（临床兽医学专业论文）链霉素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制.pdfVIP

中文摘要链霉素( s m ) 是一种氨基糖甙类抗生素，在医学上由于其存在严重的耳及肾毒性，已被其它新药所取代。但在畜禽疾病防治方葡，该药对奶牛乳房炎、子宫内膜炎、鸡传染性鼻炎等有很好的疗效，仍是常用药物之一但由于不规范用药常会引起畜禽产品中的超标残留，对人类的健康构成潜在危害。链枣素残留的检测方法比较多样化，但都存在一定的缺陷：理化分析法程序复杂、分析费用高，不适宜大量样品的检测；微生物法耗时长、灵敏度不高。酶联免疫法( e l i s a ) 和胶体金免疫层析法( g i c a ) 是两种快速、灵敏、特异和安全的检测技术，其规模化筛选特点更适应于常规化检测需要。为探索并建立一种能够快速有效地检测链霉素残留的方法，本研究采用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术，合成并制备了人工抗原、抗链霉素单克隆抗体和胶体金，采用竞争法建立了检测s m 残留的g i c a 方法，成功研制了链霉素胶体金免疫层析试纸条，试纸条灵敏度、特异性、稳定性等均达到检测要求。3采用c m o 法合成了链霉素人工抗原，用e l i s a 和紫外扫描法鉴定了偶联效果。通过体外扩大培养杂交瘤细胞，将细胞接种到小鼠体内，采用体内诱生法制各含抗链霉素单抗的腹水。腹水经辛酸一硫酸铵法纯化后用全抗原对单抗进行质量鉴定，蛋白浓度为4 2 m g m l ，包被抗原稀释度l ： 幻o ，单抗效价为l ：1 6 0 0 0 0 ，线性检测范围为1 0 1 0 0 0 n g m l ，直线方程为y = 1 0 5 2 2 - 0 3 2 7 6 x ，半数抑制浓度为9 3 2 2 n g m l ，定量限为2 2 6 4 n g m l ，检测限约为5 n g m l ，单抗对新霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、阿米卡星、恩诺沙星、氨苄青霉素、磺胺喹嗯啉的交叉反应率均 o 1 。采用柠檬酸三钠还原法制备不同粒径的胶体金，并选用直径1 8 n m 左右( 2 m l柠檬酸三钠) 的胶体金标记的单抗作为检测试剂，单抗) j n a 量1 0 8 g m 1 ，标记p h控制在8 5 左右( 5 0 p i m l k 2 c 0 3 ) 。采用进口a h l s t r o m 8 9 6 4 玻璃纤维膜作为金吸附材料，m i l l i p o m l 3 5 硝酸纤维素膜作为层析材料制成试纸条。抗原、二抗浓度分别为0 2 m g m 1 、5 0 倍稀释，玻纤上金标抗体的量为3 0 稀释量。本实验中研制的试纸条最大的优点是无需借助检测仪器，检测所需试剂已包被在试纸条上，检测快速、简便，5 m i n 内可出检测结果，适用于对链霉素残留进行现场检测本研究也为其他兽药残留检测试纸条的研制提供了借鉴。关键词：链霉素胶体金免疫层析单克隆抗体坚：菱塞塑墨a b s t r a c ts t r e p t o m y c i n ( s m ) i s 雏a m i n o g l y c o s i d e sa n t i b i o t i c s i ti se f f e c t i v et ot r e a tc o wm e s t i t i s ，i n f e c t i o u sc o r y z aa n de n d o m e t r i t i s ，a n di sf r e q u e n t l ya d d e di n t of e e d sf o rt h ep r e v e n t i o no rt r e a t m e n t so fa n i m a ld i s e a s e s h o w e v e r , i l l e g a la d m i n i s t r a t i o nw i l ll e a dt or e s i d u e si ne d i b l et i s s u e s ，a n df i n a l l yd ol a t e n th a r mt oh u m a nh e a l t h , r e s u l t i n gi nh e a r i n gt o x i c i t ya n dk i d n e yt o x i c i t y m a n yc o u n t r i e sa n di n t e m a t i o n a lo r g a n i z a t i o n s + h a v ee s t a b l i s h e dt h em a x i m u mr e s i d u el i m i to fs t r e p t o m y c i ni na n i m a lt i s s u e sf o rh u m a nc o n s u m p t i o n ，m a n yc h e m i c a la n dp h y s i c sm e t h o d sf o rd e t e c t i n gs t r e p t o m y c i nr e s i d u e di ne d i b l et i s s u e so fa n i m a l sh a v eb e e ne s t a b l i s h e d t h o u g hs o m eo ft h e s em