（临床兽医学专业论文）影响嵌合孤雌胚胎发育因素和嵌合囊胚离散细胞不同性别来源比率研究.pdf

摘要 影响嵌合孤雌胚胎发育因素 和嵌合囊胚离散细胞不同性别来源比率研究 临床兽医学专业硕士研究生李永强 指导教师李跃民教授 摘要 随着干细胞技术的不断发展，能够用于人类再生医学的具有克服免疫排斥反应的治疗性 胚胎干细胞逐渐成为人们研究的热点。通过体细胞核移植技术获得的胚胎干细胞，因为具有 与体细胞提供者相同的基因型被认为是克服免疫排斥反应的最佳途径，然而，取于患病动物 的体细胞是一种隐含有突变基因的分化细胞，不但克隆囊胚生成率很低，而且因含有突变基 因，通过体细胞克隆途径所获得的胚胎干细胞的质量也会存在问题。与此相比，孤雌胚胎干 细胞则因为是来源于具端粒酶活性且尚未经历个体分化途经的生殖细胞，理伦上这种来源于 生殖细胞的干细胞不存在当代受治疗动物的突变基因，因此，这种孤雌胚胎干细胞( p e s ) 系 的医学应用前景更广阔，意义重大。同样，来源于哺乳动物m i i 期卵母细胞孤雌激活胚胎与 克隆胚胎相比，具有与提供卵母细胞母体相同的组织相容性复合物，由此获得的干细胞也能 够像体细胞克隆胚胎干细胞一样克服免疫排斥反应。但是，来源于m i i 期卵母细胞孤雌激活 胚胎则因为缺乏父源基因印迹作用，其发育潜能受到限制，从而导致其分离获得干细胞的分 化潜能也有可能因此而受到限制：由于雄性基因组在胚胎发育中是必须的，那么，利用m i i 期卵母细胞获得的孤雌胚胎与经性别鉴定的雄性胚胎进行嵌合发育，可以在一定程度辅助孤 雌胚胎发育，并且可以用性别鉴定的方法鉴定得到的囊胚内细胞团是否来源于孤雌胚胎。 本实验选择昆白小鼠为研究对象，针对孤雌胚胎干细胞获取新途径中，有性生殖胚胎与 无性生殖孤雌胚胎嵌合发育有可能在早期胚胎细胞间通过旁分泌与自分泌因素促进孤雌胚发 育的道理，本研究通过性别鉴定的方法选择雄性有性生殖胚胎与无性生殖m i i 期卵母细胞孤 雌激活胚胎嵌合发育，并通过性别鉴定的方法将这种由嵌合发育囊胚分离得到的细胞集落进 行来源标记，旨在通过应用成熟的分子生物学性别鉴定方法，建立一种新的有性生殖雄性胚 胎辅助提高与其嵌合的无性生殖孤雌胚胎发育生成囊胚的比率，并进一步通过这种性别鉴定 方法，为分离鉴定由此囊胚获取孤雌胚胎干细胞的性别标识新模式奠定基础。试验结果如下： 1 小鼠孤雌胚胎与雄性胚胎嵌合发育影响因素研究 本研究取小鼠m i i 期卵母细胞进行孤雌激活，体外培养至8 细胞期，与经性别鉴定后获 得的8 细胞期雄性胚胎嵌合培养，其目的是为了建立一种新的异性胚胎嵌合培养模式，在便 于通过分子生物学方法对胚胎不同来源进行性别鉴定的基础上，研究两种不同类型胚胎细胞 之间在嵌合发育过程中的相互影响，为从嵌合发育胚胎中分析标记来源于孤雌胚胎的干细胞 研究过程奠定基础。本研究在初步建立孤雌激活胚胎与雄性胚胎嵌合发育程序的基础上，对 于影响这种嵌合胚胎发育效果的几个主要因素做了进一步的研究。 两南大学硕十学位论文 1 1 获取小鼠二倍体孤雌胚胎的孤雌激活方法研究 已知哺乳动物孤雌胚胎有几种染色体核型，孤雌胚胎不同倍性染色体核型的形成与卵母 细胞孤雌激活的方式有关，其中杂合二倍体是一种在染色体质量上类似于有性生殖胚胎体细 胞核型的无性生殖孤雌胚胎，为了获取这种胚胎，本研究通过两种化学方法激活昆白小鼠成 熟卵母细胞，并抑制其第二极体排出，在显微操作仪下观察激活卵是否形成两原核，若形成 则确定为杂合二倍体，本实验旨在选择生成杂合二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法用 于制作与雄性胚胎嵌合发育的8 细胞期孤雌胚胎。结果显示：采用含1 0 m m o f l 的s r c l 2 和 5 u g m l c b 处理4 小时，激活率最高为7 6 7 ，激活小鼠卵母细胞后形成杂合二倍体孤雌胚比 例最高为3 9 5 ，与乙醇联合6 - d m a p 激活后形成杂合二倍体孤雌胚比例3 1 6 略高，但差异 不显著( p o 0 5 ) 。 1 2 小鼠孤雌胚胎早期发育的培养体系研究 小鼠卵母细胞孤雌激活之后，选取杂合二倍体胚胎，通过在不同培养液中的培养，对培养 得到的2 、4 细胞和囊胚进行统计，旨在建立一套完善的适合杂合二倍体孤雌胚胎体外培养的 体系，试验结果如下： ( 1 ) c z b 和r a m l 6 能较好地过2 - c e u 阻滞发育至囊胚，各组中2 - c e l l 胚胎发育率相近，差异 不显著，但c z b + f b s 和c z b + b s a 组的4 - c e l l 胚胎发育率均较相应的m m l 6 组高，胚胎发育速 度较快；无论c z b 或r a m l 6 培养液，添加f b s 组的囊胚发育率均高于相应添加b s a 的组，而且 c z b 添加f b s 组的囊胚发育率高于其他各组，差异显著( p o 0 5 ) 。 ( 2 ) 用c z b 添加f b s 组培养过2 - c e l l 阻滞，于培养到4 - c e l l 期后添加葡萄糖组的囊胚发 育率稍好于未添加组，两组的囊胚发育率都明显高于全程添加组，且差异显著( p o 0 5 ) ，与有性生殖胚胎体外培养的囊胚率9 0 6 相比，差异显著( p 0 0 5 ) 1 2r e s e r c ho f ft h ec u l t i v a t es y s t e mo ft h em o u s ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oi nt h en o n a g e a f t e rp a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o no ft h em o u s eo o c y t e s ，c h o o s i n gt h eh e t e r o z y g o s i sd i p l o i d e m b r y o s ，c u l t u r e di nd i f f e r e n tc u l t u r es o l u t i o na f t e rt h ep a r t h e n - a c t i v a t i o n ，a n dc a r r yo u ts t a t i s t i c a l a n a l y s i si no r d e rt oe s t a b l i s hac o n s u m m a t ei nv i t r oc u l t u r es y s t e mo