（临床兽医学专业论文）犬用抗真菌制剂易皮康注射液研制.pdf

1i川jt，l中文摘要i英文摘要。i i i1 弓i 言l1 1 病原菌11 1 1 犬小孢子菌11 1 2 石膏样小孢子菌11 1 3 疣状毛癣菌11 2 抗真菌药物l1 2 1 多烯类药物21 2 2 吡咯类药物21 2 3 棘白菌素类药物21 2 4 烯丙胺类药物。31 3 抗真菌药物敏感试验研究进展31 3 1 液体培养基稀释法。31 3 2 琼脂扩散法31 - 3 3 琼脂稀释法。31 3 4 流式细胞仪法。41 3 5 葡萄糖消耗法41 3 6 比色法41 4 伊曲康唑研究进展41 4 1 伊曲康唑结构41 4 2 伊曲康唑产品51 4 3 伊曲康唑新型制剂61 4 4 伊曲康唑药代动力学研究进展81 4 5 伊曲康唑毒性研究81 4 6 伊曲康唑的临床应用。91 5 试验研究的目的和意义一1 02 材料与方法1 l2 1 实验材料1 l2 1 1 培养基l l2 1 2 染色液1 12 1 3 试验药品1 l2 1 4 试验试剂l l2 1 5 试验仪器1 22 1 6 试验动物1 2东北农业大学农学硕十学位论文2 2 实验方法1 22 2 1 易皮康注射液的制备1 22 2 2 易皮康注射液浓度的测定1 42 2 3 药物敏感性试验1 52 2 4 易皮康注射液的药物代谢动力学研究1 62 2 5 急性毒性试验l72 2 6 蓄积毒性试验182 2 7 耐受性试验182 2 8 局部刺激试验1 82 2 9 亚慢性毒性试验l82 2 1 0 临床药效学试验1 93 实验结果2l3 1 易皮康注射液的制备2 l3 1 1 羟丙基肛环糊精与双蒸水的比例选择2 13 1 2 共溶剂的筛选2 l3 1 3 包合温度的选择2 23 1 4 包合时间的选择2 23 1 5 滴加时间的选择2 33 1 6 包合液制备工艺的优化2 33 1 7 易皮康注射液的制备2 43 2 易皮康注射液浓度的测定2 43 2 1 最大紫外吸收波长的确定2 43 2 2 标准曲线制作与回归方程计算2 53 2 3 易皮康注射液浓度测定2 53 3 药敏试验一2 63 3 1 真菌的分离与培养2 63 3 2 药敏试验结果2 63 4 药代动力学试验结果。2 73 4 1 色谱图分析2 73 4 2 标准曲线及回归方程2 93 4 3 样品回收率3 03 4 4 方法精密度3 03 4 5 血药浓度一时间曲线3 03 4 6 血浆药物代谢动力学参数3 23 5 急性毒性试验3 23 6 蓄积毒性试验一3 43 7 耐受性试验3 43 8 局部刺激试验3 43 9 亚慢性毒性试验。3 43 9 1 观察记录和体重变化3 4? 、囊争pi一奢i、毒。、目录3 9 2 小鼠肝肾指标的变化3 53 9 3 肝肾的组织切片3 53 10 临床药效试验3 84 讨论4 04 1 易皮康注射液包合条件、共溶剂的选择4 04 1 1i t z 与h p - f l - c d 的比例选择4 04 1 2 共溶剂的选择4 04 1 3 包合条件的选择4 04 2 伊曲康唑剂型。4 l4 3 易皮康注射液药代动力学4 14 3 1 检测方法的选择4 l4 3 2 流动相选择4 14 3 3 血浆预处理方法选择4 24 3 4 犬体内易皮康注射液的药代研究4 24 4 伊曲康唑毒性研究。4 24 5 易皮康及伊曲康唑临床用药4 35 结论4 4致谢4 5参考文献4 6攻读硕士学位期间发表的论文5 3pilic o n t e n t sc o n t e n t sc h i n e s ea b s t r a c t ie n g l i s ha b s t r a c t i l l1i n t r o d u c t i o n 11 1p a t h o g e n s 一11 1 1m i c r o s p o r u mc a l a i s 11 1 2m i c r o p o r u mg y p s e u m ”11 1 3v e r r u c o u st r i e h o p h y t o n 11 2a n t i f u n g a ld r u g - - 11 2 1p o l y e n ed r u g 21 2 2p y r r o l ed r u g 21 2 3e e h i n o c a n d i n sd r u g 21 2 4a l l y l a m i n ed r u g 。31 3t h ep r o g r e s so fs e n s i t i v et e s to na n t i f u n g a ld r u g 31 3 1l i q u i dm e d i u md i l u t i o nm e t h o d 31 3 2a g a rd i f f u s i o nm e t h o d 31 3 3a g a rd i l u t i o nm e t h o d 31 3 4f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p em e t h o d 41 3 5g l u c o s ec o n s u m p t i o nm e t h o d “41 3 6c o