（中西医结合基础专业论文）季节变化对呼吸系统免疫调节机制影响的研究.pdf

一、， ， t k i i l i i ii l l l i i 1i ii l l , l lt i l l1 i l l y 1 8 0 7 8 4 6 目录 中文摘要o oooooogo 1 英文摘要0 00000000000 000 7 英文缩写o 6o oooobo 1 4 研究论文 弓i 言1 6弓i 舌”“”一“”“”“”“。1 6 第一部分季节变化对健康大鼠肺组织i l 一1 b 、i l 一2 、i l 一6 、i l 一1 0 和s p a 表达的影响 前言1 8刖舌“一”一“”“”“一“上g 材料与方法1 9 结果”一“一“2 3 附图b oo000 2 5 附表3 0 讨 仑”“”一”“”“一”“”3 1 爿、结“一“”一”“”3 5 参考文献3 5 第二部分季节变化对健康大鼠血清t h l 和t h 2 型细胞因子的调节作用及 肺组织形态学的影响 前言“一”“一”“3 8且u 舌”一”一”“一”“”一”“”3 8 材料与方法3 9 结果4 2 附图o o oooo 4 3 附表4 8 讨论4 9 小结o oooo0 5 2 参考文献5 2 第三部分季节变化对健康人外周血c d 3 + 、c d 4 + 、c d 8 + 和c d 5 6 + 淋巴细 胞比率的影响 前言5 5日l j 舌”一”“”“一”“”“”“”b b 材料与方法5 5 结果一d ooooo ooo 一“”一“一一“”一”“”5 7 附图5 9 附表0 00 0oodoo 0 0 0000000 6 4 讨论o ad ooo000 00*000 0000 0 0 00 100 6 5 j 、结6 8 参考文献o 00060 000 6 8 结论e ooooo oooo oo 7 0 综述一季节气候对呼吸系统影响的研究进展o ooobo ooo 7 l 综述二呼吸系统免疫防御功能中相关免疫物质的研究进展8 3 致谓十一“一”“”一“”“o o o ooo “”“一“”一”一一一”1 0 4 个人简历1 0 5 中文摘要 季节变化对呼吸系统免疫调节机制影响的研究 摘要 季节气候是人类赖以生存的基本条件，其变化也容易导致疾病的发 生，尤其对呼吸系统疾病的发生影响比较显著。季节气候的变化刺激机体 后，免疫系统必将起到相应的免疫防御和免疫自稳作用，季节变化影响到 呼吸系统时会引起局部免疫平衡的波动，如果超过人体生理范围将导致呼 吸系统疾病的发生。呼吸系统免疫调节是一个精细的受严格调控的过程。 存在于呼吸系统的固有和适应性免疫机制共同抵御不利因素的侵袭，保证 了呼吸系统正常生理功能的进行。研究发现，呼吸系统疾病的季节易感性 与人类抵抗感染性疾病的基础一免疫功能的季节性调节紊乱关系密切，如 果免疫系统这种的季节性变化规律及其机制能被发现，将会在呼吸系统疾 病的防治方面产生重大的影响。因此，了解呼吸道免疫自稳状态及其调控 机制的季节性变化规律对提高呼吸系统疾病的诊断、治疗及预后判断具有 重要意义。 在呼吸系统免疫防御功能中，行使固有免疫防御功能的免疫相关物 质，如自然杀伤淋巴细胞、干扰素、细胞因子和行使适应性免疫防御功能 的免疫相关物质，如t 淋巴细胞以及与呼吸系统防御相关的免疫分子，如 肺表面活性物质都成为人们的研究热点。 “天人相应”理论是中医学理论体系的重要组成部分，该理论认为人 和自然环境是一个有机整体，两者的运动变化可直接或间接地相互影响， 机体也相应地随自然变化出现生理或病理上的反映。随着现代医学神经神 经一内分泌一免疫网络的发现，人们认识中医肺脏整体功能的与西医学呼吸 系统之间存在者很多相似之处，中医对卫气的认识也与现代医学的免疫功 能类似等。中医学认为肺卫功能正常是机体防御病邪的重要基础。这为从 中西医结合角度研究它们之间的关系提供了很好的桥梁和纽带。 目前从临床实践中可证实“天人相应理论的科学性，尤其是肺与季 节气候发病的关联性，但是季节如何影响人体呼吸系统免疫功能的，其免 疫物质基础尚不十分清楚。近年来，许多学者对“天人相应”理论的科学 内涵从各个角度进行了探讨，尤其是随着现代免疫学的发展，人们从免疫 中文摘要 学的角度发现中医的这些理论与现代医学的一些研究结果不谋而合，季节 变化对呼吸系统免疫功能影响以及调节作用机制方面的研究虽然取得一 些进展，但具体机制仍不明确。本课题以“天人相应”理论和肺卫理论为 基础，就季节变化对呼吸系统免疫物质的影响提出假设，以期验证其与免 疫物质的活动变化相关性，为临床上常见的呼吸系统疾病季节性发病提供 一定的实验依据，同时在预防和保健领域亦具有重要的参考价值。 本实验内容主要包括以下三部分： 第一部分：季节变化对健康大鼠肺组织i l - i b 、i l - 2 、i l - 6 、i l i 0 和 s p - a 表达的影响 目的：通过观察季节变化过程中大鼠肺组织i l - i b 、i l - 2 、i l - 6 、i l 一1 0 和s p - a 的表达，探讨季节变化对大鼠肺脏免疫调节的作用机制，为呼吸 系统季节性发病的病理生理机制的认识提供实验依据。 方法：清洁级健康3 月龄雄性s d 大鼠6 4 只，体质量1 8 0 - 2 2 0 克，分别按 购买时间分为立春、春分、立夏、夏至、立秋、秋分、立冬、冬至8 个组 ( n = 8 ) 。