（临床兽医学专业论文）剑尾鱼卵黄蛋白原cdna的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立.pdf

上海水产大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：刘春 同期：2 d 0 年g 月 f 岁日 上海水产大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密d 本学位论文属于 ，在三年解密后适用本版权书。 不保密口 学位论文作者签名：列舂 同期：如0 年月6 日 指导教师签名：关：k 勤 吼种莎月彦日 上海水产大学硕士论文：剑尾鱼卵黄蛋白原e d n a 的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立 1 1 菌株与质粒3 2 1 2 主要药品和试剂3 2 1 3 剑尾鱼v g a 核心序列片段的改造3 4 1 4 重组表达质粒的构建3 4 1 5 诱导表达和s d s p a g e 分析3 5 2 结果3 6 2 1 剑尾鱼v g a 基因的改造3 6 2 2 重组表达质粒的构建3 7 2 3 重组菌的诱导表达与表达产物的纯化3 7 3 讨论3 9 3 1 剑尾鱼v g a 基因核心片段的改造3 9 3 2 表达系统3 9 3 3 表达载体3 9 3 4 包涵体的形成、纯化、溶解和复性4 0 第二节剑尾鱼v g a 检测方法的建立4 2 1 材料与方法4 2 1 1 实验动物4 2 1 2 主要药品与试剂4 2 1 3 抗血清的制备4 3 1 4 雌激素的诱导实验4 3 1 5 免疫印迹分析4 4 2 结果4 5 2 1 重组卵黄蛋白原抗血清的制备4 5 2 2 雌激素的诱导实验4 5 2 3 免疫印迹分析4 5 3 讨论4 6 3 1 重组剑尾鱼v g a 蛋白抗血清的制备4 6 3 2 免疫印迹分析4 6 3 3 剑尾鱼v g a 检测方法的建立4 6 3 4 剑尾鱼卵黄蛋白原监测模型的构建4 7 结论4 8 参考文献5 0 附录一缩略词表5 7 附录二常用试剂与缓冲液的配制5 8 致谢5 9 目录 目录 摘要t a b s t r a c t i i i 引言1 一、研究背景 二、卵黄蛋白原的研究进展 三、鱼类卵黄蛋白原在环境内分泌干扰物质监测研究中的应用 四、剑尾鱼在环境监测中的应用与优势 五、研究思路 第一章剑尾鱼卵黄蛋白原全长e d n a 的克隆与序列分析8 l 材料8 1 1 实验动物8 1 2 菌株与质粒8 1 3 工具酶和试剂8 1 4 引物合成与序列测定9 2 实验方法9 2 1 剑尾鱼卵黄蛋白原( v g ) 的诱导9 2 2 总r n a 的提取9 2 3 第一链e d n a 的合成9 2 4 剑尾鱼中间片段的克隆9 2 55 末端序列的获得1 2 2 63 末端序列的获得1 4 2 7 序列测定与分析1 5 3 结果1 5 3 1p c r 扩增结果及序列分析1 5 3 2 不同动物卵黄蛋白原序列的同源性比较2 8 4 讨论2 9 4 1s m a r tr a c e 技术2 9 4 2 剑尾鱼卵黄蛋白原的结构与类型3 0 4 3 卵黄蛋白原的进化关系3 l 4 4 剑尾鱼卵黄蛋白原m r n a 检测方法3 1 第二章剑尾鱼v g a 检测方法的建立3 2 第一节剑尾鱼v g a 的原核表达3 2 l 材料与方法3 2 上海水产大学硕士论文：剑尾鱼卵黄蛋白原c d n a 的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立 剑尾鱼卵黄蛋白原c d n a 的克隆、序列分析 及蛋白检测方法的建立 摘要 环境内分泌干扰物( e d c s ) 直接威胁野生动物的生存和人类的健康，对其作 用机制及筛选方法的研究，已经成为环境科学研究的热点领域。e d c s 进入鱼体， 通过与相应的受体结合，可诱导卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i nv g ) 的生成，雄鱼和幼鱼在 正常情况下不合成v g ，当受e d c s 诱导，由于没有卵巢有效地清除v g ，可造成体内 v g 浓度的升高，因而，雄鱼和幼鱼v g 的非正常表达可作为敏感的生物标记物，用 于e d c s 污染评价。 剑尾鱼( x i p h o p h o r u sh e l l e r i ) 体型小，繁殖周期短，在人工条件下常年可以繁 殖，剑尾鱼实验动物化研究历经多年，目前有r r b 、r w - h 、b y f 等不同近交群 体，为不同应用提供了优良材料基础；研究表明，剑尾鱼在环境污染物监测应用 中优势明显，因而，将剑尾鱼作为水环境污染监测生物进行系统研究有较好实用 意义。本文克隆了剑尾鱼3 个v g 基因c d n a 序列，并建立t v g a 蛋白的检测方法， 为剑尾鱼环境应用提供基础。 