e t h o d sa r es e n s i t i v ea n da c c u r a t e t h e y 眦n o ts u i t a b l ef o rs c r e e n i n gal a r g en u m b e ro fs a m p l e sb e c a u s et h e s em e t h o d sa r ct i m e - c o n s u m i n g ，c o s t l ya n dh i g h l y - s k i l l e d e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r h e n ta s s a y ( e l i s a ) a n dg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ( g i c a ) a st w or a p i d ，s p e c i a l ，s e n s i t i v ea n ds a f eb i o l o g i c a lm e t h o d s ，a r eg r a d u a l l ya p p l i e di nd r u gr e s i d u e sa s s a y t of i n da n de s t a b l i s h t h eb e s tw a yf o rd e t e c t i n gs mr e s i d u e s ，t h i sr e s e a r c hs y n t h e s i z e dt h ea n t i g e n , d e v e l o p e dt h ea n t i b o d i e sa n dc o l l o i d a lg o l dt oe s t a b l i s ht h e0 i c am e t h o df o rd e t e c t i n gs mb yt h et e c h n o l o g yo fm o n o c l o n a la n t i b o d ya n dg i c a ,a n df i n a l l yp r e p a r e dt h es t r i p s t r e p t o m y c i nw a 8c o n j u g a t e dw i t ho v a l b u m i n ( o v a ) s e p a r a t e d l yw i t hc a r b o x y m e t h o x y l a m i n e ( c m o ) m e t h o dt of o r ma r t i f i c a la n t i g e n 1 1 圮c o n j u g a n tw a si d e n t i f i e db ye l i s aa n du ys p e o t m mm e t h o d s t h eh y b r i d o m ac e l lw a se x p a n d e dc u l t u r e da n di n o c u l a t e di n t om i c ea b d o m i n a lc a v i t yt op r o d u c ea s c i t e s 1 1 l ea s e i t e so fft h em i c ew a sc o l l e c t e da n dp u r l e dt oo b t a i nt h em o n o c l o n a la n t i b o d y t h em c a bw a sd e t e r m i n e dw i t hc o a t i n ga n t i g e na n dt h er e s u l t ss h d w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no ft h em c a bw a s4 2 m g m 1 t h et i t e ro ft h em c a bw a sl ：1 6 0 0 0 0a n dt h e5 0 i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s9 3 2 2 n g m 1 1 1 1 ec r o s s - r e a c t i v er a t e so fm c a bt oo t h e rs e v e aa n t i b i o t i c sw e n e g l i g i b l e 英文摘要1 1 1c o l l o i d a lg o l d , w h o s ed i m n e t e ri sa b o u t18 n m ，i so b t a i n e db yr e d u c i n gt h eg o l dc h l o r i d ew i t hs o d i u mc i t r a t e ，a n dl a b e l ss mm c a b t h eo p t i m u mp hf o rl a b e l l i n gi sa b o u t8 5 ，a n dt h ea m o u n t o f m c a bi s1 0 8 1 x g m 1 t h eg l a s sf i b r eo f a h l s t r o m8 9 6 4a