分别于节气前1 4 天购入实验大鼠。自由摄取水及普通鼠全价颗 粒饲料，室温饲养，接受自然光照。饲养到相应节气，于当日下午6 时将 动物断头处死，取出大鼠全肺组织进行i l - i b 、2 、6 、i 0 和s p - am r n a 检测。 结果： 2 季节变化对健康大鼠肺组织i l - i b 表达的影响 在正常生理状态下，全年健康大鼠肺组织中i l - i bm r n a 表达呈现出夏季 较高，春秋冬季较低( 立夏 春分 夏至 立春 立冬 冬至 立秋 秋分) 的 变化趋势。半定量p c r 结果显示春分、立夏、夏至相对表达水平，较其他 组均有显著性升高( p 夏至 立夏 立春 冬至 立秋 秋分 立冬) 的变 化趋势。半定量p c r 结果显示与春分、立夏组和夏至组相对表达水平比较， 其他组明显降低( p 0 0 5 ) 。 中文摘要 4 季节变化对健康大鼠肺组织i l 一6 表达的影响 在正常生理状态下，全年健康大鼠肺组织中i l - 6m r n a 表达呈现出夏季较 高，冬季较低，春秋次之( 夏至 立夏 立秋 立春 春分 秋分 立冬 冬至) 的变化趋势。半定量p c r 结果显示与立冬和冬至组比较，立春、春分、立 夏、夏至和立秋组显著性升高( p o 0 5 或p o 0 1 ) ；与夏至组比较，春分、 秋分、立冬和冬至组显著性降低( p o 0 5 或p 立秋 立冬 立夏 春分 立春 冬至) 的变 化趋势。半定量p c r 结果显示与夏至组比较，立春组和冬至组显著性降低 ( p 春分 立夏 立春 立秋 秋分 冬至 立冬) 的变化趋势。半定量p c r 结果显示与春分和夏至组比较，立秋、 秋分、立冬和冬至组显著性降低( p o 0 5 或p o 0 1 ) ；与立冬组比较，其 他各组均显著性升高( p 立春 立秋 秋分 夏至 冬至 立冬) 的变化趋势。 与立冬组和冬至组比较，其他各组均显著性升高( p 0 0 5 或p 0 0 1 ) ；立 夏组较夏至组、立秋组、秋分组、立冬组和冬至组均显著性升高( p 0 0 5 或p 0 0 1 ) ；春分组较夏至组、秋分组、立冬组和冬至组均显著性升高 ( p 立冬 立春 冬至 立秋 春分 秋分) 的变化趋势。 与秋分组比较，其他各组显著性升高( p 立夏 立秋 立春 春分 秋分 立冬 冬至) 的变化趋势。 与立夏组和夏至组比较，立冬组和冬至组c d 3 + t 淋巴细胞比率均显著性下 降( p 夏至 春分 立冬 立秋 立春 秋分 冬至) 的变化趋势。 各季节组未见显著性差异( p o 0 5 ) 。 3 季节变化对健康人外周血c d 4 + t 淋巴细胞比率的影响 全年健康人外周血中c d 4 + t 淋巴细胞比率呈现出夏季较高，冬季较低，春 秋季节次之( 夏至 立夏 春分 立春 立秋 秋分 冬至 立冬) 的变化趋势。 与立夏组和夏至组比较，立冬组和冬至组c d 4 + t 细胞均显著性下降( p 立秋 立春 立冬 秋分 春分 立夏 夏至) 的变化趋势。 与夏至组比较，冬至组c b 8 + t 细胞比率均显著性上升( p 立夏 春分 立春 立秋 秋分 立冬 冬至) 的变化趋 势。与立夏组比较，冬至组c d 4 + c d 8 + 比值显著性下降( p o 0 5 ) ；与夏至 组比较，立秋组、秋分组、立冬组和冬至组c d 4 + c d 8 + 比值显著性下降 中文摘要 ( p s s v b w b w s a b a e c h a n g e si nt h et r e n d t h ee x p r e s s i o no fi l - 1bi nv e ，s ba n ds sg r o u pw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e r sg r o u p s ( p s s s b v b w s a b a e w b c h a n g e si nt h et r e n d t h ee x p r e s s i o no fi l - 11 3i nv e ，s ba n ds sg r o u pw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e r sg r o u p s ( p 0 0 5 ) 3e f f e c to fs e a s o n a lv a r i m i o no ne x p r e s s i o no fi n t e r l e u k i n 一6i nh e a l t h yr a tl u n g t i s s u e s t h ei m m u n em a t e r i a l so fl u n gi nd i f f e r e n tg r o u pw e r eh i g h e ri ns u m m e ra n d l o w e ri nw i n t e r t h eg r o u p st h a ts s s b v b a b a e v e w b w s c h a n g e s i nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hw