提取经b 雌二醇诱导的剑尾鱼肝脏总r n a ，根据g e n b a n k 登录的鱼类卵黄蛋白 原m r n a 序列设计引物，通过r t - p c r ，r a c e 等方法克隆得到剑尾鱼卵黄蛋白原家 族的三个基因全c d n a 序列：v g a 、v g b 、v g c 。v g a c d n a 全长5 1 5 9b p ，57 , 1 1 3 7 非编码区分别为1 6b p 署n 8 5b p ，含有一个5 0 5 8b p 的开放阅读框，编码1 6 8 5 个氨基 酸；推测其编码蛋白分子量大小为l8 7 2k d a ；所得序列具有v g a 分子的主要特征 和功能域，包括v i t e l l o g e n i n 结构域、v w f d 结构域和多聚丝氨酸结构域；推导出的 氨基酸序列与食蚊鱼( g a m b u s i aa f f i n i s ) 、底鲻( f u n d u l u sh e t e r o c l i t u s ) 、花鲻( r i v u l u s m a r m o r a t u s ) 等8 种鱼类的v g a 同源性为3 9 9 0 。v g bc d n a 全长5 3 4 9b p ，5 和3 非编码区分别为1 4b p * 1 2 6 8b p ，含有一个5 0 6 7b p 的开放阅读框，编码1 6 8 8 个氨基 酸，推测其编码蛋白分子量大小为1 8 6 8k d a ；所得序列具有v r e l b g e n i n 结构域、 v w f d 结构域和多聚丝氨酸结构域；推导出的氨基酸序列与食蚊鱼、真鲷( p a g r u s m a j o r ) 、底鲻等6 种鱼类的v g b 同源性为5 5 8 9 。v g cc d n a 全长4 0 1 1b p ，5 和 3 非编码区分别为1 2b p 并1 1 2 4 6b p ，含有一个3 7 5 3b p 的开放阅读框，编码1 2 5 0 个氨 摘要 基酸，推测其编码蛋白分子量大小为1 4 1 7k d a ；所得序列具有v i t e l l o g e n i n 结构域； 推导出的氨基酸序列与食蚊鱼、真鲷等4 种鱼类的v g c d - 源性为4 4 8 5 。 在对v g a 所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上，采用p c r 方法对剑尾鱼 v g a 基因进行改造，构建原核表达载体，预期得至1 j 2 5 8 个氨基酸残基组成的表达蛋 白。表达载体转入大肠杆菌d h 5 0 t ，经热诱导，s d s p a g e 分析发现有2 9k d a 的表 达蛋白产生，与预期相符。 重组蛋白初步纯化后，经弗氏佐剂充分乳化，免疫新西兰大白兔，获得抗血 清。雌激素( d 一雌二醇) 对剑尾鱼诱导后，提取肝脏卵黄蛋白原，制备检测样品。 用重组蛋白抗血清作一抗，对制备的检测样品进行w e s t e r n b l o t 分析，结果表明： 获得抗血清能与剑尾f f j v g a 特异结合，识另1 v g a 分子量大小约为1 8 0k d ，与v g a c d n a 推测的编码蛋白分子量大小基本相符。 卵黄蛋白原是环境内分泌干扰物研究中较为特异、灵敏的生物标志物，剑尾 鱼3 个卵黄蛋白原基因的克隆及v g a 蛋白特异抗血清的获得，为卵黄蛋白原分子及 蛋白不同水平检测方法建立打下了基础，是剑尾鱼在环境内分泌干扰污染物监测 与应用研究的重要前期工作。 关键词剑尾鱼，卵黄蛋白原，克隆，检测 上海水产大学硕士论文：剑尾鱼卵黄蛋白原e d n a 的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立 t h e v i t e l l o g e n i no fs w o r d t a i lf i s hx i p h o p h o r u sh e l l e r i ： c l o n i n g ，一 a n da n d e v e l o ：edloning e x p r e s s i o na n da na s s a yd e v e l o o m e n t e d ， a b s 瞰c t e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n sh a v ed i r e c t l yt h r e a t e n e do nt h ee x i s t i n go fw i l d l i f ea n d h e a l t ho fh u m a n b e i n g s t h es t u d yo n t h em e c h a n i s m sa n ds c r e e n i n gm e t h o d so fw h i c h h a sb e e nt h eh o tt o p i c si ne n v i r o n m e n t a lr e s e a r c h r e c e n t l y , v i t e l l o g e n