（临床兽医学专业论文）洛克沙胂残留的生态毒理研究.pdf

张雨梅：洛克沙胂残留的生态毒理研究 主，且具有较高的移动性。通过对吸附常数k d 与土壤有机质含量、c e c 和土壤溶 液p h 值的关系进行分析，发现土壤有机质含量、c e c 量和土壤溶液p h 值在吸 附过程中均属支配因素，k d 与土壤有机质含量、c e c 量、土壤溶液p h 值呈负相 关。 不同淋洗液水、0 0 1 m o f lc a c h 和0 0 1 m o l le d t a - n a 2 对洛克沙胂在不同深 度土壤中的淋洗作用不同。水对表层土和b t 2 土中r o x 有较好的淋洗作用，而在 b t l 土中，0 0 1 m o l l e d t a n a z 有较好的淋洗作用；鸡粪浸提液的主要成分为有机 质t 加入鸡粪浸提液是为了模拟畜禽粪便中有机质与r o x 进入土壤后的淋溶迁 移。从淋洗率来看，r o x 在不同深度土壤中被水、0 0 1 m o f lc a c | 2 和0 0 1 m o f l e d t a - n a 2 淋洗率在7 2 3 1 0 0 4 ，说明r o x 在土壤中的迁移是水溶性的，可 在不同深度的土壤中迁移，在土壤中未发现有明显吸附和赋积行为。但洛克沙肿这 种水溶性的迁移，可能会较快地进入地表水和地下水中，造成对水环境质量的影 响。 在1 0 0 m e l 洛克沙胂诱导斑马鱼h s p t 0 、h s c 7 0 及h s f l 表达试验中，通过 免疫组织化学、r t - - p c r 和荧光定量p c r 分析，结果表明洛克沙胂可诱导斑马鱼 鳃、性腺和肝脏组织表达h s p 7 0 、h s c 7 0 及h s f l 。免疫组化显示h s p 7 0 在鳃的 基底组织、鳃弓、平滑肌、鳃小片的上皮细胞及红细胞的胞质中有表达：在睾丸和 卵巢的基质细胞的胞质中有强阳性黄色颗粒；在肝脏组织中，多见中央静脉周围及 红细胞胞质中有较淡的黄色表达。荧光定量p c r 结果说明斑马鱼性腺、鳃和肝脏 中h s p 7 0 、h s c 7 0 和h s f l 三种基因在洛克沙胂诱导后1 2 h ，均有最高表达。相对于 空白组织的表达量，1 2 h 时性腺中这三种基因的表达倍数，性腺中达2 6 4 3 、 1 3 7 0 、1 7 5 3 倍；鳃中分别为5 2 8 9 、3 4 8 3 、5 9 3 l 倍：肝脏中分别为4 5 9 、3 8 2 、 3 3 2 倍。从表达峰值来看，这三种基因在鳃中表达最高，性腺中次之，肝脏中最 少。在诱导6 h 时，鳃组织中这三种基因的表达即分别达4 9 7 、2 5 0 、1 8 6 l 倍；肝 脏中表达量分别为1 7 5 、2 2 4 、1 7 7 倍；而性腺中分别为1 0 5 、o 6 2 、1 8 9 倍。从 时间上来看，这三种基因的诱导表达启动鳃最早，肝脏次之，性腺相对较晚。综上 所述，h s p 7 0 及相关蛋白显示出作为生物标志物在有机胂环境污染中应用的可能 性，还有待进一步深入研究。 关键词：洛克沙胂；生态毒理；兽药残留；热休克蛋白7 0 ；荧光定量p c r i l l 扬州大学博士学位论文 s t u d i e so nt h ee e o t o x i c i t yo fr o x a l r s o l l er e s i d u e 1 1 l eo r g a n o a r s e n i er o x a l s o n e o r i g i n a l l yu s e dt oa i di nt h ec o n t r o lo fe o c e i d i o u s 雒 aa d d i t i v ea d d e dt op o u l u - yf e e d ，i sn o wu s e df o rg r o w t hs t i m u l a t i o n , i m p r o v e df e e d c o n v e r s i o n , b e t t e rf e a t h e r i n g ，i n c r e a s e de g gp r o d u c t i o n , a n dp i g m e n t a t i o n r o x a r s o n ea n d a r s a n i l i ea c i da l et w oo r g a n o a r s e n i ec o m p o u n d sp e r m i t t e da sa n i m a lf e e da d d i t i v e si n c h i n a , t h ef o r m e ri su s e dm o l et h a nt h el a t t e r r o x a r s o n ei se x a 陀_ t c dm a i n l ya si t sl 招r e r a d r u gi na n i m a li n a n l l r e d u r i n gt h e4 2 - d a y sg r o w t hp e r i o d ，e a c hb r o i l e re x c r e t e sa b o u t 1 5 0m go f r o x a s o n e ，r e s u l t i n gi nat o t a la sc o n c e n t r a t i o no f1 0 - 5 0m e c k gi np o u l t r yl i t t e r p o u l t r yo rl i v e s t o c kf i t t e r , w h i c hi sam i x t u r eo f a n i m a ln l