以异源二聚体的形式存在，是最近才被发现的两种非必需微量糖蛋白，在疱 疹病毒中较保守( d 0 k s t r a , 1 9 9 6 ) 。g m 在病毒感染初期有一定调理作用，g n 与病毒穿入有关。 1 1 2 3g e 基因及其生物学特性和意义 g e 基因位于p r v 基因组的u s 区，前接掣基因，后连1 1 k 基因。长约1 7 3 1 b p ，编码约 5 7 7 个氨基酸，7 5 的c r + c 含量。9 8 的基因密码的第3 位点是g 或c 。其蛋白的1 2 是丙 氨酸，1 1 是脯氨酸，8 是甘氨酸，8 是精氨酸。g e 糖蛋白是典型的i 型膜蛋白，即：多肽 链在膜内穿越一次，n 端4 0 3 个氨基酸组成胞外区，中间4 7 个氨基酸( 绝大多数是疏水氨基 3 东北农业大学农学硕士学位论文 酸) 组成跨膜区，c 端的1 2 3 个氨基酸组成胞内区。其中g e 糖蛋白的胞外区含有与g i 糖蛋白 相结合的位点。g e 糖蛋白的胞内区由1 0 0 多个氨基酸组成，通过对感染的细胞研究发现，g e 胞内区存在两个保守的特征性的氨基酸残基，基序为y x x l ，其中y 为酪氨酸，x 为任意氨 基酸，l 为疏水性氨基酸该序列对病毒糖蛋自在细胞膜上的分布及信号在细胞内的传导有 重要作用，尤其是近膜端的。4 7 8 位和5 1 7 位的酪氨酸残基( t i r a b e s f i ，1 9 9 9 ) 。瘟是一种促进 细胞融合的糖蛋白，能促进感染细胞与临近非感染细胞的融合，介导病毒从细胞到细胞之间 的扩散。同时庐糖蛋白还能影响p r v 在猪体内的组织趋向性。从而有助于p r v 向中枢神经 系统扩散( t i r a b a s s i ，1 9 9 8 t i m b a s s i ，1 9 9 7 , v a nd ew a l l e ，2 0 0 3 ) 。s p i r i d o n 等( s p i r i d o n ，1 9 9 4 ) 1 i 旰究结 果证明k a g e - - 突变株对神经的侵袭性最弱仅能到达第二神经级，这说明锫蛋白g e 和西 对p r v 在神经系统侵袭和传播中起着一定作用，尤其匝塘蛋白更重要。 p r v 的醇糖蛋白的抗原表位已经初步分析清楚。最主要的5 个抗原表位定位在西蛋白 的前2 3 8 个氨基酸，3 个定位在5 2 - 1 2 3 的氨基酸，2 个定位在7 8 2 3 8 的氨基酸( lhr o s s l a i ，t 9 9 5 ) 。西蛋白的氨基酸序列中第1 2 5 位的缬氨酸和第1 2 6 位的半肤氨酸对病毒的生物学 功能有重要的影响。缺失它们能降低病毒的毒力嗜神经性，但不影响免疫原性。并且产生的 弱毒株相对于缺失整个g 届株来说产生的病毒蚀斑更小，对鼠的毒力更低。l i e s b e t h 报道，g 呈 某些抗原表位是构象型依赖性抗原。它们的单抗能与整个g e 糖蛋白反应，但不与重组质粒 p e x 表达的相应的抗原表位蛋白反应。研究g 骂韵m a b s 发现不同的个体猪对特殊抗原决定 簇抗体反应有差异不同的p r v 株也影响特殊抗原决定簇抗体反应；在鼠中，宿主的基因背景 也影响特殊抗原决定簇抗体反应。在主要抗原表位中，5 个抗原表位有3 个是非构象性抗原 表位，2 个是构像性抗原表位。 在p r v 控制中，各国都采取了不同的策略。其中最有成效的是欧洲和美国的根除计戈! l 。 通过采取扑杀政策、广泛的免疫接种、宰杀或隔离伪狂犬病阳性猪群并施以紧急接种3 种途 径来根除伪狂犬病。在各种计划中以每年疫苗接种3 次，当流行率低于1 0 时进行血清学检 查，淘汰阳性猪达到根除p r v 目的时损失最小、费用晟, b ( m c i n e m e y , 1 9 9 7 ) 。在根除计划实 施以来，疫苗发挥了重要的作用。疫苗的使用减少了出现临床症状的猪，减少了经济损失。 部分阻断了病毒的传播。在各种疫苗中活疫苗的使用相对较为广泛，这类疫苗通常是缺失了 t k 、班、g c 或g g 的病毒株，比较而言，g c 或g g 的缺失株均没有像班缺失株这样如此受 到专家的重视。t k g o 缺失菌减毒性好，但无g e 缺失。p r v 的自然弱毒株中大多数缺失了 长达4 k b 的编码g e 基因。