l o r i m e t r i em e t h o d ”41 4t h ep r o g r e s so fi t r a c o n a z o l e 41 4 1s t r u c t u r eo fi t r a c o n a z o l e ”41 4 2p r o d u c to fi t r a c o n a z o l e 51 4 3n e wp r e p a r a t i o no fi t r a c o n a z o l e ”61 4 4p r o g r e s so fp h a r m a c o k i n e t i es t u d yo ni t r a c o n a z o l e 81 4 5p r o g r e s so f t o x i c i t ys t u d yo ni t r a c o n a z o l e 81 4 6c l i n i c a la p p l i c a t i o no f i t r a c o n a z o l e 91 5p u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo fr e s e a r c h “1 02m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ”112 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 112 1 1n u t r i e n tm e d i u m 112 1 2d y e i n gl i q u i d ”112 1 3e x p e r i m e n t a lm e d i c i n e ”112 1 4e x p e r i m e n t a lr e a g e n t 1i2 1 5e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s 。1 22 1 6e x p e r i m e n t a la n i m a l s 1 22 2e x p e r i m e n t a lm e t h o d s 1 22 2 1p r e p a r a t i o no f y i p i k a n gi n j e c t i o n 1 22 2 2d e t e r m i n a t i o no f c o n c e n t r a t i o nf o ry i p i k a n g 1 4v东北农业大学农学硕上学位论文2 2 3d r u gs e n s i t i v i t yt e s t 1 52 2 4p h a r m a c o k i n e t i c so fy i p i k a n g 162 2 5a c u t et o x i c i t yt e s t 1 72 2 6a c c u m u l a t i o nt o x i c i t y1 e s t 1 82 2 7t 0 l e r a b l et b s t 。l82 2 8l o c a ii r r i t a t i o nt e s t 1 82 2 9s u b - c h r o n i ct o x i c i t yt e s t 182 2 10c l i n i c a lp h a r m i cr e s e a r c h 193e x p e r i m e n t a lr e s u l t s 2l3 1p r e p a r a t i o nf o ry i p i k a n gi n j e c t i o n 2 13 1 1s e l e c t i o no f p r o p o r t i o nb e t w e e nd o u b l e d i s t i l l e da n dh p b c d 。2 1：；1 2s e l e c t i o no f s o l v e n t 2 l3 1 3s e l e c t i o no fi n c l u s i o nt e m p e r a t u r e 2 23 1 4s e l e c t i o no f i n c l u s i o nt i m e 2 2：；1 5s e l e c t i o no f a d d i t i o nt i m e 2 33 1 6o p t i m i z a t i o no fp r e p a r a t i o nf o ri n c l u s i o nl i q u i d 2 3：；1 7p r e p a r a t i o nf o ry i p i k a n gi n j e c t i o n 2 43 2d e t e r m i n a t i o no fc o n e e n t r a t i o nf o ry i p i k a n gi n j e c t i o n 2 43 2 1d e t e r m i n a t i o no fb i g g e s tu va b s o r p t i o nw a v el e n i g t h 。