i n ( v g ) h a sb e e n s t u d i e de x t e n s i v e l ya sab i o m a r k e rf o rt h es c r e e n i n go fe n v i r o n m e n t a le n d o c r i n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s s w o r d t a i lf i s h ( x i p h o p h o r u sh e l l e r ih e c k e l18 4 8 ) i sas m a l ls c a l et r o p i c f r e s h w a t e rf i s hw h i c hb e l o n g st oc y p r i n d o n t i f o r m e s ，c y p r i n o d o n t i d a e ，x i p h o p h o r u s i t i ss u i t a b l et ob eu s e da sa q u a t i cl a b o r a t o r ya n i m a lw i t ht h ec h a r a c t e r so fs h o r t p r o p a g a t i o np e r i o d ，s t r o n gr e p r o d u c t i v ec a p a c i t ya n de a s yb r e e d i n g p e a r lr i v e r f i s h e r i e sr e s e a r c hi n s t i t u t e ，c a f s b e g a nt oi n b r e e di ta sl a b o r a t o r ya n i m a ls i n c e19 8 7 a n dt h es w o r d t a i lf i s hr r b ( r e de y ea n dr e db o d y ) i n b r e ds t r a i nh a sr e a c h e dt o2 8 n 8 g e n e r a t i o n r e s e a r c h e so ni t sb i o l o g i c a lc h a r a c t e r , d i e ta n dn u t r i t i o n ，d i s e a s ea n dd i s e a s e m o n i t o r i n ge t c i n d i c a t et h a ts w o r d t a i lf i s hi ss u i t a b l ef o rg e n e t i c s ，t o x i c o l o g y , b a c t e r i o l o g y , m a l n u t r i t i o ns y m p t o ms t u d ya n ds oo n i nt h i ss t u d y , w es h o wt h r e ef o r m sf u l l l e n g t hc d n a s e q u e n c eo fs w o r d t a i lf i s h v g sg e n e ：v g a ，v g ba n dv g c t h ef u l l - l e n g t hc d n a so fs w o r d t a i lf i s hv gg e n ew e r e o b t a i n e du s i n gr t - p c ra n dr a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n a e n d s ) p c r a m p l i f i c a t i o no ft o t a lr n a e x t r a c t e df r o ml i v e ro fas w o r d t a i lf i s hw h i c hw e r ei n f e c t e d w i t h1 3 - e s t r a d i 0 1 t h er e s u l to f s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ef u l ll e n g t ho f s w o r d t a i lf i s hv g ae d n ai s515 9b p ，c o n t a i n i n ga no p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f5 0 58 b pe n c o d i n ga18 6 5a m i n oa c i d sp r o t e i nw h o s ed e d u c e dp