如b a t h a 株在g c 、g e ，g i 及核衣壳装配中有缺失和突变，b u k 株的g 皿基因有缺失，从高毒力和免疫原性强的毒株n i a - 3 发展而来的疫苗株有7 8 3 和 b e g o n i f l ，缺失了从g e 基因到编码1 l k 蛋白的基因约2 0 5 b p ；同时也缺失了2 个i r 的大约1 0 0 b p 的基因。此外，t k g e 、t k g c g e 、t k g c # 3 基因缺失l o w a s 6 2 株己经研究成功；这些苗 多在实际运用( 王勤，2 0 0 2 ) 。 g e 是各种野毒株均表达的一类褚蛋白。因此西可作为标志基因，区别感染动物和接种 动物，为剔除阳性的野毒感染动物以及根除本病提供有力的依据。g e e l i s a 有高度的特异 性和灵敏性，适合大范围的血清流行病学调查。西e l i s a 最早由o i r s c h o t ( 1 9 9 1 报道的，他 们比较了g e - e l i s a 、普通e l i s a 和中和试验，证明g e e l i s a 有非常高的灵敏度和特异性。 s c h m i t t ( 1 9 9 1 ) 等用啦，g g 、g c - e l i s a 、病毒中和试验和凝胶沉淀试验( l 础测自然感染猪 4 的血清。实验证明匝和g c - e l i s a 同l a t 一样灵敏，比病毒中和试验和g g e l i s a 更灵敏。 w h i t e 等( 1 9 9 5 ) 用5 种方法检测p r v 的潜伏病毒，g e 、g c e l i s a 和荧光反应可靠地检测到猪 的p r v 的潜伏感染，相比之下g g e l i s a 缺乏灵敏性( d a v i dk i n k e r , 1 9 9 7 ) 。活疫苗都能建立 潜伏感染，j a g o b s ( 1 9 9 4 ) 确定g e 缺失的p r v 能潜伏在三叉神经节并进行低滴度的复制。欧共 体1 9 9 3 年的9 3 2 4 e e c 贸易法规，规定生猪贸易中，从p r v 流行国家出口的繁殖猪必须是 1 2 个月内没有接种疫苗或只接种了g e 缺失苗的g e - e l i s a 检测阴性的猪；进口的猪必须接种 g e 缺失苗，只用g f _ , - e t , i s a 检疫。欧洲的根除计划是卓有成效的，加拿大、英国，丹麦等国 已宣布消灭了p r v 。在我国对p r v 的预防控制尚有许多空白。疫苗的使用也没有统一的标准； 免疫程序还处于探索阶段，已有基因缺失苗构建出来如四川农业大学构建的t k 和g e g l 缺 失株。 p r v - s h 的g e 基因与p r v - r i c e 株、p r v - e a 株和p r v - f a 株的g e 基因的同源性分别为 卯5 、9 8 6 和9 7 8 。通过比较发现p r v - s h 株与f a 株的西基因在1 4 8 4 b p 处都缺失掉 g c g a c c 六个碱基，且在1 7 1 8 1 7 2 0 b p 处由a t g 置换为t g t ；p r v - s h 株g e 基因推导的氨基 酸与p r v - r i c e 株、p r v - e a 株和p r v - f a 株的g e 基因的氨基酸同源性分别为9 4 6 、9 7 1 和9 5 7 。 1 1 3 病毒感染和复制 1 1 3 1 吸附和穿入 病毒的感染先是游离病毒吸附到靶细胞上，然后病毒囊膜和细胞质膜融合。在这两个过 程中最关键的是病毒囊膜糖蛋白和作为病毒受体的细胞表面成分的相互作用。p r v 和靶细胞 的最初接触是通过病毒g c 和细胞表面的硫酸乙醚干素糖蛋白的相互作用，之后发生g d 与其 细胞受体的相互作用而介导的稳定结合迄今为止更多可能的p r v 受体还未被发现，即使缺 失g r p 受体，p r v 仍能够感染c h o 细胞，并且p r v g d 缺失突变株能够通过其它受体感染细 胞。病毒粒子在其囊膜和细胞质膜接触融合后才能穿入融合过程至少需要4 种糖蛋白：g b 、 g h l 和2 p 才能发生。缺任何一个，基因工程病毒突变株都不能发生这种病毒囊膜和细胞质 膜的融合。