2 43 2 2f a b r i c a t i o no f s t a n d a r dc u r v ea n dr e g r e s s i o ne q u a t i o n 2 5：；2 3c o n c e n t r a t i o nf o ry i p i k a n gi n j e c t i o n 2 53 3d r u gs e n s i t i v i t yt b s t ：! ( ；： 3 1l s o l a t i o na n dc u l t u r eo f f u n g i 2 63 3 2r e s u l to f d r u gs e n s i t i v i t yt e s t 。2 63 4r e s u l t so f p h a r m a c o k i n e t i c s ：1 7：；4 1c h r o m a t o g r a m sa n a l y s i s 2 73 4 2s t a n d a r dc u r v ea n dr e g r e s s i o ne q u m i o n 2 9：；4 3r e c o v e r yr a t eo fs a m p l e 3 03 4 4a c c u r a c yo fm e t h o d 3 03 4 5c o n c e n l l m i o ni np l a s m a - t i m ec u r v e 3 03 4 6p h a r m a c o k i n e t i c sp a r a m e t e ri np l a s m a 3 23 5a c u t et o x i c i t yt b s t ：；23 6a c e u m u l a t i o nt o x i c i t yt b s t 3 43 77 r o l e r a b l e7 r e s t 3 4：；8l o c a li r r i t a t i o nt e s t 3 43 9s u b c h r o n i ct o x i c i t yt e s t 3 4：；9 1o b s e r v a t i o nr e c o r da n dw e i g h t 3 43 9 2c h a n g eo f l i v e ra n dr e n a li n d i c t o r sf o rm i c e 3 53 9 3t i s s u es l i c i n go fl i v e ra n dk i d n e y 3 53 1 ( ) c l i n i c a lp h a r m i cr e s e a r c h 3 8lc o n t e n t s4d i s c u s s i o n 4 04 1s e l e c t i o no fi n c l u s i o nc o n d i t i o na n ds o l v e n to ny i p i k a n g 4 04 1 1s e l e c t i o no f p r o p o r t i o nb e t w e e ni t r a c o n a z o l ea n dl i p - b - c d 4 04 1 2s e l e c t i o no fs o l v e n t 4 04 1 3s e l e c t i o no fi n c l u s i o nc o n d i t i o n 4 04 2p r e p a r a t i o no fi t r a c o n a z o l e 4 14 3p h a r m a c o k i n e t i c so f y i p i k a n gi n j e c t i o n 。4 14 3 1s e l e c t i o no fd e t e r m i n a t i o nm e t h o d 4l4 3 2s e l e c t i o no f m o b i l ep h a s e 4 14 3 3s e l e c t i o no f p r e t r e a t m e n tm e t h o dw i t hp l a s m a ：4 24 3 4p h a r m a c o k i n e t i c so f y i p i k a n gi n j e c t i o ni nd o g 4 24 4t o x i c i t yr e s e a r c ho f y i p i k a n g 4 24 5c l i n i c a la p p l i c a t i o no f y i p i k a n ga n di t r a c o n a z o l e 4 35c o n c l u s i o n 4 4a c k n o w l e d g e m e n t 4 5r e f e r e n c e s 4 6p a p e r sp u b l i s h e di nt h ep e r i o do fm a s t e re d u c a t i o n 5 3；耄研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 逵! 