r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h ti s 18 7 2k d a ；t h ec l o n e de d n a p o s s e s s e sa l lc h a r a c t e r i s t i cm o t i f so ft e l e o s tv g ag e n e s i n c l u d i n gt h ev i t e l l o g e n i nd o m a i np r o f i l e ，v w f dd o m a i np r o f i l e ，a n ds e r i n e - r i c h r e g i o np r o f i l e ；c o m p a r i n gs w o r d t a i lf i s hv g ac d n aw i t he i g h tt e l e o s t s ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h en u c l e o t i d eh o m o l o g yw a sb e t w e e n5 9 - 9 5 a n da m i n oa c i dh o m o l o g y b e t w e e n3 9 - 9 0 t h er e s u l to fs e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef u l ll e n g t ho f i i i s w o r d t a i lf i s hv g bc d n ai s5 3 4 9b p ，c o n t a i n i n ga no p e n r e a d i n gf l a m e ( o r f ) o f5 0 6 7 b pe n c o d i n ga16 8 8a m i n oa c i d sp r o t e i nw h o s ed e d u c e dp r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h ti s 18 6 8k d a ；t h ec l o n e dc d n a p o s s e s s e sa l lc h a r a c t e r i s t i cm o t i f so f t e l e o s tv g bg e n e s i n c l u d i n gt h ev i t e l l o g e n i nd o m a i np r o f i l e ，v w f dd o m a i np r o f i l e ，a n ds e r i n e - r i c h r e g i o np r o f i l e ；c o m p a r i n gs w o r d t a i lf i s hv g bc d n aw i t hs i xt e l e o s t sv g b t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h en u c l e o t i d eh o m o l o g yw a sb e t w e e n7 1 9 4 a n da 埘【i 1 1 0a c i dh o m 0 1 0 9 y b e t w e e n55 8 9 t h er e s u l to f s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h em l ll e n g t ho f s w o r d t a i lf i s hv g cc d n ai s4 011b p ，c o n t a i n i n ga no p e n r e a d i n gf l a m e ( o e d ：) o f3 7 5 3 b pe n c o d i n ga12 5 0a m i n oa c i d sp r o t e i nw h o s ed e d u c e d p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t i s l 4 1 7k d a ；t h ec l o n e dc d n aa l s oi n c l u d i n gt h e v i t e l l o g e n i nd o m a i np r o f i l e ； c o m p a r i n gs w o r d t a i lf i s hv g cc d n aw i t hf o u rt e l e o s t sv g c ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e n u c l e o t i d eh o m o