ba n dw s g r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fi l 6w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r i n v b ，v e ，s b ，s s a n da b g r o u p ( p 0 0 5o rp 0 01 ) ；c o m p a r e dw i t hs sg r o u p ，i tw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri nv e ，a e ，w ba n d w sg r o u p ( p 0 0 5o rp 0 0 1 ) ；c o m p a r e dw i t ha bg r o u p ，i tw a ss i g n i f i c a n t l y l o w e ri na e ，w ba n dw s g r o u p ( p s s v b w b w s a b a ec h a n g e si nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hs sg r o u p ，t h ee x p r e s s i o n o fi l - 10w a s s i g n i f i c a n t l yl o w e r i nv ba n dw s g r o u p s ( p v e s b v b a b v e w s w bc h a n g e si nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hv ea n ds sg r o u p ，t h e e x p r e s s i o no fi l 一10w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri na b ，a e ，w ba n dw sg r o u p s ( p 0 0 5o rp 0 01 ) ；c o m p a r e dw i t h bg r o u p ，i tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri n o t h e rg r o u p s ( p v b a b a e s s w b w s c h a n g e s i nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hw ba n dw sg r o u p s ，i tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri n t h eo t h e rg r o u p s ( p 0 0 5o rp 0 01 ) ；c o m p a r e dw i t hs b g r o u p ，i t w a s s i g n i f i c a n t l yl o w e ri ns s ，a b ，a e ，w ba n dw sg r o u p s ( p 0 0 5o rp 0 o1 ) ； c o m p a r e dw i t hv eg r o u p ，i tw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri ns s ，v e ，w ba n aw s g r o u p s ( p w b v b w s a b v e a ec h a n g e s i nt h et r e n d c o m p a r e dw i t ha eg r o u p ，t h el e v e lo fi l 一10w a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e ri no t h e rg r o u p s ( p s b a b v b v e a f _ w b w s i nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hs ba n ds sg r o u p ，t h ee x p r e s s i o n o fc d 3 十w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri nw ba n dw s g r o u p s ( p v e 、入毋 a b v b a e w sc h a n g e si nt h et r e n d t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e ea 1 1 g r o u p s ( p 0 0 5 ) 3e f f e c to fs vo nc d 4 + i nh e a l t h yi n d i v i d u a l s t h ei m m u n em a t e r i a l sc d 4 十o fh