如塑直墓丝霞噩挂别直盟丝：奎拦亘窒) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：i ；曩乐夕日期：。，。年二月岁日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：) f 彳f ：寸彬j导师签名：0 、1 勿日期：o 口年莎月歹日pi一j，嚏摘要摘要近年来，随着宠物行业的不断发展，犬猫真菌性皮肤病的发病率也随之上升。犬猫的真菌性皮肤病居宠物疾病的首位，发生率最高。由于宠物和人的关系密切，所以人畜互感现象严重。该病不仅给宠物业发展带来负面影响，同时也危害到人类的健康。因此，研究动物的真菌癣病，开发有效的抗真菌药及研制相关药物的新剂型，对保障人畜健康及公共卫生、食品安全等具有重要意义。本试验采用h p - f l - c d 包合技术，通过对溶剂、浓盐酸的用量以及滴加时间、包合温度和包合时间的研究，确定最优条件制备易皮康注射液；应用紫外分光光度法检测注射液中伊曲康唑的浓度：参考n c c l sm 3 8 - a 方案，对培养出的犬小孢子菌进行药敏试验，选取酮康唑和伊曲康唑对犬小孢子菌进行体外抑菌试验，确定它们的m i c 值；将易皮康注射液按4 m g k g 1体重注入6 只犬的皮下，分别在注射后o 5 、1 、2 、3 、4 、5 、6 、8 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 h 进行采血，肝素抗凝，乙腈沉淀蛋白、高速离心分离来提纯样品，应用高效液相色谱紫外检测法测定血药浓度，将血药浓度代入3 p 9 7 药代动力学处理软件进行分析；应用小白鼠进行注射液的急性毒性试验、蓄积毒性试验、耐受性试验和亚慢性毒性试验，应用大白兔进行局部刺激试验；对患真菌性皮肤病的1 2 只犬按照三种不同的方案给药，在治疗中，每隔1 周，要进行刮片镜检，治疗两个疗程后，对药效进行评价。试验结果：成功制备出易皮康注射液，检测出该注射液中伊曲康唑含量为1 8 3 3 m g m l 一：体外抑菌试验结果显示，酮康唑和伊曲康唑的m i c 值分别为2 6 0 9 4 i t g m l - 1 和1 0 8 9 1 9 9 m l ；药代动力学结果表明1 0 - - 1 0 0 0 n g m l 1 内线性范围良好，最低检测限量为1 0 n g m l ，回收率、精密度均在允许的范围之内；药代学参数结果：k e 为0 0 2 0 9 h 1 ，k a 为1 2 9 2 8 h - 1 ，t l ，2 为3 3 1 0 3 3 h ，t m 腻为3 2 4 1 5 h ，c m 瓤为2 3 9 4 7 2 4 n g 。m l ，a u c 为8 6 1 4 3 5 8 7 ( n g , m l ) h ，c l 为0 0 0 1 9 l k g h ，v 为0 0 1 6 1 l k g 1 ，注射液在犬体内的药代动力学过程符合一室模型：急性毒性试验显示，半数致死量( l d 5 0 ) 为1 2 9 5 7 m g k g 1 ，l d 5 0 的9 5 可信限为1 0 6 6 6 1 5 7 4 0 m g k f l ；蓄积毒性试验中，蓄积系数k = 5 。3 ，表明易皮康注射液对小白鼠有轻度蓄积作用；耐受性试验表明小白鼠耐受性良好；刺激性试验显示，注射液有轻微刺激性；在亚慢性毒性试验中，高剂量组的小白鼠的在第2 8 d 称重时，平均体重最轻，与其它3 组比较，差异显著( 尸 o 0 5 ) ，g p t 出现升高，部分小鼠的肝脏出现变性，甚至坏死，其它各组未见异常变化；临床药效试验结果显示，注射液的药效良好，可以用于犬的真菌性皮肤病的治疗。关键词犬真菌病；易皮康注射液；伊曲康唑：药代动力学；毒性试验，ra b s t r a c td e v e l o p m e n to f a n t i f u n g a lp r e p a r a t i o n - y i p i k a n gi n je c t i o nf o rd o ga b s t r a c ti nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h ep e tp r o f e s s i o n ，t h ei n c i d e n c eo ff u n g o u ss k i nd i s e a s ei nd o g sa n dc a t sw a sr i s i n ga sw e l l t h ef u n g o u ss k i nd i s e a s eo fd o g sa n dc a t sw a sa tt h eh e a do fp e t sd i s e a s e ，i n c i d e n c eo fw h i c hw a st h eh i g h e s t p e o p l ew e r ec l o s ew i t hp e t s ，s oi n f e c t i o np h e n o m e n o nw i t he a c ho t h e rw a ss e r i