a n u r ea n db e d d i n gm a t e r i a l ，h a s w i d e s p r e a du s ea saf e r t i l i z e ri nt h ew o r l d t h el o x a l 5 0 1 1 - e1 1 1 1 1i n t oe n v i r o n m e n tw i t ht h e u s eo f m a n u r ef e r t i l i z e r s w h i c hu s u a l l yb en o tt r e a t e db yd e t o x i e i t yt e c h n i c a lp l o c 鹤$ i n c h i n a , m a ya f f e c tt h eq u a l i t yo f s o i la n ds u r f a t 弛o ru n d e r g r o u n dw a t e r h e a ts h o c kp r o t e i n so t s p s ) f i l es e v e r i a lf a m i l i e so fp r o t e i n sw h i c ho r g a s m s s y n t h e s i z eb yi n d u c i n go fs t r e s s o r s h s p si sh i g l l l yc o n s e r v e d , a n dn a yf t i m p o r t a n tr o l e i n t h es u r v i v a l o f s t r e s s e d c e l l s a n ds t a b i l i z a t i o n o f i n t e r n a le n v i r o n m e n t h s p s a m u s u a l l y i d e n t i f i e df o rc l a s s e s , n a m e l yt h eh s p g of a m i l y , t h eh s p 7 0f a m i l y , t h eh s p 6 0f a m i l ya n d t h es m a l lm o l e c u l a rh s p sf a m i l y i nh s p s , t h eh s p 7 0f a m i l yi st h em o s tc o n v e r s e d , t h e m o s ti m p o r t a n tf a m i l ya n dm o r er e s p o n s et os t r e s st h a nt h eo t h e rf a m i l yo f l i s p s 。s t u d i e s s h o wh s p 7 0c f l l nb eu s e da sab i o m a r k e rt os e v e r a ls l r c s s l 眵, a n di sm o r eu s e di nt h e m o n i t o r i n go f e n v i r o n m e n tp o l l u t i o n t h ee x p e r i m e n t a ld o s e so fr o x a l s o n l 。a 地d e s i g n e db a s e do nt h el e v e lo f “”【部瞎伽c r e s i d u ei na n i m a ll e t t e r t h ee e o t o x i c i t yo f r o x a r s o n er e s i d u eo i ls o i l 、e e x p e r i m e n t e c l b yf o l l o wa s p e c t s f i r s t l y , t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fl o x a r s o n er e s i d u eo n r e s p i r a t i o n , t h en 0 2 - nc o n c e n t r a t i o na n dt h en h 3 - nc o n t e n to fe x p e r i m e n t a ls o i lw c i t 七 s t u d i e d a tt h e 鞠m et i m e ，t h ea c t i v i t yo f p h o s p l a o r l a s e ，c a t a l a s l ：，p r o t e i n a s ea n du 托a o f s o i lt r e a t e db yl o x a r s o n ew 讹a l s ot e s t e d s e c o n d l y , t h ev e g e t a b l e so fp a k e h o ic a b b a g e a n dt o m a t ow e r ep l a t e di nt h ep o l l u t e ds o i ll r e a t e db yd i f f e r e n tl e v e lr o x 卸薯o n e t h e i v 张雨梅：洛克沙胂残留的生态毒理研究 g r o w t hp a r a m e t e r s r 饿m e a s u r e , da n dt h ec h a n g e so fa sc o n c e n t r