融合后，核衣壳被运送至细胞浆，再被转运到核膜，定位于核孔附近，最后病毒 粒子进入核内。 1 1 3 2 核内过程 进入核内的线性d n a 发生环化和转录, p r v 的基因转录分为立即早期( i e ) 、早期或晚早期 正l ) 和晚期( l ) 三类，遵循严格的时序方式和级联方式。首先编码调节蛋白的立即早期基因o e ) 开始表达。与大多数病毒不同，p r v 只有一个立即早期表达的基因( 编码i e l 8 0 ) 。i e l 8 0 基因 在病毒d n a 进入核内后即进行转录，后翻译为一个磷酸化蛋白，聚集在宿主细胞核中，能 激活多种病毒基因和异源基因启动子的转录，之后开始合成各种蛋白质。包括囊膜糖蛋白、 病毒自身所编码的酶和非必需的衣壳蛋白，( 包括囊膜糖蛋白、病毒自身所编码的酶和非必须 的衣壳蛋白( c h e u n g , 1 9 9 4 ) ) ，并迅速装配病毒粒子早期基因在d n a 复制之前就被表达，编 5 东北农业大学农学硕士学位论文 码包括d n a 复制和其它酶活性所必需要的蛋白质。p r v 的早期基因编码许多具有酶活性的 蛋白质。病毒基因组的复制需要u l 5 ，u l 8 ，u l 9 ，u l 4 2 和u l 5 2 基因表达产物。它们对 d n a 合成起点的识别，对d n a 超螺旋结构的解旋。对双螺旋的解开和对互补的前导链与后 滞链的合成都是必需的。疱疹病毒的d n a 复制是通过滚环方式进行的，然后形成头尾相接 的连环体d n a 分子，他们在装配进衣壳的同时或之前被裂解成特定长度的基因组。大部分 的核内病毒d n a 存在于高分子量的连环体结构之中。晚早期基因在病毒d n a 复制之前就已 开始转录，但必须在病毒d n a 复制开始后才能达到最高表达水平。晚期基因仅在d n a 复制 完成后才进行转录。晚期基因编码几种衣壳和囊膜成分，如g c 。因此疱疹病毒转录和翻译方 式分成这三个动力学阶段并不是绝对的( 比如许多早晚期基因表达在病毒d n a 复制之前就 己开始了，但只有在d n a 复制开始后才达到其最大表达水平) 农壳蛋白在胞浆内合成后进 入细胞核进行装配。装配过程是自身催化的，并仅需要相应的衣壳成分。 1 1 3 3 病毒的出芽 合成的衣壳以出芽方式离开细胞核。病毒粒子通过最初的囊膜与外核膜的融合而离开核 周隙，将裸衣壳释放到胞浆。第二层囊膜是在高尔基体的跨膜区形成的。初形成的囊膜出芽 到高尔基体跨膜区的片层和囊泡。至此，皮层己形成，第二层囊膜可以看到带有病毒糖蛋白 组成的纤突。出芽的结果是在囊泡中形成了完整的病毒粒子这些包裹了病毒粒子的囊泡随 后移至胞浆膜，进而与细胞膜融合，然后将病毒粒子释放到细胞外。 1 1 4 潜伏性 潜伏性是病毒d n a 持续存在但不产生感染性病毒的状态。p r v 经口鼻感染后首先在上 皮组织中复制，完成一个复制周期后子代病毒子大量增加导致对一级神经原的扩大感染。潜 伏感染期病毒基因的表达仅限于病毒基因组特定基因的转录形成所谓的潜伏相关因子 ( l a t s ) 。潜伏感染的病毒被一些应激因素( 如冷、熟应激) 或某些生物活性化合物所激活 ( s c h o e n b a u m , 1 9 9 0 t a n a k a , 1 9 9 8 v , z h io i r s c h o l l 9 8 4 ) ；预先潜伏于三叉神经节中的p r v 不能使后 感染的病毒再建立起潜伏感染。推断易于建立潜伏感染的致弱疫苗毒株可以阻止二次感染的 野毒株建立潜伏感染。伪狂犬病根除计划中使用的基因缺失苗也能在猪体内建立潜伏感染， 但证据表明并不影响疫苗的安全性( m a e s , 1 9 9 7 v o l 互1 9 9 2 ) 1 2 伪狂犬病病毒的诊断学研究进展 1 2 1 病毒分离( v d 是诊断该病最确切的一种方法。采取病死猪或处于发热期病猪的脑组织( 中脑和脑桥 含毒量最高) 、咽部粘膜、心、肝、肺、肾及扁桃体等组织分离病毒。将病料磨碎加灭菌生理 6 盐水或h a n k s 液制成l ：1 0 乳剂，加入适量双抗( 青、链霉素) ，离，0 , ( 3 0 0 0 r p m ) 1 0 r a i n , 取上清液接 种培养成单层的细胞，观察至出现特征性细胞病变( c p e ) ，镜检观察细胞中有无核内包涵体。