o u sb e t w e e nh u m a na n da n i m a l s i tn o to n l yb r o u g h tn e g a t i v ei m p a c to nt h ep e tp r o f e s s i o n ，b u ta l s os e r i o u s l ya f f e c t e dh u m a n sl i f e t h e r e f o r e ，i tw a si m p o r t a n tf o rt h ep r o t e c t i o no fh u m a na n da n i m a l sh e a l t ha n df o o ds a f e t yt or e s e a r c ha n i m a l s f u n g o u ss k i nd i s e a s ea n dd e v e l o pe f f e c t i v ea n t i f u n g a ld r u g sa sw e l la sn e wr e l a t e df o r m s t h r o u g ht h er e s e a r c ho fs o l v e n t ，c o n c e n t r a t e dh y d r o c h l o r i ca c i da m o u n la d d i t i o nt i m e ，i n c l u s i o nt e m p e r a t u r ea n di n c l u s i o nt i m e ，y i p i k a n gi n j e c t i o nw a sp r e p a r e db a s e do nt h eb e s tc o n d i t i o nb yh p - f l - c di n c l u s i o nt e c h n i q u ei nt h ee x p e r i m e n t ；t h ec o n c e n t r a t i o no fi n j e c t i o nw a sd e t e r m i n e db yt h eu vs p e c t r o p h o t o m e t r y , a c c o r d i n gt ot h en c c l sm 3 8 - ap r o g r a m ，t h em i cv a l u ew a sd e t e r m i n e db yt h ed r u gs e n s i t i v i t yt e s t so fm i c r o s p o r u mc a l a i s ，f u n g ii n h i b i t i o nt e s t so fm i c r o s p o r u mc a n i sw i t ht h ek e t o c a n a z d ep o w d e ra n dt h ey i p i k a n gi n j e c t i o nf o rd o g ；a f t e rs u b c u t a n e o u si n j e c t i o nt os i xd o g sb y4 m g k g 1 ，t h eb l o o dw a sc a r r i e do u tr e s p e c t i v e l ya f t e r0 5 ，1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，8 ，12 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ha n dt h eb l o o ds a m p l e sw e r ep u r i f i e db ya n t i c o a g u l a t i o nw i t hh e p a r i n ,p r o t e i np r e c i p i t a t e dw i t ha c e t o n i t r i l ea n dh i g h s p e e dc e n t r i f u g a l ；t h eb l o o dd r u gc o n c e n t r a t i o nw a sd e t e r m i n e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a m v i o l e td e t e c tm e t h o d ，a n dt h e ni n c o r p o r a t e di ti n t ot h ep l a s m ap r o c e s s i n gs o f t w a r e3 p 9 7p h a r m a c o k i n e t i ca n a l y s i s ；m i c ew e r eu s e di nt h ea c u t et o x i c i t yt e s t ，a c c u m u l a t i o nt o x i c i t yt e s t ，t o l e r a n c