a t i o ni nt h e s ep l a n t s w e r em o n i t o r e d t h ec o n c e n u a f i o nc u eo fr o x m s o n ei nt e s t e ds o i lw e r eg r a p h e d t h i r d l y , t h ea d s o r p t i o na n dm o b i l i t yo fr o x a r s o n ei ns o i lw e r ea n a l y 勰dw i t hv a r i o u s l e a c h i n gs o l u t i o n sa n d w i t ho rn oo r g a n i cn l a 蹴f i n a l l y , t h et i s s u es p e c i f i ci n d u c t i o no f z e b r a f i s hh s p 7 0r e s p o n s et or o x a r s o n ew a sm a d ef o rt h eu s eo fh s p 7 0b i o m a r k e ri nt h e e n v i r o n m c a tp o l l u t i o n i nt h ee x p e r i m e n t so f r o x a r s o n ep o l l u t et os o i l , s i xg r o u p sw e r ed i v i d e d , t h en o r m a l c o n t r o l ，2 0 ，5 0 ，8 0 ，1 5 0a n d2 5 0m 埏r o x a r s o n er e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so fr o 髓啪n e r e s i d u e so ns o i lb i o c h e m i c a la s p e c t s ( s o i lr e s p i r a t i o n , s o i la m m o n i f i c a t i o na n ds o i l n i t r i f i c a t i o n ) a n dt h ea c t i v i t yo f p h o s p h o r l a s e ，鹊e ，c a t 面a s ea n dp r o t e i n a s eo f s o i lw e l e m e a s u r e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ee f f e c t so fr o x a r s o n er e s i d u e sw e r ev a r i a b l eo nt h e s e p r o c e s s e s t h es o i lr e s p i r a t i o nw a ss o m ee n h a n c e dd u r i n g4 6 da f t 盯t r e a t i n gb y r o x a r s o n e ，b u tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) c o m p a r i n gw i t ht h ec o n t r o l g r o u p t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so h s o i ln i t r i f i c a t i o nw e r em o r eo b v i o u sw i t ht h er o x & r s o i i e d o s ei n c r e a s e d t h e8 0m g k ga n d1 5 0 m g k gg r o u p sh a ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i t o r ye f f e c t s o v e rt h ew h o l ee x p e r i m e n tp e r i o d s ( p o 0 5 ) t h es o i la m m o n i f i c a t i o nw a sw e a k e n e di n 2 0m g k ga n d5 0 m g k gr o x a r s o n eg r o u p sa f t e rt r e a t e d2 d ( p 0 0 5 ) ，a n dw a ss t r o n g l y w e a k e n e da t8 0 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r o o tm a yb en oa f f e c t e dv i s i b l y b e l o wt h e d o s eo f8 0 m g k g ，r o x a r s o n ea p p e a ro b v i o u s l ye n h a n c i n ge f f e c tt ot h ew e i g h ta n dt o t a l l e n g t ho f t o m o t aw h i l ei ts e e m si n h i b i t o r yp h e n o r a i n a a tt h eh i g h e rl e v e lo f g o m g l 【g t