l o g yw a sb e t w e e n5 7 9 2 a n da m i n oa c i dh o m o l o g vb e t w e e n 4 4 - 8 9 t h ev g ac d n aw a sm o d i f i e db yp c ra n da7 9 3 b ps e q u e n c ew a sl i n k e di n t o p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp b v 2 2 0t oc o n s t r u c t e de x p r e s s i o np l a s m i dp b v s v t g ，a n d t h ep l a s m i dp b v s v t gw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l i ( d h 5 a ) a f t e rt e m p e r a t u r e i n d u c e m e n t ，as p e c i a lp r o t e i na b o u t2 9k d ai nm o l e c u l a rw e i g h tw a sd e t e c t e db y s d s p a g ea n a l y s i s t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a si n d u c e da n dp u r i f i e d ，a n d i m m u n i z e dt h en e wz e a l a n dr a b b i sf o ra n t i s e r u mp r o d u c e d w e s t e r n - b l o ta n a l y s i s s h o w e dt h ea n t i s e r u mc a n r e c o g n i z et h ev g a o fs w o r d t a i lf i s hs p e c i f i c a l l y t h i ss t u d v p r o v i d eab a s i st oe s t a b l i s haq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o nm e t h o do fs w o r d t a i lf i s h v i t e l l o g e n i n ，t h er e s u l t sa l s oi n d i c a t et h a tt h es w o r d t a i lf i s hc o u l db eu t i l i z e da sau s e 如l m o d e lf o ra s s e s s i n ge s t r o g e n i ce f f e c t so fe n d o c r i n ed i s r u p t i n gc o m p o u n d si na q u a t i c e n v i r o n m e n t k e yw o r d s x i p h o p h o r u sh e l l e r i ，v i t e l l o g e n i n ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n , d e t e c t i o n i v 上海水产大学硕士论文：剑尾鱼卵黄蛋白原c d n a 的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立 引言 一、研究背景 环境中许多污染物具有干扰动物及人体内分泌系统的特征，这类物质通称为 “环境内分泌干扰物( e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t o r s ) ”。环境内分泌干扰物外源 性干扰生物正常的内分泌机能，并对生物( 主要为动物) 体内的正常激素功能施加影 响，能导致包括人类在内的各种生物的生殖功能下降、生殖器肿瘤、免疫力降低， 并引起各种生理异常。环境雌激素污染不仅危害生物体的健康，对生物生存和繁 衍也造成威胁，已成为大众关注的重大环境问题。 环境内分泌干扰物一般化学性质稳定，存在于生活和工作环境中各个角落， 可通过食品、水、空气等进入机体，并直接或间接影响正常的激素代谢。目前， 各国大部分水域都发现环境内分泌干扰物质的存在，并对水域周围的生物产生不 良影响【l 】。我国的部分海域以及长江、嘉陵江流域也发现了环境内分泌干扰物质1 2 】。 环境内分泌干扰物质对生物的危害已有诸多报导，如佛罗里达州湖中的鳄鱼 出现雌性化现象；北美五大湖中的鳟鱼及其它鲑鳟鱼类出现胚胎死亡率增高、胚 胎发育障碍和雌性化现象等【3 】。