e a l t h yh u m a ns e r u mw e r eh i g h e ri n s u m m e ra n dl o w e ri nw i n t e r t h eg r o u p st h a ts s s b v e v b a b a e w s w b c h a n g e si nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hs ba n ds sg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no f c d 4 十w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri nw ba n dw sg r o u p s ( p 0 0 5 ) 1 2 英文摘要 4e f f e c to fs vo nc d 8 十i nh e a l t h yi n d i v i d u a l s t h ei m m u n em a t e r i a l sc d 8 + o f h e a l t h yh u m a ns e r u mw e r eh i g h e rw i n t e ri n a n dl o w e ri ns u m m e r t h eg r o u p st h a tw s a b v b w b a e v e s b s s c h a n g e si nt h et r e n d c o m p a r e dw i t hs sg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fc d 8 + w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nw s g r o u p s ( p s b v e v b a b a e w b w s c h a n g e s i nt h et m n d c o m p a r e dw i t hs bg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fc d 4 + c d 8 + w a ss i g n i f i c a n t l v l o w e ri nw s g r o u p s ( p 0 0 5 ) ；c o m p a r e dw i t hs sg r o u p ，i tw a ss i g n i f i c a n t l y l o w e ri na b ，a e ，w ba n dw s g r o u p s ( p 0 0 5o rp 0 01 ) c o n c l u s i o n ：t h e r ew e r eac e r t a i na c c o m m o d a t i o nr o l e b ys vo ni m m u n e f u n c t i o n s ，w h i c ht e n d e n c yw e r e s t r o n g i n s p r i n g s u m m e r w e a ki 1 1 a u t u m n w i n t e r , w i t ht h ec o r r e s p o n d i n gr e c o g n i t i o nb e t w e e nc h i n e s eh e i r t h e o r ya n dl u n gh e a l t ha w a r e n e s sd e f e n s et h e o r y s p r i n ga n ds u m m e rc o u l d a d j u s tt h en u m b e ro fc d 3 + , c d 4 + , c d 8 + tc e l li nb l o o ds e r u m ，b yh e i g h t e n i n g c d 4 十a n dd e g r a d i n gc d 8 + , t h u s u p r e g u l a t e dt h er a t i oo fc d 4 + c d 8 + t o e m e r g ei m m u n o l o g i c a le n h a n c e m e n t k e yw o r d s ：s e a s o n a lv a r i a t i o n ；l y m p h o c y t e ；c y t o k i n e s ；i m m u n o r e g u l a t i o n ； r e s p i r a t o r ys y s t e m ；h u m a n e n v i r o n m e n ti n t e rr e l a t i o n - _ _ - - - _ - - 一_ 一 1 3 英文缩写 1 4 英文缩写 1 5 研究论文 季节变化对呼吸系统免疫调节机制影响的研究 近年来，随着社会经济的发展，人类的生存环境发生了显著的变化， 季节气候变化对人体健康的影响已愈加引起人们的关注，其中呼吸系统疾 病发病率居高不下，尤其是呼吸系统炎性疾病，如上呼吸道感染、肺炎、 支气管哮喘以及传染性非典型肺炎、甲型h i n l 流感等成为人们关注的重 点。