et e s t , i r r i t a t i o nt e s ta n ds u b c h r o n i ct o x i c i t yt e s t ,m e a n w h i l er a b b i t so fn e wz e a l a n d e rw e r eu s e di nt h ep a r t i a ls t i m u l a t i o nt e s t ；t h r e ed i f f e r e n tp r o p o s a l sw e r eg i v e nt ot w e l v ed o g sw i t hf u n g o u ss k i nd i s e a s e ，a n dd u r i n gt h et r e a t m e n tt h es m e a rm i c r o s c o p yw a sc o n d u c t e de v e r yo n ew e e k a f t e rt w ot r e a t m e n t a lc r o u s e s ，t h ee f f e c to fd r u gw a se v a l u a t e d e x p e r i m e n tr e s u l t ：y i p i k a n gi n j e c t i o nw a sp r e p a r e ds u c c e s s f u l l y , t h ec o n c e n 仃a t i o no fi t r a c o n a z o l ew a s18 3 3 m g m l ，f u n g ii n h i b i t i o nt e s ti n d i c a t e dt h a tm i cv a l u eo fk e t o c a n a z d el i l东北农业大学农学硕上学位论文p o w d e ra n dt h ey i p i k a n gi n j e c t i o nw a s2 6 0 9 4 l a g m l a n d1 0 8 9 1l a g m l 1 ；t h ep h a r m a c o k i n e t i c si n d i c a t e dt h el i m i to fd e t e c t i o nf o ri t r a c o n a z o l ew a s10 n g m l ，a n dag o o dl i n e a r i t yw a so b t a i n e di nt h er a n g eo fl o 1 0 0 0 n g m l 。r e c o v e r yr a t ea n dp r e c i s i o nw e r ep e r m i t t e dw i t h i nt h es c o p eo ft h em e t h o d ，a n dt h em e t h o dw a ss u i t a b l ef o rc l i n i c a la p p l i c a t i o n ；t h ep h a r m a c o k i n e t i cp a r a m e t e r so fy i p i k a n gi n j e c t i o nw e r ea sf o l l o w ：a ne x c r e t i o nr a t ec o n s t a n to 0 2 0 9 v 1 t h ea b s o r p t i o nr a t ec o n s t a n tw a s1 2 9 2 8 h ，d r u gh a l f l i f ew a s3 3 1 0 3 3 h ，t h et i m et og e tt h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o nw a s3 2 4 1 5 h ，m a x i m u md r u gc o n c e n t r a t i o nw a s2 3 9 4 7 2 4 n g m l ，t h ea r e au n d e rt h ep l a s m ac o n c e n t r a t i o n t i m ec h i v ew a s8 6 1 4 3 5 8 7m g l - j h 一，p l a s m ac l e a r a n c er a t ew a s0 0 0 1 9l k g - 1 h 1 ，t h ea p p a r e n tv o l u m eo f d i s t r i b u t i o nw a so 0 1 6 1 l k g 一，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep h a r m a c o k i n e t i c so fi n j e c t i o ni nd o g sc o n f o r m e dw i t ho n ec o m p a r t m e n t o p e nm o d e l ；t h ea c u t et o x i c i t yt e s ts h o w e dl d s 0w a s1 2 9 5 7 m g 。