一 般情况下，2 5 天即可分离到病毒( 李文刚，1 9 9 5 ) 。p r v 的细胞谱很广，i b r s - 2 、b h k - 2 1 、v e t o 、 h e l a 、原代鸡胚成纤维细胞和原代犊牛睾丸细胞等均可用于 1 2 2 动物接种试验 取分离的病毒上清液，家兔腹侧皮下注射( 有时也用l 4 周龄小鼠作接种试验，但家兔对 p r v 最为敏感) ，2 m l ，只。开始时家兔精神萎顿，食欲不振，有体温反应；2 3 天后，注射局部出现 奇痒症状( 啃咬注射部位) ，致使皮肤破损出血；随即后肢麻痹，卧地不起，不时出现痉挛，角弓反张， 维持l 2 天后抽搐死亡。 1 2 3 电镜技术 应用电子显微镜直接检查p r v 是诊断和鉴定病原的必要手段之。王家富等( 1 9 9 6 ) 在电 镜下观察纯化的p r v 湖北株，形态结构与疱疹病毒极为相似，成熟的病毒颗粒星球形或圆形，直 径在2 0 0 r i m 以上，囊膜厚，病毒外周可看到纤突，同时也可看到小囊膜病毒，颗粒直径约1 5 0 r i m ， 未成熟病毒粒子多呈中空状。但也有的核芯是致密的。 1 2 4 血清学检测方法 1 2 4 1 反向间接血凝试验( r p h a ) 程由铨等( 程由铨，1 9 9 2 ) 直用单克隆抗体，建立了r p h a 、e l i s a 和e 等方法检测p r v 抗 原，并与比较，发现e a 和r p h a 不仅特异性强，且与v i 有同等的阳性检出率。但r p h a 试验 设备要求低，操作简便，结果直观，更适于基层用。s h i b a t e ( 1 9 9 3 ) 利用p r v 的血凝性依赖于g c 和 邸缺失变异株，无血凝活性原理，建立了红细胞血凝抑制试验，来鉴别感染猪和疫苗接种猪。 1 2 4 2 免疫荧光技术( f a ) s t e w a r t 等( 1 9 6 7 ) ( s t e w a r t , 1 9 6 7 ) 首先用e 检测病毒和病料接种的p k - 1 5 培养物。获得了良 好的效果。用该技术对不同病料进行检测，发现扁桃体和淋巴结的检出率最高。其次为大脑、脾、 脊髓。方法为采取病猪的脑( 主要是三叉神经、延脑等) 、扁桃体，脾或脊髓制成冰冻切片或 印压片，荧光抗体染色，荧光显微镜下检测，感染猪p r 的病料可以在细胞膜和细胞浆中观察到 特异性的亮绿色荧光。a l l a n 等利用间接免疫荧光技术( i f a ) 对实验感染猪或自然感染猪的脑、 咽压印片进行检测，该法特异性强，不与猪p p v 、腺病毒、血凝性脑炎病毒及肠道病毒发生交 叉反应，病毒抗原最低检出量为1 0 1 3 t c i d 5 0 g 。在对野外病料的检测中。与相比较，i f a 和 v i 两种方法的检测敏感性相似，符合率达9 8 7 ，可在获得病料后2h 内得出结果。s a b o 等建 7 东北农业大学农学硕士学位论文 立了检测实验感染猪或自然感染猪的脏器冰冻切片的直接f a 技术，其检出脑组织中病毒的最 小病毒量为1 0 4 5 t c i d 5 0 g 。我国黄骏明等( 黄骏明，1 9 9 5 ) 报道建立了直接e a 技术，取病猪脑组 织，主要是三叉神经、延脑、脊髓等组织作冰冻切片进行f a 检查，可在组织细胞中检出特异性 荧光，检出率9 5 以上，一般获得病料后2 4h 得出结果。应用f 诊断猪p r 具有特异性强、 精确性高和操作简便等优点，是目前我国对p r 快速诊断的一种很好的方法。 1 2 4 3e l i s a 试验 直接e l i s a 程由铨等( 程由铨，1 9 9 2 ) 应用单克隆抗体介导的固相微球直接e l i s a ，可检出5 6 3u g m l 和 2 8 5u g m l 的抗体蛋白用该法检测小白鼠病理组织中p r v 抗原，并测定颌下腺、耳下腺混 合物、肝、脾、肺、肾等标本，p r v 的阳性检出率可达9 8 但单一组织的最高检出率只有8 7 。 显著低于v i 、f a 及r p h a 这3 种方法。 间接e l i s a s c h o e n b a u m ( s e h o e n b a u m ，1 9 9 0 ) 等报道间接e l i s a 检测实验感染猪和疫苗免疫接种猪的 血清，比n t 更敏感。