h e r o o tl e n g t h 聃镪r e d u c e dc l e a r l ya t1 5 0 , 2 5 0 m g k gr o x a r s o n ei ns o f t t h em a x i m u mu p t a k e ( t o t a la r 蝴c ) i np a k c h o ia n dt o m o t ac o m ef o r t ht h et i m eo f5 0d a y s # a n t e d t h e v 扬州大学博士学位论文 e l i m i n a t i o nr a t ei nt o m o l as e 眦m o t er a p i d l yt h a ni np a k e b o i t h et o t a l 翻甚锄i cc o n t e n ti n t o m o t aw a sb e l o w3 m k gl 巾t h ed a yo f9 0 t hp l a t e dw h i l et h ec o n t e n ti np a k c h o iw a s n l o r et h a n1 2 m g k gt i l lt h ep l a n th a dp l a n t e di ns o i l st r e a t e db y1 5 0a n d2 5 0 m g ，l 【g i o x a l s o n ef o r1 0 0a a y s i ti ss e e m d 也a 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d i t i o n l e v e l so f0 2 ，2 0 ，1 0 0 l i l 酊( gw e l e8 1 6 0 + 3 6 8 8 4 1 2 + 3 2 5 a n d9 2 8 2 2 3 8 r e s p e c t i v e l yw i t hl o w e rt h a n 弼o f r s d t h el o do fo 0 4 m g k ga n dl o qo fo 2 m 拈g w e 坞o b s e r v e d a t6 0 t hd a yp l a n t e d t h er o x a l s o n ee o r l t c n ti np o l l u t e ds o i lw 鹬1 t i o i et h a n 6 m g k g ( 6 4 2 2 2 8 6 m g & g ) i ts h o w s t h a tt h er a t eo f r o x a r s o n ee l i m i n a t i o nm a yb es l o w , m eh a l f l i f eo f r o x a r s o n ei ns o i li sa b o u t2 2 6 4 4 9d a y si f t h ee l i m i n a t i o ni ss i m u l a t e do n l i n e a rl e m o v em o d e l u s i n gb a t c he x p e r i m e n t s ，t h es o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c so f r o x a r s o n et oa p a n db ts o i l s i no u rc a m p u sg a r d e nw e r ci n v e s t i g a t e d r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tl o x a r s o n e 如捌i n o t e t ob ts o i l st h a nt oa ps o i l b u to n l ys h o w e dm o d e r a t et ol o ws o r p t i o no n t oe x p e r i m e n t a l s o i l s t b ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so f r o x a r s o n ei ns o i l sf i t t e dt h ef e t t e rl i n e a re q u a t i o nw e l l ， a n dt h ea d s o r p t i o nv a l u e so f r o x a r s o n e ，c a l c u l a t e db yf e t t e re q u a t i o n , r a n g e df r o mo 1 9 4 1 t o0 5 9 7 9 f u r t h e rc a l c u l a t i o na n da n a l y sw e r ea b o u tk o c 。