fp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o t h e r e s u l t sa sf o l l o w ： ( x ) c z ba n dm m l 6c a ns u s t a i n2 - c e l le m b r y o st od e v e l o p et ob l a s t u l a a f t e r2 4hc u l t i v a t i o n ，t h e 2 - c e l le m b r y o sd e v e l o p m e n tr a t eo fd i f f e r e n tg r o u p si sc l o s et oe a c ho t h e r b u t4 - 8 - c e l le m b r y o s d e v e l o p m e n tr a t eo fc z b + f b sg r o u pa n dc z b + b s ag r o u pa r eh i g h e rt h a nm m l 6g r o u p ，t h e s e e m b r y o sh a v eaf a s t e rr a t eo fd e v e l o p m e n t a f t e r4 8hc u l t i v a t i o n ，n om a t t e rc z b o rm m l 6c u l t u r e s o l u t i o nw h i c hh a sf b sc a ng e tt h eh i g h e rd e v e l o p m e n tr a t eo fm o r u l at h a nw i t h i nb s a ，a n dc z b g r o u pw i t hf b si ss i g n i f i c a n td e v i a t i o nw i t ho t h e rg r o u p s ( 2 ) u s i n gc z bw i t hf b sc u l t i v a t e2c e l l ，a f t e r4 8ha d d i n gg l u c o s eg r o u ph a sab e t t e re f f e c tt h a n n oa d d i n gg r o u p ，t h em o m l ad e v e l o p m e n tr a t eo ft h e s et w og r o u p si sh i g h e rt h a nw h o l er a n g ea d d i n g g r o u p 乃cr e s u l ti n d i c a t et h a t , w h e nc u l t i v a t i n gp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oi nv i t r o , w es h o u l du s e c z b + 1 5 f b sa sc u l t u r es o l u t i o nb e f o r e4c e l ls t a g e t h e ne x c h a n g ec z b + 1 5 f b s + g l ut 0 c u l t i v a t e 1 3r e s e a r c ho nt h eb e s tt i m et oo b t a i nt h es e x u a lr e p r o d u c t i o n8 - c e l ls t a g ee m b r y o sw h i c ha t eu s e d t os e xi d e n t i f i c a t i o n i no r d e rt or e c e i v em o r e8 - c e l ls t a g ee m b r y o s ，o nt h eb a s eo ft h el a wo fm o u s ed e v e l o p m e n t ， t h i se x p e r i m e n ts p i r tt h ee m b r y ot h r o u g hu t e r i n et u b e ，c o i t i o na f t e ri n j e c t i n gt h eh c gf o r6 0 ，6 4a n d 6 8 h ，s t a t i s t i c st h ed e v e l o p m e n t a ls t a g eo ft h em o u s ee m b r y o sw ef o u n dt h a tm o r e8 - c e l ls t a g e e m b r y o sc a nb eg a i n e d6 4 ha f t e ri n j e c th c g ，o c c u p y i n g7 6 9 o ft h ew h o l en u m b e ro fe m b r y o s ， s i g n i f i c a n td i f f e r e n tw i t h6 0 ha f t e ri n i e c t i n gh c g ( 3 3 8 ，p o 0 5 ) s o m eo ft h ee m b r y o sh a v ed e v e l o p e dt om o r u l a6 8 h a f t e ri n j e c t i n gh c g ，s ow ec a l lr e c e i v em o r e8 - c e l ls t a g ee m b r y o s6 4 6 8 ha f t e rh c g 1 4r e s e a r c ho nt h eg o m p h o s i sd e v e l o p m e n to ft h eb l a s t u l a rw h i c hc o n t a i np a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o a n dm a l ee m b r y o u s i n gd o u b l ep c rs e xi d e n t i f i c a t i o nt oi d e n t i f yt h es e x u a lr e p r o d