n dn i t r o c e l l u l o s e ( n c ) o fm i l l i p o r e13 5a r eu s e d 勰c h r o m a t o g r a p h i cm a t e r i a l s ，i nw h i c ht h ea n t i g e ni sc o a t e da t0 2 m g m l ，t h es h e e pa n t i l l l o i j 船l g gi sc o a t e da t5 0t i m e sd i l u t i o n , a n dt h ec o l l o i d a lg b l d - l a b e l l e da n t i b o d yi sc o a t e da t3 0 c o n c e n t r a t i o n t h em a j o ra d v a n t a g e so f t h es t r i pw e r et h a tr e s u l t sc o u l db eo b t a i n e dw i t h i n5m i na n dt h a ta l ln e e d e dr e a g e n t sw e r ei n c l u d e di nt h es t r i p t h es t r i pc o u l db e u s e dt od e = t e c tt h es t r e p t o m y c i nr e s i d u ei nf o o dd e r i v e df r o ma n i m a l s t h em e t h o do fp r o d u c i n gt h eo n es t e ps t r i pf o rs mc o u l db eu s e df o rr e f e r e n c ei nt h ed e v e l o p m e n to fs t r i p sf o rt h ed e t e c t i o no f o t h o rv e t e r i n a r yd r u g s k e y w o r d s ：s t r e p t o m y c i nc o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cm o n o e l o n a la n t i b o d y符号说明中文名称链霉紊胶体金免疫层析试验卵清蛋白乙基二甲氨基碳二亚胺0 - ( 羧甲基) 羟胺酶联免疫吸附测定问接竞争e l i s a间接e l i s a磷酸盐缓冲液磷酸盐一吐温缓冲液四甲基联苯胺辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白g高效液相色谱气相色谱质谱薄层色谱免疫分析技术纳克毫克微升摩尔每升微克每毫升小时4 5 0 h m 的光吸收值变异系数英文名称s t r e p t o m y c i nc o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o d a t o g r a p h i ca s s a yo v a l b u m i nl e t h y l 一3 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d ic a r b o x y m e t h o x y l u m i n ee n z y m e ii n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yi n d i r e c tc o m p e t i t i o ne l i s ad i r e c te l i s ap h o s p h a t eb u f f e rs o d i u mp h o s p h a t eb u f f e rs o d i u mt w e e nt e t r a m e t h y l b e n z i d i n eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r u m a t o g t a p h yg a sc h r o m a t o g r a p h ym a s ss p e c t r o g r a p ht h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h yi m u n o a s s a y s腿微克g克m l毫升g k g克每千克pg k g微克每千克m i n分钟s d标准差r r a i n转每分钟趴。肛渤糈疆似叭眦一一|耋l圣附僻娜眦峪盼吣略，儿枞m。朱继帅：链霉紊胶体金免疫层析法检测试纸条的研钥刖昌1 链霉素残留检测研究进展链霉素( s t r e p t o m y c i n ，s m ) 是由s w a k s m a n 于1 9 4 3 年首次从灰链霉菌的培养液中提取而得到的一种强效抗生素，属于氨基糖甙碱性化合物【1 1 。链霉素抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。在畜禽疾病防治方面，其对鸡、羊、牛、猪的各类炎症有很好的疗效，因此经常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂使用，近年来也常用于防治蜜蜂幼虫病。