t h em e a np a r t i a lf r e ee l l e r 盱 a n dt h ef l e ee n e r g yo fa d s o r p t i o no fr o x a r s o n eo ns o i lp e r f o r m e x lh i g h e rt r a n s l o e a t i o ni n s o i l s f u r t h e r m o r e ，i tw a sf o u n dt h a tt h ek dv a l u e si n c r e a s e dw i t hd e c r e a s i n go f o r g a n i c m a t t e r ( o m ) ，c a t i o ne x c h a n g ec a p a c i t y ( c l j c ) e o n t e n ta n dt h ep hv a l u e so f s o i ls o l u t i o n i ti n d i c a t e dt h a to m ，c e cc o n t e n t sa n dt h ep ho fs o i ls o l u f i o mw e l et h ed o m i n a t i n g f a 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t o x r r s o l 艟i ns o i l s i tw a sf o u n dt h a tt h et r a n s f e ro fl o x a l s o n ei ns o i l s h o w e do b v i o u sw a t e rs o l u b i l i t y , t h e r e f o r el o x a l s o n em a ym o v ei n t o 班h w l l i e l o r u n d e r g r o u n dw a t e r i nt h ei n d u c t i o ne x p e r i m e n to fh s p 7 0i nz e b r a f i s he x p o s e dt or o x a r a o l l c ，t h e i m m u n o h i s t o e h e m i e a la n a l y s i s ( s a b cm e t h o d ) s h o w e dh s p 7 0p o s i t i v ee x p r e s si ng i l l ， g o n a da n df i v e ro f z e b r a f i s l a t h ep o s i t i v es i g n a l so f h s p 7 0 w e l oe x t e n s i v e l yl o c a l i z e do i l t h eg o n a da n dl i v e r , p a r t i c u l a r l yo nt h eb a s i l a rp a r t , b r a n e h i a l a r e h ，e p i t h e l i a lc e l l so f b r a n c h i a lp l a t ei ng i l l ，s l r o m ac e l lo f g o n a da n di nt h ec y t o p l a s mo f r e dc e l l 1 。u r t l a e r l y , l i t - p c ra n dr e a l - t i m er t - p c ra m p l i f i n gt h eh w 7 0 , h s c ? oa n dh s f lm r n aw e r ec u r r i e do u t b e c o m eh s c 7 0a n dh s f lw c r ca l s oc l o s e l yr e l a t e dt os l l c s s t h eq u a n t i t a t i v er e s u l t s d i s p l a i e dt h ep e a l ( o f 却7 0 , h s c ? oa n d 坳m r n ae x p r e s sa p p e a r e da t1 2 he x p o s e dt o r o x 8 1 s o i l ei ng i n ，g o n a da n dl i v e rt i s s u e s c o m p a r i n gt h em r n a e x p r e s so f s a m eg e n ei n n o r n l a lc o n t r o l , c h a n g ef o l d sw e r e5 2 8 9 ，3 4 8 3a n d5 9 3 1f o l do fh s p 7 0 ，h s c 7 0a n dh s f l r e s p e c t i v e l yi ng i l lt i s s u e , 2 6 4 3 ，1 3 7 0a n d1 7 5 3 i ng o n a d , 4 5 9 ，3 8 2a n d3 。3 2i nf i v e r b a s e d0 1 1t h er e l a t i v ea b u n d a n c eo f 却7 0 , h s c 7 0a n d 坳m r n a a tp e a kf t m e ，t h e e x p r e s sl e v e lo f t h r e eg e n e sw 舔t h eh i g h e s ti ng i l l ，m o d e r a t ei ng o n a da n dt h el o w e s ti n l i v e r f r o mt h et i m es e q u e n c e t h ei n d u c t i o ne x p r e s so ft h e s eg e n e si ng i l lw a ss t a r t - u p f i r s t l y , i nl i v e rs e c o n d l ya n di