环境内分泌干扰物质可以在有机体内模仿内源性激 素作用，其作用机制是亲代化合物或代谢物直接与激素受体相互作用对生物体产 生影响或者是通过与生殖中枢的相互作用间接产生影响1 4 】。 环境内分泌干扰物质种类繁多，进行系统的化学分析需要花费巨大的人力、 物力，且对仪器的依赖性较高；多种污染物在环境中共存的现象非常普遍，所引 起的环境问题通常是多种污染物复合作用的结果，化学方法也不能体现污染物之 间相互作用的信息。污染物的环境危害主要体现在其对生物体的毒害作用上，利 用生物的毒性伤害状况进行环境监测，可对污染总体效应有直观、综合的评价【5 j 。 建立关于环境内分泌干扰污染物毒性伤害的生物模型并应用于水环境监测，在此 基础上结合化学方法的使用，可更全面地评价水环境污染状况。 环境中内分泌干扰物质一般含量较低，不导致生物的急性死亡，这类污染物 对生物体是长期、低剂量的胁迫；传统的生物检测方法和技术所采用的各种指标 大多数指示环境因子在个体、种群、群落和生态系统水平上的影响，虽然具有较 高的生态相关性，可以反映污染物对生态系统的整体影响，但个体差异较大，耗 时长，阐明的是后期效应，缺乏预警价值。各种外源环境污染物进入生物体到达 靶位点，引起分子水平的生物化学反应，如蛋白质合成受阻等，然后是一系列生 理的继发反应，再表现为整个机体可观察的毒性反应。因此，污染物对生态系统 引言 或个体的影响不论多么的复杂，最早的影响必然是从分子水平开始，然后在细胞、 器官、个体、种群、生态系统各个水平上反映出来。这些发生在分子、细胞及个 体水平上的早期生理、生化变化有助于确定生物体所处的污染状态和潜在危险， 为更严重的毒性伤害提供早期警报【6 1 。分子和细胞水平上的早期变化可作为生物标 记物( b i o m a r k e r ) 用于污染物的早期检测研究中。 二、卵黄蛋白原的研究进展 卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ，v g ) 是卵生动物中卵黄蛋l 刍( y o l kp r o t e i n ) l 拘前体i 7 1 ，最 初是p a n 等人( 1 9 6 9 ) 对雌性昆虫血液淋巴蛋白的特指称呼【引，后来广泛地把卵生动 物卵黄形成过程中雌性个体血浆中大量存在的含磷、糖、脂的大分子蛋白称为卵 黄蛋白原。卵黄蛋白原( v g ) 裂解为卵黄蛋白后，为卵生动物卵子的形成及胚胎发育 提供充足的营养，对其正常发育起着非常重要的作用。 1 卵黄蛋白原( v g ) 的生物合成和运转 卵黄蛋白原( v g ) 是卵黄蛋白的前体，因而研究卵黄蛋白的来源有利于搞清卵黄 蛋白原的合成运转途径。卵子发生过程中，卵黄对于胚胎发生所需的营养物质的 提供具有重要作用。卵黄形成有两种方式：一是可以从卵母细胞本身合成，称为 内源性卵黄合成或自动合成( a u t o s y n t h e s i s ) ；二是从卵母细胞以外的地方合成，然 后进入卵母细胞，称为外源性卵黄合成( h e t e r o s y n t h e s i s ) 。几乎所有的脊椎动物都是 外源性卵黄合成。v g 在肝脏合成，通过血液运送到卵巢，被卵母细胞吸收后裂解 成卵黄蛋白1 9 1 。 2 卵黄蛋白原( v g ) 的结构 不同物种的v g 在结构上有许多不同。甲壳类动物v g 通常脂含量很高( 2 8 3 0 ) 并且含有非共价结合的类胡罗卜素。昆虫的v g 结构多样，通常由许多大小不同的 亚基构成【10 1 。在两栖类、鸟类和鱼类中，v g 通常是由两个1 7 0 2 2 0 k d a 的同源二聚 体组成【1 1 , 1 2 】。大部分高等脊椎动物卵黄蛋白原都含有糖、磷和脂，其氨基酸一级结 构的n 端是由约1 1 0 0 个氨基酸残基组成的脂磷蛋白i 部分，c 端为脂磷蛋白i i 部分、 卵黄磷蛋白和卵黄糖蛋白部分，中间由富含磷酸化丝氨酸的高磷蛋白组成，三个 主要区域组成卵黄蛋白原的单体分子【1 3 , 1 4 j 。 鱼类卵黄蛋白原的相关研究颇受关注，通过色谱层析、电泳以及免疫化学等 方法，一些鱼类卵黄磷蛋白l v 和高磷蛋t 兰t p v 也已经被纯化和鉴趔1 5 , 1 6 】。h i r a m a t s u 等人从哲罗鱼( h u c h o p e r r y i ) 中分离得到了v g 和l v ，p v ，p 等成分【1 1 7 1 ，其中p 成分 为不含磷和脂的小分子蛋白，免疫交叉反应证明其来自卵黄蛋白原，故被定义为 与v g _ t 关的又一种卵黄蛋白。 2 上海水产大学硕士论文：剑尾鱼卵黄蛋白原c d n a 的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立 表1 已经登陆的鱼类卵黄蛋白原全长c d n a t a blc o m p a r i s o no ff i s hv gc d n a v g 基因属于多基因家族，起源于同一个基因。目前证实爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 有4 种v g 编码基因【1 8 】，鸡( g a l l u sg a l l u s ) n 3 + v g 基n t l 9 】。