k 百1 ，t h e9 5 c o n f i d e n c el i m i tw a s1 0 6 6 6 - 1 5 7 4 0 m g k 百1 ；f o rt h ea c c u m u l a t i o nt o x i c i t y , t h ea c c u m u l a t i o nc o e f f i c i e n tkw a s5 3 ：t h er e s u l ts h o w e da c c u m l a t i o n sw e r es l i g h tf o rm i c eb yy i p i k a n gi n j e c t i o n ；t h er e s u l to ft o l e r a n c et e s ts h o w e dg o o dt o l e r a n c e ；i r r i t a t i o nt e s ts h o w e di n j e c t i o nh a ds l i g h ti 1 1 r i t a t i o nf o rr a b b i t s ；f o rt h es u b c h r o n i ct o x i c i t yt e s t , t h ea v e r a g ew e i g h to ft h em i c eo ft h et h eh i g hd o s eg r o u pw a st h el i g h t e s ta tt h e2 8 d ，c o m p a r e dt ot h eo t h e rt h r e eg r o u p s t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ( p 1 ) 的比例包合。同时考虑到注射液的黏度，再根据一些报道，加之笔者的前期预试验，初定投料比为l ：2 5 。取五个1 0 m l 的小烧杯，分别精密称取o 1 0 0 7 9 l t z 放入各个烧杯内，然后往每个烧杯内加入0 6 m l 溶剂m ，再缓慢滴加2 6 儿浓盐酸( 1 2 m o l l 1 ) 使i t z 溶解。再取五个1 0 m l 的小烧杯，分别称取2 5 3 8 1 f - i p 侈- c d 放入各烧杯中，然后往每个烧杯中分别加入3 m l 双蒸水，水浴加热使h p 节- c d 完全溶解。分别在3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 0 水浴磁力搅拌条件下将i t z溶液缓慢滴入h p 节- c d 水溶液中，用锡纸封住各烧杯口，包合1 2 h ，检测包合率。2 2 1 6 包合时间的选择取五个1 0 m l 的小烧杯，分别精密称取o 1 0 0 7 9 l t z 放入五个烧杯内，然后每个烧杯内加入0 6 m l 溶剂m ，再缓慢滴加2 6 止浓盐酸( 1 2 m o l l 1 ) 使i t z 溶解。再取五个1 0 m l 的小烧杯，分别称取2 5 3 8 1 9 h p 毋c d 加入各烧杯中，每个烧杯中分别加入3 m l 双蒸水，水浴加热使h p - 卢- c d 完全溶解。在4 0 0 水浴磁力搅拌条件下将i t z 溶液缓慢滴入h p l 出c d 水溶液东北农业大学农学硕十学位论文中，用锡纸封住各烧杯1 2 1 ，分别包合6 、1 2 、1 8 、3 0 、3 6 h ，检测包合率。2 2 1 7 滴加时间的选择按“2 2 1 5 ”项下操作，分别使i t z 溶液和h p - f l - c d 水溶液完全溶解，然后将i t z 溶液加入h p - f l - c d 水溶液中，滴加时间分别为0 、5 、1 5 、2 0 、3 0 m i n 。用锡纸封住各烧杯口，4 0 。c水浴磁力搅拌条件下，包合3 0 h 。2 2 1 8 包合液制备工艺的优化由于包合过程是一趋向于最终平衡的过程，增加h p - f l - c d 的量必然会使包合率增加，但考虑到注射液的黏度和浓度，选择投料比为1 ：2 5 。由于滴加时间、包合温度和包合时间是影响包合率的关键因素，故选择3 因素3 水平正交试验进行工艺的优化。结果见表3 3 ，以包合率为评价指标。2 2 2 易皮康注射液浓度的测定2 2 2 1 最大紫外吸收波长的确定制备一定浓度的易皮康注射液，在2 0 0 n m 到3 0 0 n m 波长( 九) 范围内进行扫描，结果见图3 4 。2 2 2 2 伊曲康唑溶液的标准曲线制作与回归方程计算精密称取伊曲康唑标准品7 6 2 2 9 m g ，溶于1 0 0 m l 甲醇中，4 0 。c 水浴，超声3 0 m i n 。分别精密量取1 、2 、3 、4 、5 m l ，分置于2 5 m l 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。以甲醇为空白，利用紫外分光光度法测定其吸光度a ，检测波长为2 6 2 n m ，测定三次，取平均值，将a 值对应i t z 浓度( c ) 作线性回归。