a f s h a r ( a f s h a r , 1 9 8 7 ) b u s h ( b u s h ，1 9 8 6 ) 等分别建立了检测p r v 抗体的间接 e l i s a 方法。t j e e r dgk i m m a n ( r j e e r dgk i m m a n , 1 9 9 6 ) 等用杆状病毒表达系统( a a e g e 9 6 0 ) 表达 的p r v 糖蛋白g z 构建了间接e l i s a 。表达所用的g e 基因片段是g e 的+ 6 0 十1 0 2 0 核苷酸， 编码g e 的主要抗原位点而不是跨膜区。该基因被克隆在p r vg g 标记序列和杆状病毒表达 载体的p 1 0 启动子后。与阻断e l i s a 和五个商用试剂盒一起对感染过p r v 的一系列血清作 检测，结果表明，所建立的间接e l i s a 具有高度的特异性和中等程度的敏感性。邱德新等( 邱德 新，2 0 0 2 ) 用辣根过氧化物酶( h r p ) 标记纯化的兔抗猪i g g ，制各出高效价的酶标抗体，工作浓度 为l ：5 0 0 0 0 ；经各种条件的筛选，建立了检测猪p r 血清抗体的间接e l i s a 。所建立的问接 e l i s a 抗原包被浓度为3 9 2 r a g l ，血清最佳稀释度为1 ：2 0 ，与猪细小病毒、猪瘟、o 型口蹄 疫、猪支原体标准阳性血清呈阴性反应，与猪p r 标准阴性血清和临床未感染p r v 的猪血清里 阴性反应；与猪p r 标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应：与美国 进口的p r v 抗体检测e l i s a 诊断试剂盒检测结果比较，4 5 份猪血清的阴、阳性检出符合率均 为1 0 0 。这表明，建立的间接e l i s a 敏感性高、特异性强、操作简便、快速厩能定性又能定 量，并可批量检测。该法已获得有关部门认可，已有商品化诊断试剂盒应用。 竞争e l i s a p m d 7 h o m m e ( p r u d h o m m e 。1 9 9 7 ) 等将p r v g d 基因插入杆状病毒载体中进行表达，制备重 组抗原建立了竞争e l i s a 即c e l i s a 。用该法能检测到p r v 感染1 4 d 后猪血清阳转的情况。 与n t _ 起检测8 0 份猪血清，e e l i s a 特异性1 0 0 , , 敏感性9 8 杈粗制裂解抗原) 或9 6 杈植物凝 聚素提纯抗原) 。m o n i k ag u t 等( m o n i k a , 1 9 9 9 ) 用杆状病毒表达系统表达的p r v 糖蛋白g e 和 g i 构建了直接竞争e l i s a 。g e 僖i 抗原能够通过杆状病毒表达系统大量生产。用该法对2 4 5 份阴性血清和1 6 5 份阳性血清作了检测，与g e e l i s a 和已投入商业使用的其它检测方法相 比，g , b e l i s a 有更高的敏感性和特异性。另外，该方法还可用于早期感染( 如2 周龄) 的猪血清 中抗g e 抗体的检测，操作也非常方便。 斑点e l i s a 8 此方法是8 0 年代国际上出现的新技术，它不仅继承了传统e l i s a 的优点，而且还具有抗原 用量少、节省材料、不需特殊仪器、结果便于长期保存、快速简便等优点，因此适合于基层兽 医部门和大型猪场对该病的血清学诊断和流行病学调查。黄骏明( 黄骏明，1 9 8 9 ) 、李健强( 李健 强，1 9 9 0 ) 等分别应用混合纤维素酯微孔滤膜作固定支持物，用辣根过氧化物酶标记的s p a 建立 了斑点- 酶联免疫吸附试验( d o t - e l i s a ) ，对1 3 3 7 头份猪血清进行了p r v 抗体检测的研究征 明了该法检测p r v 抗体具有特异性强、灵敏度高等优点。使e l i s a 结果可用肉眼观察。与 n t 比较，d o t - e l i s a 阳性检出率为2 8 1 9 0 o ( 5 3 1 8 8 ) 、n t 阳性检出率为2 0 7 4 ( 3 9 1 8 8 ) ，其敏 感性明显高于n t ，适合大面积血清学普查。d o t