研究发现鱼类也有不止 - ；f e o v g 的形式存在。早在1 9 9 0 年，n a g l e r 就发现比目鱼( p s e u d o p l e u r o n e c t e s a m e r i c a n u s ) 0 0 有两种不同的类v g ，它们是高密度的脂蛋白，都被正在发育的卵母 细胞吸收并产生卵黄蛋白【2 0 1 。随后在底_ 鳞( f u n d u l u sh e t e r o c l i t u s ) 【2 l 】、条斑星鲽 ( v e r a s p e rm o s e r f ) 和黑线鳕( m e l a n o g r a m m u sa e g l e f i n u s ) 2 3 】中也相继发现有两种 3 引言 不同类型的卵黄蛋白原v g a 、v g b 存在，这两种卵黄蛋白原都包含了完整的卵黄蛋 白原结构，即：n 端卵黄脂磷蛋白重链、卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白轻链、d 组 分。另外，还有一种含磷量较低、分子量较小的卵黄蛋白原v g c 也在莫桑比克非鲫 ( o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c u s ) 【2 4 】和青鲻( d 仳f 伽l a t i p e s ) 2 5 】体内被发现。 随着分子生物学技术在鱼类卵黄蛋白原研究中的广泛应用，己在十几种鱼类 中获得卵黄蛋白原全长c d n a ( 见表1 ) 。其中底鲻、青鲻、条斑星鲽、黑线鳕、黄 鳍刺缎虎鱼似c a n t h o g o b i u sf l a v i m a n u s ) 已克隆了2 种形式c d n a 全序列，食蚊鱼 ( g a m b u s i aa f f i n i s ) 、真鲷( p a g r u sm a j o r ) 分别获得3 种形式c d n a 全序列，而斑马鱼 ( d a n i or e r i o ) 贝, 1 有5 种形式的c d n a 全序列发现。 三、鱼类卵黄蛋白原在环境内分泌干扰物质监测研究中的应用 鱼类的卵黄蛋白原是在激素的严格控制下产生的。在成熟雌鱼体内，下丘脑 和垂体分泌的激素经血液循环到滤泡细胞，诱导滤泡细胞产生雌性激素，经血液 循环到达肝细胞，与肝细胞膜上的激素受体结合形成激素一受体复合物，使得受体构 象发生变化，与卵黄蛋白原基因上特定启动子序列结合，开启卵黄蛋白原基因， 表达产生卵黄蛋白原，分泌到血液中。卵黄蛋白原经血液循环到达卵母细胞，与 卵母细胞表面的v g 受体结合，然后通过内吞作用进入卵母细胞。雄鱼和幼鱼在正 常情况体内雌激素含量很低，不能刺激肝细胞合成卵黄蛋白原，但体外雌激素或 环境内分泌干扰物质也能与鱼体内的激素受体结合形成激素一受体复合物，诱导生 成卵黄蛋白原，由于没有卵巢有效的清除卵黄蛋白原，造成体内卵黄蛋白原浓度 的升高。因此，雄鱼和幼鱼卵黄蛋白原的非正常表达可作为一种生物标记物，评 价环境污染物的内分泌干扰作用【2 6 , 2 7 。目前水体环境污染日益严重，大量外源激 素被排放到水体中，由于这些具有激素扰乱活性的化合物已经对动物的发育和繁 殖造成了破坏性的影响，所以对环境中内分泌干扰污染物进行监测就显得尤为重 要【2 引。许多学者已经将鱼类卵黄蛋白原作为生物指标应用于水环境内分泌干扰污 染物监测的研究。经济合作与发展组织( o e c d ) 推荐鱼类卵黄蛋白原作为环境雌 激素理想的暴露标志物【2 引。 鱼类卵黄蛋白原的检测可在蛋白和基因等不同水平进行，蛋白的检测方法包 括免疫印迹( w e s t e m - b l o t ) 和竞争性酶联免疫吸附( e l i s a ) 【3 0 】。l o u i s e 等通过对鲦鱼 ( p i m e p h a l e s p r o m e l a s ) v g 的诱导，纯化获得鲦鱼v g 并制备特异性抗体，发现这种免 疫学检测方法可以检查水体环境中激素类污染物的情况【3 。a k i h i r o 证明不同浓度 的雌二醇诱导不仅能造成罗非鱼血液中总体v g 的浓度不同，并且肝脏中不同分子 量的各种形式的v g 的相对含量也发生变化【3 2 】。对黑头软e l 鲦【3 3 】、青鲻【3 4 】、虹鳟 ( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 1 35 1 、大西洋鲑( s a l m os a l a r ) 1 3 6 1 、大西洋牙鲆( p a r a l i c h t h y s 4 上海水产大学硕士论文：剑尾鱼卵黄蛋白原e d n a 的克隆、序列分析及蛋白检测方法的建立 d e n t a t u s ) t 3 7 j 等的研究也表明，通过鱼类v g 浓度的检测，能敏感而有效地筛选雌激 素样物质。