2 2 2 3 易皮康注射液浓度的测定精密量取易皮康注射液0 0 5 m l ，用甲醇振荡溶解后定容至1 0 0 m l ，摇匀，在2 6 2 n m 处测定其吸收度a 值，带入回归方程，计算其浓度。1 42 2 3 4 菌悬液的制备用接种环挑落试验菌落( 犬小孢子菌) ，放入装有生理盐水的带盖塑料离心管中，涡旋振荡，使其充分的分散在盐水中，然后静置3 5 m i n ，取上层均质液体( 含孢子以及菌丝片段)至无菌e p 管中，振荡3 0 s 混匀。最后，用白细胞计数板镜检，调节其至5 x 1 0 6 c f u - m l 1 ( 每个孢子即为1 个c f u ，菌丝以1 个分隔处记为1 个c f u ) 。用r p m i 1 6 4 0 培养液稀释至5 1 0 4 c f u m l 。2 2 3 5 药敏板的制备取9 6 孔药敏板，先将药物储备液进行倍比稀释至两倍终浓度，每孔各加入r p m i 1 6 4 0培养液1 0 0 i t l ，在第一孔加入稀释完毕的药液1 0 0 p l ，进行倍比稀释，使药物稀释液的浓度由高到低依次为1 0 、5 、2 5 、1 2 5 、0 6 2 5 、0 3 1 2 5 、0 1 5 6 3 、0 0 7 8 1 、0 0 3 9 1 、0 0 1 9 5 p g m l 1 。第l1 孔作阳性对照( 生长对照) ，只加入1 0 0 i t l 的培养基，第1 2 孔作空白对照。再依次加入l o o p l 已制备好的菌悬液( 双倍终浓度) 。1 5东北农业大学农学硕士学位论文2 2 3 6 培养条件恒温培养箱，2 8 ，5 d 。2 2 - 3 7 最小抑菌浓度的判定用肉眼观察最小抑菌浓度( m i c ) ，一般而言，读取m i c 值时，应当在光线较好的中午或下午进行，将每个受试孔中真菌的生长情况与生长对照孔相比较，进行评分。4 分：生长无抑制；3 分：生长轻微减少或相当于生长对照的7 5 ；2 分：生长明显减少或相当于生长对照的5 0 ：1 分：轻微生长或相当于生长对照的2 5 ：0 分：肉眼观察澄清或未见生长。2 2 4 易皮康注射液的药物代谢动力学研究2 2 4 1 色谱条件色谱柱：w a t e r sc 1 8 ( 2 5 0 m m 4 6 m m )流动相：甲醇：水，体积比为8 0 ：2 0 ，用0 4 5 1 a m 微孔滤膜过滤，超声脱气；流速：1 0 m l m i n ；紫外检测波长：2 6 2 n m ；柱温为3 5 ：进样量2 0 “l 。2 2 4 2 血样预处理取血浆l m l 于7 m l 的e p 管中，先加入乙腈o 5 m l ，涡旋混合3 0 s ，再加入乙腈3 5 m l ，涡旋混合3 0 s ，离心( 4 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，上清液转入另一5 m l 的e p 管中，于4 0 水浴中，氮气吹干，加入流动相l m l 重组，o 2 2 i t m 过滤，进样。2 2 4 3 标准曲线制作精称伊曲康唑标准品1 0 0 3 m g 于1 0 0 m l 棕色容量瓶中，用甲醇溶解，定容。配成o 1 m g m l 1 的伊曲康唑标准液，4 条件下保存备用。取犬空白血浆l m l ，共6 份，放于5 m l的e p 管中，用伊曲康唑标准液与空白血浆配成每毫升含l o 、5 0 、1 0 0 、3 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0 n g的血浆标准溶液。按“血样预处理，项操作，测定药物峰浓度，以伊曲康唑浓度为横坐标，7药物峰面积为纵坐标制作标准曲线。1 6材料与方法2 2 4 4 犬体内药代动力学研究犬6 只，给药前1 2 h 禁食，不禁水，给药前，于前肢皮下头静脉采血3 m l ，按4 m g k 蛋1 体重背部皮下注射给药，前肢皮下头静脉和后肢小隐静脉处采血，时间点为0 5 、1 、2 、3 、4 、5 、6 、8 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 h ，每个时间点采血3 m l ，放入装有肝素钠的真空贮血管中，3 5 0 0 r m i n l离心1 5 m i n ，吸取血浆l m l 转移至2 m l 的e p 管中密封，2 0 0 避光保存。将已采集的血浆样品于室温解冻，按“2 2 4 2 ”项下所述方法处理，用高效液相色谱法进行测定，将测得的结果代入标准曲线回归方程，算出各个时间点的血浆药物浓度，将试验结果用3 p 9 7 药代动力学软件进行处理、分析。2 2 4 5 样品回收率取犬空白血浆和伊曲康唑标准液制作低、中、高浓度的质控样本，分别为1 0 、1 0 0 、5 0 0 n g m l 。三个样本为一组。取5 组质控样本连续检测5 次，来计算相对回收率。相对回收率= ( 实测的药物浓度对应制得的药物浓度) 1 0 0 另外，取无水乙醇与伊曲康唑原粉分别配制成1 0 、1 0 0 、5 0 0 n g - m u l 浓度的质控样本，三个为一组。取5 组质控样，连续测量，记录其峰面积，来计算绝对回收率。绝对回收率= ( 血浆中药物测得的峰面积x 寸应浓度的非血浆中药物的峰面积) x 1 0 0 2 2 4 6 方法精密度取犬空白血浆和伊曲康唑标准液制作高、中、低浓度的质控样本，分别为1 0 、1 0 0 、5 0 0 n