有研究发现气温低、气温日差小，日照时间少等因素都有利于呼吸系 统疾病的发生与流行，秋冬季节是这些疾病的主要发生时节。正常情况下， 人体上呼吸道经常存在一些正常菌群，而下呼吸道一般情况下是应该是无 菌的，气候变化、微生物的入侵及其负荷的增加，均可破坏呼吸系统固有 的正常微环境，导致微环境的免疫失衡，产生了肺部的损伤。“天人相应” 是中医学理论的重要组成部分，是指人体作为有机整体与自然界紧密联 系，自然界季节气候、地理环境的变化对人体生理状态具有非常重要的影 响作用。而肺脏能够适应外界环境变化而调节自身平衡以及与机体其它脏 腑的关系，借以维持机体内环境的稳态，其调控方式与免疫的联系很紧密， 这些呼吸系统的免疫防御调节机制表现与中医肺卫防御外邪理论十分接 、p 迎。 基于上述理论，考虑目前中医学对呼吸系统免疫季节性变化的微观认 识还比较模糊，主要停留在宏观的认识上，国外基本没有这方面文献报道， 而国内研究主要集中在春秋季节对大鼠脾脏和胸腺指数、脾脏t 淋巴细胞 转化率、肺泡巨噬细胞吞噬功能以及血清细胞因子等方面，较少从全年季 节变化对呼吸系统免疫功能的作用机制进行探讨。因此，我们从天人相应 的角度出发，以“天人相应和肺卫理论与季节性免疫功能变化两者相关 性为结合点，将中医学重要脏器肺与四时季节、免疫学结合起来，以一年 为周期进行观察，选取季节变化的八个特殊时间点“四立、二分、二至” ( 立春、春分、立夏、夏至、立秋、秋分、立冬、冬至) ，通过研究它们 与呼吸道相关免疫物质的变化规律，包括季节变化对健康大鼠肺组织免疫 因子中i l 一1 b 、i l 一2 、i l 一6 、i l 一1 0 和s p - a 的表达、血清中t h l 和t h 2 型细胞因子的含量、外周血中c d 3 + 、c d 4 + 、c d 8 + 和c d 5 6 + 淋巴细胞比率等方 研究论文 面的影响，从多层次多因素探讨季节气候对呼吸系统免疫防御功能的调节 作用机制，探求免疫物质随年周期变化的规律，为呼吸系统免疫防御功能 的实质研究寻找实验依据。本研究以中西医结合为基础，提出了临床防治 呼吸系统疾病新的理论见解，实用性以及创新性较强，可望为呼吸系统疾 病的预警和防治提供一定的理论依据和临床参考。 研究论文 第一部分 季节变化对健康大鼠肺组织il - i b 、ll - 2 、i l - 6 、ll - 10 和s p - a 表达的影响 _上-jl。 刖吾 呼吸系统疾病的季节易感性与人类抵抗感染性疾病的基础一免疫功 能的季节性调节紊乱有关，这种季节性生理和病理变化规律一旦被认识或 阐明，将在预防和临床治疗等方面具有重大的指导意义和现实意义n 1 。这 与中医学天人相应理论的观点是一致的。临床流行病学调查发现，季节气 候变化对机体免疫功能的影响与许多呼吸系统疾病的发生、发展密切相关 硷喝3 ，如慢性支气管炎、肺炎、哮喘等慢性呼吸道疾病在相对气温较低的 秋冬发病率较高h 1 。而且近年来随着一些新的呼吸道传染病引起的世界蔓 延，如s a r s 、甲型h i n i 流感等，有关季节气候变化对呼吸系统疾病以及 其免疫功能的影响已经成为人们目前研究的热点口刮。 细胞因子( c y t o k i n e ，c k ) 是由免疫细胞和某些非免疫细胞合成和分 泌的小分子多肽或糖蛋白，具有介导细胞间相互作用，免疫调节和生理调 节的作用。白细胞介素i l 一1 b 、i l 一2 、i l 一6 和i l - i o 在呼吸系统免疫方面 的作用一直为学者们所关注。肺表面活性物质蛋白- a ( p u l m o n a r y s u r f a c t a n t a s s o c i a t e dp r o t e i n ，s p a ) 在维持肺泡的生理功能，调解局 部微环境的免疫平衡方面具有重要作用，近年来已有不少证据表明s p - a 参与多种炎症细胞因子的调节过程口堋。细胞因子和s p 以与许多肺部疾病 密切相关，可用于对多种炎症性肺部疾病的诊断、鉴别诊断和临床监测， 甚至可作为预警和预后指标睁1 0 1 。但迄今很少有关季节气候对它们影响的 实验研究报道。因此，本实验通过观察季节气候变化在不同节气时间点肺 组织中i l 一1 b 、i l 一2 、i l - 6 、i l 1 0 和s p - a 的表达变化，探讨季节变化对 呼吸系统免疫物质的影响和内在作用机制，将有助于认识它们在呼吸系统 免疫防御过程中的调节机理，为防治与季节气候密切相关的呼吸系统疾病 提供理论和实验依据。 