链霉素容易损害听觉神经，严重时会导致耳聋，对肾脏也有毒性，毒副作用较严重。因此，如何对动物性食品中残留的链霉素进行特异、灵敏、快速地检测己成为科研工作者的一个研究热点。澳大利亚、加拿大、德国、英国、美国、日本等国家和我国港台地区均开展了链霉素药物残留检测研究工作，并制定了相应的检测方法及残留限量1 2 1 。我国政府也高度重视这方面的工作，并相继立项对残留在动物性食品中的链霉素进行检测研究。1 1 链霉素及其作用机制1 。i i 理化特性链霉素分子式为c 1 2 h 3 9 n 7 0 1 2 分子量5 8 1 蠢5 9 ，易溶于水，难溶于醇，不溶于甲苯和氯仿。链霉素由1 个链霉胍、1 个链霉糖和1 个n 一甲基- - l - - 葡萄糖胺构成，含有多个氨基、胍基和羟基【3 训，结构见图1 。图1 链霉素结构图f i g lt h ec o n f i g u r a t i o no f s t r e p t o m y c i n链霉素含有多个手性碳，具有左旋的旋光性。链霉素属于碱性化合物，具有32扬州大学硕士学位论文个碱性中心，能与无机酸( 如硫酸或盐酸) 或有机酸成盐。其硫酸盐为白色或近白色结晶性粉末，具吸湿性。在水溶液中，链霉素的氨基通常带正电荷。链霉素的碱性氨基糖甙结构对酸、碱或加热条件相对稳定，但在强酸或强碱条件下也可发生水解。1 1 2 作用机理链霉素属于氨基糖甙类抗生素( a g s ) ，该类抗生素是一类在分子中含有一个环己醇基团，以糖甙键与氨基糖相结合的化合物，又称为氨基环醇类抗生紊。大多数氨基糖甙类抗生素都能引起原核细胞m r n a 密码的错读，可能是干扰了密码子与反密码子的相互作用。链霉素的作用机制主要是干扰氨酰基t r n a 与3 0 s 核糖体亚单位结合，而抑制肽链的延长。链霉素v i 服不易被吸收，肌肉注射是治疗全身感染的首选方法，吸收完全而且迅速，注射后1 2 h 血药浓度达峰值，为给药量的5 0 - 7 5 。静注后几分钟内即达血药浓度峰值，但链霉素的静注不推荐使用，有可能发生急性致死性中毒、血栓性静脉炎、休克，并且排泄迅速，能迅速分布到身体大部分组织和细胞外液中，完整的皮肤不吸收，也不易透过血脑屏障。链霉素在体内主要经肾代谢，随尿液排出，血浆半衰期为2 _ 3 h 1 3 - 4 l 。1 1 3 不良反应链霉素可引起急性中毒，但其主要不良反应是神经肌肉阻滞、耳毒性、肾毒性、过敏反应、骨髓抑制等。链霉素能选择性地损害第8 对脑神经，导致前庭神经和耳蜗神经损伤，可引起永久性耳聋；。肾脏中主要表现为近端肾曲管损害，出现蛋白尿、血尿、肾功能减退等。婴幼儿对链霉素很敏感，链霉素能透过胎盘损害胎儿听觉。此外，链霉素在体内可以以自由醛基与蛋白或红细胞结合，形成完全抗原，刺激脾脏和淋巴结中淋巴细胞增生、分化，产生特异的浆细胞，分泌特异性抗体，引起过敏反应，造成过敏性休克、溶血性贫血、血清病、接触性皮炎等1 3 埘。1 1 4 应用情况链霉素对结核杆菌、布氏菌属、嗜血杆菌、巴斯德菌属、金黄色葡萄球菌的部分菌株及若干革兰氏阴性菌均有较强的抗菌作用，尤其是治疗结核病有特效。在畜禽疾病防治方面，其对鸡、羊、牛、猪的各类炎症，如鸡传染性鼻炎，猪急性支气管炎、猪白痢、蜜蜂幼虫病、奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效，因此经常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。近年来随着动物疫病的不断增加和复杂化，链霉素的使用亦日趋泛滥，使其在动物性食品中过量残留，己成为危及人类身体健康的公共卫生问题，并严重影响到贸易出口，从而受到国内外的普遍关注。朱继帅：链霉素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制11 2 链霉素残留及其限量标准1 2 1 链霉素的残留限量标准由于链霉素残留的潜在毒性，通过食物传播影响人体健康，并造成经济损失，世界各国及国际组织均对链霉素残留规定了最高检测限量标准。欧盟在其标准( m r l si ne c ) 中规定，牛和绵羊：肌肉组织5 0 0 肛g k g 、脂肪5 0 0 “g k g 、肝s 0 0 儿g k g 、肾1 0 0 0 p g k g 、奶2 0 0 | _ t g k g 。猪：肌肉组织5 0 0 “w k g 、皮肤和脂肪5 0 0 w k g 、肝s 0 0 g k g 、肾1 0 0 0 1 g k g 。世界卫生组织的标准6 m r l si nf a o w h 0 ) 中规定，牛、猪、羊、鸡：肌肉组织6 0 0 w k g 、肝6 0 0 1 j g k g 、肾1 0 0 0 l z g k g 、脂肪6 0 0 p g k 9 1 5 1 0 我国的标准( m r l si nc h i n a ) 中规定嘲，牛绵羊猪鸡：肌肉6 0 0 w k g 、脂肪6 0 0 p g k g 、肝6 0 0 p g k g 、肾1 0 0 0 l t g k g 、牛奶z 0 0 | l g k g 1 2 2 链霉素在我国的非法使用随着动物疫病的不断增加和复杂化，链霉素的使用亦日趋泛滥，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。因为不合理用药，不遵循休药期规定等，造成其在动物性食品中过量残留，对消费者的健康构成潜在危害。