ng o n a dl a s t l y o na l la c c o u n t s ，t h eh s p 7 0a n dr e l e t i v e h e a t s h o c kp r o t e i n sa p p e a rat r e n d 嬲a b i o m a r k e r su s ef o rf i l l t i l e rs t u d ri ne n v i r o n m e n t o o u u t i o no f o r g a n o a r s e n i ec o m p o u n d s k e yw o r d s ：r o x a r s o n e ；e e o t o x i e i t y ；r e s i d u e so fv e t 盯i n a i yd r u g ；h e a ts h o c kp r o t e i n 7 0 ；f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i o np c r v n 扬州大学博士学位论文 r o x h s p h s p 7 0 h s c 7 0 h s f h s e a d i h p l c m s m m a d m a n l s 唧 d e p c l i = r - p c r f q p c r p b s 符号说明 h ，x a e 托l e h e a ts h o c kp r o t e i n i n d u c i b l eh e a ts h o c kp r o t m7 0 c o n s t i t u t i v eo rc o g n a t eh e a ts h o c kp r o t e i n7 0 h e a ts h o c kf a c t o r h e a ts h o c ke l e m e n t a c c e p i t a b l ed a i r yi n t a k e l i i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m o t o g r a p h y n l a s ss p e c t r u m m o n o m e t h y l a r s o n a t e d i m e t h y l a r s i n a t e n u c l e a rl o c a t i n gs e q u e n c e e x p r e s so f t r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n f l u o r e s e x n e * q u a n t i t a t i v ep c r p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e 洛克沙胂 热休克蛋白 诱导型热休克蛋白7 0 结构型热休克蛋白7 0 热休克因子 热休克元件 日允许摄入量 高效液相色谱 质谱 甲基胂酸 二甲基胂酸 核定位序列 翻译起始因子 焦碳酸二乙酯 逆转录聚合酶链式反应 荧光定量p c r 磷酸盐缓冲液 张雨梅：洛克沙肿残留的生态毒理研究 第一篇文献综述 第一章畜禽废弃物中有机胂残留及对环境的影响 有机胂制剂作为饲料添加剂，在世界范围内被广泛用于畜禽促生长，在畜禽养 殖中取得了相当的经济效益。目前我国及美国药品与食品管理局( f d a ) 等批准使用 的有机胂制剂主要有洛克沙胂( r o x a r s o n e ，r o x ，3 硝基- 4 羟基苯胂酸，也称洛 克沙生) 和阿散酸( p - a r s a n i l i ca c i d ，对氨基苯胂酸) ，以洛克沙胂使用较多。它 们都具有广谱杀菌作用，对肠道寄生虫也有抑制和杀灭作用，还能使毛细血管通透 性增强，主要作用于肠道，改善肠道的理化环境，具有类似抗生素的作用。对猪能 促进生长，提高饲料利用率，使其皮肤红润，毛发光亮，防止腹泻；对鸡可促进生 长、提高饲料报酬和产蛋率，增进卵黄色素沉着，防止球虫病、霉形体病不见古人 和大肠杆菌病的产生。因此，对动物有一定的促生长和改善产品外观作用。在畜牧 生产上广泛应用，农业部饲料药物添加剂使用规范把氨苯胂酸和洛克沙胂列入 其中，允许在动物饲料中添加。 含砷饲料添加剂的使用，促进了畜牧业的发展，取得了较好的社会经济效益。 但有机胂饲料添加剂在动物体内吸收较少，大多数随畜禽粪便直接排出，且目前我 国大多数的畜禽粪便未经过无害化处理。大量含砷的畜禽排泄物进入环境，对环境 造成了污染。在生态环境日趋恶化的今天，人们越来越关注含砷饲料添加剂随畜禽 排泄物进入环境后在环境中的降解、转化、迁移、归趋以及对环境生物造成的影 响。砷制剂的环境污染问题，已逐渐成为有关砷制剂研究的重点，并在国际上形成 了一个新的研究热点“圳。但我国在这方面的研究尚处于起步阶段。 1 畜禽养殖中有机胂制剂的应用及残留现状 近年来由于不少饲料生产企业过分强调有机胂添加剂的促生长作用和肉品色泽 改观作用，加之价格低廉，添加剂量越来越大，畜产品中胂的残留也越来越高，几 乎到了触目惊心的地步。 扬州大学博士学位论文 很多地方的饲料中总砷超过国家允许含量( 2 m g k g ) 。袁慧等皓采用国家标准 检测法( g b l 3 0 7 9 - 9 1 ) 检测了湖南省六个地区二十个猪、鸡配合饲料中总砷的含 量。结果显示，8 5 的样品中总砷含量超过国家标准，其中有1 3 个样品总砷含量在 2 - 1 0 m g 屉g 之间，占总数的4 5 ，有4 个样品高于1 8 m g k g ，占2 0 。超标情况是严 重的。美国f d a 对使用含有机胂饲料的动物规定了