研究论文 材料与方法 1 材料 1 1 仪器 仪器名称及型号 低温高速离心机 超低温冰箱m d f 一3 8 2 e d y y - i i i 型电泳仪及电泳槽 u v p 凝胶扫描成像系统 p c r 扩增仪 7 5 6 m c 型紫外一可见分光光度计 全波长酶标仪 1 2 试剂 试剂名称 t r i z o lr e a g e n t 核苷核酸酶抑制剂( r n a si n ) 4 d n t p t a qd n a 聚合酶( t a qd n ap o l y m e r a s e ) 逆转录酶( m m l v ) 琼脂糖( a g a r o s e ) 溴化乙锭( e b ) 随机引物( r a n d o mp ri m e r s ) d n am a r k 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 二水乙二胺四乙酸二钠( e d t a ) 溴酚蓝 三( 羟甲基) 氨基甲烷( t r i s ) 异丙醇 氯仿 2 实验对象与样品制备 2 1 标本制备以及分组处理 产地 德国h e r a e u s 公司 日本s a n y o 公司 北京六一仪器厂 美国u v p 公司 美国e p p e n d o r f 公司 上海精密科学仪器有限公司 美国t h e r m o 公司 生产公司 美国i n v i t r o g e n 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 上海生物工程公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国s i g m a 公司 天津化学试剂三厂 美国a m r e s c o 公司 天津化学试剂三厂 天津化学试剂三厂 天津化学试剂三厂 研究论文 实验动物选用清洁级健康3 月龄雄性s d 大鼠6 4 只，体质量1 8 0 - 2 0 0 9 ， 分别于立春、春分、立夏、夏至、立秋、秋分、立冬、冬至前1 4 天购自 于河北医科大学实验动物中心，依时间顺序分为立春组( v e r n a lb e g i n s g r o u p ，v b ) 、春分组( v e r n a le q u i n o xg r o u p ，v e ) 、立夏组( s u m m e rb e g i n s g r o u p ，s b ) 、夏至组( s u m m e rs o l s t i c eg r o u p ，s s ) 、立秋组( a u t u m nb e g i n s g r o u p ，a b ) 、秋分组( a u t u m n a le q u i n o xg r o u p ，a e ) 、立冬组( w i n t e rb e g i n s g r o u p ，w b ) 、冬至组( w i n t e rs o l s t i c eg r o u p ，w s ) 。合格证书( 动物质 量合格证号：s c x k ( 冀) 2 0 0 3 一卜0 0 3 ) ，动物由河北医科大学实验动物中 心负责饲养，医学实验动物环境设施合格许可证：s c x k ( 沪) 2 0 0 6 0 0 1 0 。 实验大鼠自由摄取水及饲料，室温饲养，接受自然光照，饲料为普通鼠全 价颗粒饲料。饲养到相应节气，于当日下午6 ：o o 将动物断头处死，取出 全肺组织。每个组织标本分别置于d e p c 水处理过的组织冻存管中液氮速 冻后，于- 8 0 。c 冰箱中保存，以备总r n a 抽提。 2 2 提取大鼠肺组织总r n a 以及鉴定 2 2 1t r i z o l 法提取肺组织总r n a 将放置于液氮罐中的大鼠肺组织取出，采用电子天平称量8 0 m g 加 入d e p c 处理过的研磨器，再加入无菌生理盐水l m l 轻轻研磨，1 分钟内 迅速将组织在冰浴中充分匀浆，将肺组织转移至d e p c 处理过的1 5 m l e p 管中离心，弃上清。 每管加入l m lt r i z o l 试剂，用手反复摇匀，必要情况下可用移液 器带有l m l 无菌枪头反复吹打、研磨，至组织细胞完全裂解，液体基本澄 清，呈无颗粒透明状。 将上述e p 管置室温静置5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃去沉淀， 留取上清。 每管加入0 2 m l 氯仿，震荡混匀后室温静置1 5 m i n 。 将上述e p 管置4 1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，小心吸取上层水相置于 另一新的无菌e p 管中，再加入0 5 m l 异丙醇，充分混匀后室温下沉淀 l o m i n 。 然后4 c1 2 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，r n a 形成白色的小团沉淀在离心 管的底部和侧面，弃上清，用d e p c 水配置7 5 的乙醇洗沉淀两遍。让沉 淀的r n a 在室温条件下自然干燥，不能抽干。 研究论文 最后每管用无r n a s e 的纯水5 0p1 重悬干燥后的r n a ，置于冰浴中 马上用于c d n a 的合成或保存于- 7 0 。c 的冰箱中备用。 2 2 2 测定r n a 纯度及含量 在2 m l 双蒸水溶解吸取的2 5r n a 提取液溶，然后用于紫外分光光度 计2 6 0 和2 8 0 n m 处读取a 值( a2 8 0 和a2 6 0 值) ，且计算它们的含量和 纯度，再取2 9 l 总r n a 进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。如果样品a 2