王春奕1 7 】等于1 9 9 7 年用微生物法在鸡蛋中检测出链霉素的最高残留量达o 7 m g k g ，检出率为2 0 ；马北莉隅l 等在猪肾和猪脾脏中也检测到链霉素严重超标，分别残留达1 4 4 m g k g 和1 5 6 m g k g , 2 0 0 2 年吴国娟1 9 】等人对北京市售消毒纯牛奶中抗菌药物的残留状况做了检测，在随机采集的5 0 份牛奶样品中，链群素的阳性率为2 2 ，居所检出抗生素检出率的首位：2 0 0 5 年王华1 1 0 j 等人用t t c 法和e l i s a 检测了西安市售乳制品中抗菌素的残留，其中链霉素阳性率为2 1 8 8 ，居所检测的抗菌素检出率首位。郭娜i “j 等使用进口e l i s a 试剂盒对山西太谷县市售的纯牛奶样本进行了检测，5 0份随机采购的样品中链霉素的阳性率最高，达到2 2 。由此看来，链霉素的滥用是一个比较普遍而严重的问题。必须建立一套简便、可靠、灵敏的链霉素残留检测方法，以便对动物性食品中的链霉素进行检测与监控，这对我国加入w t o 后树立中国畜产品的形象，保护消费者的利益和链霉素的研究与应用具有深远的意义。1 3 链毒素残留的检测方法目前检测链霉素残留的方法主要是微生物法、理化分析法、免疫分析法三大类，其中微生物法虽然普遍适用于抗菌药物的残留测定，但不易筛选到特别敏感的菌株，方法常受到其它抗菌药物的影响，而且检测灵敏度低、耗时长；理化分析法中的化学分析法和比色法缺乏专一性和敏感性。薄层色谱( t l c ) 操作简单，结果可靠，但仍需要复杂的样品前处理，灵敏度不高。2 0 世纪印年代后的气相色谱( 0 c ) 和8 0 年代后的质谱( m s ) 、高效液相色谱( h p l c ) 以及g c m s 、l c m s 等联扬州大学硕士学位论文用技术的飞速发展大大地提高了分析的灵敏度和分辨率，拓宽了残留分析范围。理化分析法较微生物法有高度的灵敏度和特异性，但设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，分析费时而不易推广，同时还需要复杂烦琐的样品前处理且不能同时筛选大量的样品，不适合实际生产中样本的现场快速检测。相对于以上两种方法，以e l i s a 与g i c a 为代表的免疫分析法则成为残留快速检测的主流，由于其明显的优越性，已经愈来愈多的用于现场检测和阳性样本筛选。1 3 1 链霉素残留的微生物检测方法微生物法是目前公认而广泛使用的测定抗生素的方法，也是我国药典中引用的标准方法【1 2 i 。它是根据对抗生素敏感的实验菌，在适当条件下产生的抑菌圈的大小和药物浓度成比例设计而成的，有杯碟法、纸片法、琼脂扩散法、t t c 法等。原理和操作简单，但花费时间太长、灵敏度低。1 3 1 1 杯碟法( g y l i n d e rp l a t em e t h o d )杯磲法又叫生物法，陈光哲1 1 2 1 等曾将被测样品经抽提缓冲液浸泡、均质、离心、沉淀，样品中的链霉素被抽提后，吸取上清液注入牛津杯，与含枯草杆菌液的检定平板贴合，培养后，根据抑菌圈有无及大小判定结果，对照标准曲线，求得链霉素的残留量，检测最低限量为1 2 5 p g m l 。蔡金华1 1 3 等人利用此法检测了牛奶中链霉素的残留，样品经提取、离心，用枯草杆菌作为检定菌检测含量，结果显示，链霉素在0 0 1 p g m l - 3 2 0 p g m l 浓度范围内线形良好，添加回收率为9 7 6 ( n = 9 ) 。郭文欣【1 4 1 采用生物法定量检测了牛奶中链霉素残留，检测限达o ：l p g m 1 1 3 1 2 棉拭法( s w a b t e s t o n p r e m i s e s )这是检测胴体内可疑抗生素残留的现场试验方法。在美国、加拿大等国家，该方法的检测试剂己商品化，可从肾脏、肝脏、肌肉采样，通过棉拭周围有无抑制菌圈及大小判定抗生紊的残留。在加拿大，抑菌圈在6 m m 以上，判为阳性。棉拭法简便易行，在几分钟内即可完成操作，1 6 1 8 h 即可获得结果，是简便而又有一定准确性的检测动物组织内链霉素残留的方法。王琴1 15 j 等报道了采用棉拭法检测鸡蛋黄、蛋清中链霉素的残留情况。1 3 1 3 纸片法( p a p e r d i s e )纸片法是目前常用的一种方法，用圆滤纸从肾脏( 或乳) 取样，与含有枯草杆菌等细菌的营养琼脂贴合，培养，观察抑菌圈大小检查有无抗生素残留。神保胜彦对纸片法进行了改进研究，即利用枯草杆菌、藤黄菌和蜡样芽胞杆菌这三种试验菌的敏感性，检测肉品中抗生素残留，并称之为生物简易系统检查法( c l a s s i f i c a t i o nm e t h o d ) 。该法提高了准确率，链霉素的测定可达到l i - t g l 。杨文友朱继帅：链霉素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制!i t 6 等也采用了类似的方法进行屠宰猪抗生素残留的检测。王春奕r 7 1 等利用纸片法测定了鸡蛋中链霉素，最高残留量达0 7 m g k g ，检出率为2 0 1 3 1 4 氯化三苯四氮唑法( t r i p h e y et e t r a z o l i u mc h l o r i d e )”c 法是我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法( g b 5 4 0 9 - 8 5 ) 。如果在牛乳中有抗生素，当乳中加入菌种( 嗜热链球菌) 经培养后，细菌则不增殖，此时加入的t t c 指示剂不发生还原反应，所以仍呈无色状态；如果没有抗生素存在，则加入菌种即行增殖，r r c 还原变成红色，使样品染成红色。