除了对蛋白的定量检测外，学者利用被诱导卵黄蛋白原的m r n a 水平 作为监测指标，也收到了明显的效梨3 8 ，3 9 】。 研究还表明：不同种属的鱼类、两栖动物及鸟类卵黄蛋白分子n 末端氨基酸 序列具有4 0 1 0 0 的同源性【4 引，利用这段同源性序列制备的抗体，能够检测不 同种属动物的v g ，为卵黄蛋白原的环境雌激素监测提供了广阔的应用前景。 h e p p e l l 利用v g 分子的保守区域制备的虹鳟鱼v g 的单克隆抗体能特异地识别鱼、 两栖类、爬行类和鸟类4 种代表性物种血浆中的v 9 1 4 1 1 。另外，利用v g 的n 末端 保守氨基酸序列合成的同源多肽而制备的多克隆抗血清，能特异识别多种硬骨鱼 的血浆v g 。t y l e r 等用大西洋鲑v g 制备的单克隆抗体，能用来检测虹鳟鱼的v g ， 其定量能力与虹鳟鱼同源多克隆抗体并无多大差另l j t 4 引。 四、剑尾鱼在环境监测中的应用与优势 鱼类属低等脊椎动物，在水生系统中处于食物链的重要位置，是水生生物不可 或缺的代表，作为生态毒理研究材料有较好的代表性。鱼类生活于水中，毒性试 验时操作极为方便，特别是耗时长的慢性环境毒性试验，管理上也比较经济。利 用鱼类动物对环境污染物进行生物监测，与理化分析手段相比，具有直观、客观、 综合和历史可溯源性的特点，能真实直接地反映环境污染的客观状况，这种综合 性和真实性是化学监测所无法比拟的。 剑尾鱼在不同领域有良好应用前景，中国水产研究院珠江水产研究所从1 9 8 7 年便开始了剑尾鱼的定向培育和相关的实验动物化研究工作，从剑尾鱼近交培育、 生物学基础研究、遗传和遗传纯合度检测、水环境需求与人工生态、营养需求与 人工饲料、疾病普查和监控、日常管理规范、应用等各方面进行系统研究，目前 主要有3 个不同体征剑尾鱼近交系( 群) ，其中r r b ( 红眼体红) 系达到了第2 7 代，r w - h ( 红眼体白) 达1 5 代，b y - f ( 黑眼体橘红) 达1 4 代。经多年培育，剑 尾鱼群体问具较高的遗传均一性，饲养过程已实现营养标准化和管理规范化，使 得其在应用中有好的反应一致性和可重复性，保证了结果的准确性、可信度和可 比性，从而提高相关应用领域的研究水平。 剑尾鱼r r - b 系己通过了全国水产原良种审定委员会的审定，品种登记号为： g s 0 1 0 0 3 2 0 0 3 ，并由农业部第3 4 8 号公告公布。公告明确了剑尾鱼r r - b 系为适 用于水环境监测、水产药物安全性评价、化学品毒性检测、动物疾病模型等领域 的水生实验动物。r r b 系为我国首个通过审定的鱼类品系，填补了国内无水生实 验动物品系的空白。 5 引言 研究发现，剑尾鱼在环境监测等领域有好的应用前景：剑尾鱼对甲胺磷、马 拉硫磷、敌百虫等有机磷农药比白鲢、斑马鱼、金鱼等鱼类敏感，说明剑尾鱼在 有机磷农药污染监测上是较好鱼类实验材料【4 3 】。华南师范大学水生生态实验室将 剑尾鱼应用于p c b s ( 多氯联苯) 、d d t s ( 滴滴涕) 、h c h s ( 六氯环己烷) 等持久 性有机污染物的检测中，认为剑尾鱼是水生生态环境研究的理想实验材料，其中 p c b s 对剑尾鱼幼鱼9 6 h 的半致死浓度为2 0 6 3u g l ，说明剑尾鱼对p c b s 胁迫比国际 标准化组织( i s o ) 推荐使用的斑马鱼和黑头软口鲦敏感，在p c b s 监测中的应用前 景更为广阔【4 4 , 4 5 】。剑尾鱼在苯酚、苯、硝基苯等1 2 种典型污染物应用中得到很好 的实验结果，国家环境保护化学品生态效应与风险评估重点实验室认为剑尾鱼是 毒理学研究的好材料【46 。慢性毒性试验表明，不同浓度的对壬基苯酚对雄性剑尾 鱼性腺发育的影响有显著性差异，具良好剂量一效应相关关系，且剑尾鱼雌雄个体 间形态差异大，容易判别，在环境雌激素效应方面的研究时可以考虑推广使用【47 1 。 五、研究思路 本研究拟以剑尾鱼为实验材料，剑尾鱼卵黄蛋白原为生物标记物，建立环境 内分泌干扰物质检测方法。通过克隆剑尾鱼卵黄蛋白原基因的全长e d n a 序列， 依据序列设计特异性引物，建立生物标记物基因水平的检测方法；对其编码的蛋 白质及其结构进行分析，采用原核表达获得目标蛋白质并制备特异性抗体，建立 生物标记物蛋白水平的定量检测方法，为剑尾鱼环境监测模型的建立提供基础。 6 上海 第一章剑尾鱼卵黄蛋白原全长c d n a 的克隆与序列分析 第一章剑尾鱼卵黄蛋白原全长c d n a 的克隆与序列分析 1材料 1 1 实验动物 剑尾鱼，4 5 月龄，为珠江水产研究所培育。 1 2 菌株与质粒 大肠杆菌d h 5 a 由本实验室保存。p g e m te a s yv e c t o rs y s t e m 为p r o m e g a 公 司产品。 1 3 工具酶和试剂 t a k a r ar n ap c rk i t ( a m v ) v e r 3 0 、t a k a r aa g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i t v e r 2 0