但该法为通用的抗生素残留检测方法，无法确定抗生素的种类。自建i l 等采用1 1 法检测了山西太谷县销售的纯牛奶中抗菌药物的残留，检出阳性率为8 。1 3 1 5 电泳生物检测法( b i o e l e c t r o p h o r e s i s )电泳生物检测法的检测原理是用1 0 u l 乳置于特制的琼脂电泳平盘上，电泳( 4 0 m a ) 4 小时，接种嗜热脂肪芽胞杆菌或藤黄微球菌，培养后通过细菌抑制面积可显示出抗生素残留的迁移区域，用标准曲线把抑制带的直径转换成抗生素浓度的对数。h s i a o t 埔】等建立了毛细管区带电泳法检测链霉素残留，最低检限为0 5 m g m l 刘波静l l9 l 用毛细管电泳法检测牛奶样品中4 种抗生素的残留。1 3 1 6 微生物电极法( m i c r o b ee l e c t r o d e )微生物电极法的基本原理是：微生物膜电极上的微生物在葡萄糖磷酸盐缓冲溶液中生长消耗溶解氧，导致电极电位发生变化，其变化值与微生物的生长情况，即抗生素的残留呈一定的关系。以电流的改变值为纵坐标，链霉素浓度为横坐标作图，即得标准曲线，根据电流变化可通过标准曲线得到链霉素的浓度。马懿【硎报道了将微生物电极法应用于检测乳类食品中链霉素的可行性，其精密度和准确度都符合要求。陈岩 2 1 1 根据s i m p s o n 等人报道的用生物电极测定制剂和血浆中链霉素的方法，也进行了相关研究。1 3 ，7 标准一渗透法( ( 1 ”0 1 法)1 a 0 1 法依据嗜热乳酸链球菌在生理活动中产生晚氨酶，并释放出氮，当奶品中有抗生素存在时，则抑制细菌生长而不产生晚氨酶，p h 指示剂( 培养基) 保持紫色呈阳性；当无抗生素时，细菌生长而产酸，使p h 指示剂变成黄色里阴性结果该法属于试剂盒产品，具有菌种、培养基标准化，实验器材简单，实验时间短( 3 h ) ，敏感性高( o 0 0 2 1 u i m l ) ，适应抗生素类广泛等特点。但没有针对性，不能鉴定出特定的抗生烈翻。1 3 2 链霉素残留的理化检测方法理化检测方法主要是利用链霉素分子中的基团所具有的特殊性质或反应来测6扬州大学硕士学位论文定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法等。该类方法中大多既能进行定性分析，也能进行定量检测，而且敏感性较高，应用较为普遍，已成为确证性方法，但有的检测程序较复杂或检测费用较高。1 3 2 1 高效液相色谱法( h p l c )高效液相色谱( i - i p l c ) 是一种灵敏、快速、分辨率高、重复性好的分离方法，其应用相当广泛，实际检测中也与其他方法联合使用。链霉素由于水溶性好、极性大和分子量高，可以用h p l c ( 荧光法) 进行定量分析。但因其需要昂贵的特殊仪器，故很难在基层推广应用。国外的t a m a ig t 2 3 1 、k u r o s a w a 2 4 】、a g a r w a l l 2 5 1 、b o b b i t t t 拍l 、s t a t l e r i 2 7 1 、b a r e n d s l 2 s 1 、m a y s l 2 9 1 、e d d e o l 、s u h r e ng 1 3 、a b b a s ih i 3 2 等均曾用h p l c 以不同的分离相和流动相来检测动物性食品中链霉素和双氢链霉素残留。国内的周玉【3 3 1 、郑昌亮、邓海星【3 4 i 、赵李副3 引、陈晓红1 3 6 1 等人均有较好的研究成果1 3 2 2 荧光法( f l u o r e s c e n c e )在一定的酸、碱条件下，抗生素一般可产生带有不同颜色荧光的产物，测定其荧光强度，通过标准曲线可求出样品中抗生索含量。但链霉素分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需将它转变为具有紫外发光团或荧光的衍生物才能进行分析p 阳8 1 。如链霉素与1 ，2 - 萘醌- 4 - 磺酸钠( n q s ) 在碱性介质中所生成的产物具有蓝色荧光1 3 9 - 4 0 1 ，或用邻苯二甲醛( o p a ) 进行柱后衍生化( p c ) 。也能产生荧光物质，可以用荧光检测器( f l d ) 检测1 4 1 1 1 3 2 3 色法( c h r o m a t o m e t r y )链霉素与二硝基苯肼在酸性溶液中可反应生成黄色的链霉素二硝基苯胺，多余的试剂经乙酸乙酯提取除去后，于4 3 0 r i m 波长处测其吸光度，以标准曲线求出样品中链霉素的含量。除此之外，还有链霉素氧化亚硝基铁氰化钠比色法、过碘酸比色法、a - 萘酚比色法、氨脲比色法等。1 3 2 4 薄层色谱法( t l c )l a n g e r 和t e u f e i 使用薄层色谱( t l c ) 测定了动物组织中的氨基糖甙类抗生素残留。此方法的灵敏度比微生物方法还低。将薄层色谱( t l c ) 的分离和生物方法的检测技术结合，可建立薄层色谱生物自显影( b a g ) 法。这种技术是先将抗生素在t l c 薄层板上分离，然后通过用接种细菌的培养基覆盖薄层板，或者把t l c 薄层板朝下放在培养基上进行检测。抗生素扩散到培养基中，经孵化后，细菌生长抑制带就显示出来了。y o s h i m u r a 和y o n e z a w a 曾经使用这种技术测定了猪与小牛的组织和尿中的双氢链霉素、卡那霉素和新霉素。但这种方法的检测限较低，仅为3 0 2 0 0 m g k g ，只能用于测定肾组织中的链霉素戴者双氢链霉素的残留1 2 j 。朱继帅。链霉素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制11 3 2 5 质谱法( m s )理论上讲，所有的化合物都可用质谱法( m s ) 检测，但由于仪器的复杂性和昂贵的价格，m s 的应用受到了限制，一般仅作为确证方法使用。到目前为止，使用m s 测定链霉素的报道很少。p r c u 等研究了双氢链霉素的硅烷化条件和g c m s ( 气质联用) 测定方法，抗生素在d b i 毛细管色谱柱上分离，采用选择离子检测方式( m z1 4 5 、3 9 2 、6 2 5 ) 进行定量，检测限为6 0 0 p g t 2 i 。1 3 3 链霉素残留的免疫学检测方法免疫分析技术( i m m u n o a s s a y s ，i a s ) 是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间的立体化学、电荷、氢键和偶极间的综合作用，因而具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度，非常适用于复杂基质中痕量组分的分析，2 0 世纪8 0 年代以来已成为兽药残留分离与检测的主要技术和发展方向。目前应用的兽药残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即r i a 、e l i s a 、免疫金分析方法、免疫传感器等；二是将免疫分析技术与理化技术联用，如免疫亲和色谱( i a c ) 。鉴子人们对兽药残留问题的日益关注和免疫分析技术的优越性，许多国家和地区都在资助或进行这方面的研究，如美国国家环保署( e p a ) 、食品与药品管理局( f d a ) 、农业部食品安全调查处( f s i s ) 、l a w r e n c el i v e r m o r e 国家实验室等。2 0 世纪9 0 年代以来北京农业大学等在国内开展了兽药残留免疫分析研究，并建立了若干测定方法。兽药残留免疫分析方法的建立包括：待测物的选择、半抗原的合成、全抗原的合成、抗体的制备、测定方法的建立、样本前处理方法和方法评价。虽然建立免疫测定方法所需要的时间较长( 6 - 1 2 个月) ，但其简便、快速，灵敏、准确的特点，一旦建立，便会具有广阔的应用前景1 4 2 1 。免疫分析技术作为氨基糖甙类药物的筛选检测方法已有较多研究，尤其是用于牛奶和蜂蜜样品残留分析方面。以单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附试验( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) 是近年建立起来的一种检测链霉素残留的较好方法，此方法不需要对样品进行提纯，不仅具有快速、灵敏、特异、经济等优点，而且可对大批量样品同时进行检测，适合于在我国基层普及应用。1 9 9 2 年，h a m m e r t 4 3 i 等将链霉素联到一种细菌蛋白上作为免疫抗原，免疫家兔获得抗血清，浓缩后可以有效地识别链霉素和双氨链霉素，以此抗体建立了间接竞争e l i s a ，可用于检测经草酸处理后的牛奶样品，定量限达l o o n g m l 。s c h n a p p i n g e r t 4 4 4 s 】等将链霉素分别以c m o 、e d c 法与b s a 和h r p 相连，合成免疫抗原和竞争抗原，建立e l i s a ，牛奶样品经离心脱脂和p b s 稀释后直接测定，两种药物的检测限分别为0 6 n g m l 和0 4 n g m l ；此外，他们还建立了一种检测奶中链霉素和双氢链霉素的酶联免疫滤过法，检测限分别是2 n g m l 和5 n g m l ，样品无需任何处理，整个过程仅需1 0 r a i n 。1 9 9 6 年，h a a s n o o t 4 6 1 等报道了检测牛奶和3扬州大学硕士学位论文肾组织中链霉素、双氢链霉素残留的直接竞争e l i s a 法，并利用抗s m 单抗建立了生物传感免疫测定方法，对牛奶中残留检测限为2 0 n g m l 。1 9 9 8 年，h e e l i n g 等采取c 1 3 固相萃取s p e 一直接竞争e l i s a ，和免疫亲和色谱( t a c ) 一直接竞争e l i s a 法检测蜂蜜中链霉素，样品经缓冲液提取和稀释后进行净化和测定，检测限分别为3 2 m g l 和1 1 5 m g l 。f e r g 啪n 【4 7 l 等也建立了生物传感免疫法测定了多种样品中的s m 残留。v e r h e i j e n t 船l 利用胶体金标记单抗，采用竞争法检测了链霉素，检测限为1 6 0 n g m l 。国内相关的研究较少，胡昌勤1 4 9 - 5 0 1 、秦燕( s l l 等人曾做了一些研究，近期王谦1 5 2 1 、杨智洪t 5 3 l 、唐娜【5 4 】合成了免疫抗原和包被抗原，制备出抗链霉素单抗，建立并初步应用了间接竞争e l i s a 方法。在科技部农社司的大力资助下，中国农大与北京望尔公司等单位联合承担的“十五”国家科技攻关“兽药安全评价与残留检测技术研究”课题，已研制出链霉素检测试剂盒。目前市售的链霉素检测试纸条均为进口美国、荷兰等国家的产品，如：南京农水生物技术有限公司、北京陆桥技术有限责任公司等销售的试纸条。国产链霉素检测试纸条的研发和销售则未有报道。2 胶体金免疫技术及其应用2 1 胶体金及其性状。胶体金( c o l l o i d a lg o l d ) 也称金溶胶，是氯金酸( h a u c l 4 ) 被还原成金后，由于静电作用而形成的稳定胶体状态。1 8 5 7 年法拉第用还原法从氯金酸溶液制备胶体金，奠定了胶体金制备和应用的科学基础f 5 5 i 。1 9 7 1 年f a u l k 和t a y l o r 首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究1 5 6 1 。此后免疫金技术作为一种新兴的免疫学方法，在生物医学各领域得到了广泛的应用t y r l 。胶体金颗粒由一个基础金核( 原子金a u ) 及包围在外的双离子层构成。紧联在表面的是内层负离子( a u c l 2 - ) ，外层离子层旷则分散在胶体问溶液中，以维持胶体金游离于胶体间的悬液状态。胶体金属胶体分散体系，其溶胶分散相粒子直径在1 - 1 0 0 r i m 之间，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态浮悬在液体中，形成金溶胶。溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、散度和入射光线，胶体金颜色因其粒子大小不同而不同，呈现出橙红色、红色、酒红色、紫红色、紫色等。金颗粒间存在吸引力和排斥力的矛盾，当改变温度、浓度、电解质时，粒子容易聚结而发生聚沉。2 2 胶体金的制备胶体金是通过在氯金酸溶液中加入还原剂使之还原并聚集形成胶体金粒子而制成的。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小，还原剂浓度越高，粒子直径越小目前常用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、白磷、抗朱继帅：链霉素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制!坏血酸、硼氢化钠等。常规制备胶体金一般使用电炉加热，这使得溶液沸腾过于激烈，反应不好控制，溶液损失较大，且不太安全。王文勇等采用了微波加热技术制备胶体金，此方法快速、稳定，颗粒均匀一致，大大缩短了制备胶体金的时间，操作过程更简便。制备的胶体金需经过质量鉴定，肉眼观察是最基本最简单方便的鉴定方法，主要观察胶体金溶液的颜色、均匀度和透明度，但需要一定经验；也可用分光光度法，在4 0 0 6 0 0 r i m 进行扫描，确定最大吸收峰波长，并观察最大吸收峰的峰形和峰宽；要鉴定胶体金最好用透射电镜( t e m ) 观察，检测胶体金的超细微结构，燕选一些代表性的作显微摄影，以检查颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。但采用透射电镜观察这种方法不便于日常工作使用。2 3 金标抗体的制备、纯化及保存在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间形成非共价键的静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白活性无明显影响。在标记过程中，体系的离子强度、p h 、抗体的量是决定标记是否成功的关键。标记前一般使用k 2 c 0 3 或h c i 调节胶体金溶液的p h 至略大于抗体蛋白等电点0 5 个p h 单位。稳定胶体金最低抗体量可采用m c y 试验或可见光分光光度法确定。一旦蛋白结合上胶体金，必须使用b s a 、凝胶、聚乙二醇或酪蛋白稳定金标溶液。这些稳定剂不仅能封闭胶体金表面未与蛋白结合的位点而减少了非特异性反应，还能提供_ 种更稳定的悬浮液。标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于试验，纯化方法有超速离心法和凝胶过滤法。纯化的目的是除去未标记的蛋白、未标记的胶体会以及聚合物。纯化后的金标要调整到所需的浓度，悬浮于适当的缓冲液中，这种缓冲液应能使液体金标稳定。最终储存用的缓冲液应避免使用高盐缓冲液和表面活性剂，因为它们可能水解或取代抗体。金标最常用的防腐剂是叠氮钠。制备的金探针是否保持很好的生物学活性是判断其质量好坏的主要指标，在使用前必须对它的特异性、敏感性进行鉴定。可以于t e m 下观察，金颗粒周围如有明显的空晕，表示金探针制备成功；也可以用分光光度计测定5 2 0 r i m 波长处胶体金蛋白液的0 d 值( 一般为o 2 5 左右，p b s1 ：2 0 稀释) ；采用微孔滤膜免疫金银染色法( m f g s s a ) 测定金标记蛋白的特异性与敏感性。2 4 胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术是2 0 世纪9 0 年代初期在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，这种检测技术所需样本微量，检测精度高；胶体金具有鲜艳的橘红色，可用肉眼直接观察结果，应用于临床检测具有方便快速的优点，且不需要光镜、电镜、酶标仪等仪器设备，适合现场应用；操作简单，塑扬州大学硕士学位论文只需加入样品一个步骤，而且反应迅速，整个检测时问仅需几分钟，胶体金不属于生物活性物质，不易受外界干扰，检测结果稳定，结果判定简单，技术要求低，不需要专业临检人员操作，而且携带方便，基层可以开展：实验结果和胶体金试纸可常温下长期保存，适于大批样品的检测，适合实际检测需要。以膜为固相载体的胶体金快速诊断技术的基本原理是：以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