u c t i o n8 - c e l ls t a g ee m b r y o ， s e l e c tt h em a l ee m b r y o st og o m p h o s i sw i t ht h et h e 8 - c e l ls t a g ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ，b e s i d e s ， t a k i n gt h ed e v e l o p m e n to fs e x u a lr e p r o d u c t i o n8 - c e l ls t a g ee m b r y oa n dp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o 勰 c o n t r o lg r o u pt oo b s e r v et h ed e v e l o p m e n to ft h ec h i m e r i ce m b r y o ，t h ep u r p o s ei st or e s e a r c ht h e d e v e l o p m e n to ft h eb l a s t u l a rw h i c hc o n t a i np a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oa n dm a l ee m b r y o ，t h er e s u l t s s h o w st h a tt h ec h i m e r i ce m b r y oc a nd e v e l o p e dt ob l a s t u l ai nv i t r oa n dt h er a t eo ft h eb l a s t u l a d e v e l o p m e n ti s3 9 4 ，al i t t l em o r et h a n3 5 1 o fp a r t h e n o g e n e s i s8 - c e l ls t a g e ，b u tt h e r ei sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n t ( p 0 0 5 ) ，b u th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n t 谢t ht h er a t eo fb l a s t u l ad e v e l o p m e n to f t h es e x u a lr e p r o d u c t i o ni nv i t r o ( 9 0 6 ，p o 0 5 ) 2t h ec l o n o g e n i c i t yo ft h ev i c a r i a n c ec e l lw h i c hd e r i v e df r o mt h ei n n e rc e l lm a s so ft h e p a r t h e n o g e n e t i cb l a s t u l aa n dt h er a t eo ft h ed i f f e r e n ts e xs o u r s c t h i sr e s e a r c hb a s e do nt h es t u d ym o d eo ft h ek mm o u s em a l ee m b r y og o m p h o s i sw i t h p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oe s t a b l i s h e db yd o u b l ep c rs e xi d e n t i f i c a t i o n ，f u r t h e r ，w es t u d ys e v e r a l c r i t i c a lq u e s t i o n s ，w h i c ha f f e c tt h ec h i m e r ac o n t a i n st w ok i n d so fe m b r y oc e l l s ，a sag r o u n d w o r k ，w e u s ed o u b l ep c rs e xi d e n t i f i c a t i o na g a i nt om a r kt h ec l o n o g e n i c i t yo ft h ev i c a r i a n c ec e l lw h i c h d e r i v e df r o mt h ei n n e rc e l lm a s so ft h ep a n h e n o g e n e t i cb l a s t u l aa n dt h er a t eo ft h ed i f f e r e n ts e x s o u r s e ，e s t a b l i s h i n gt h ef o u n d a t i o no ft h er e m e d i a lp a n h e n o g e n e t i ce m b r y os t e mc e l l f o rf u r t h e r r e s e a r c h 2 1i s o l a t i o n ，c u l t u r ea n dp r e p a r a t i o no ff e e d e rl a y e ro fm o u s e e m b r y o n i cf i b r o b l a s t s i nt h i se x p e r i m e n t ，w ec o l l e c t1 3 5 dm o u s ef e t u st os e p a r a t em o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s a f t e r o n ed a yw e 啪s e eb u l kp r i m a r yg e n e r a t i o nm o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t sa r ea d h e r e n c ea n dm o s to f t h e ma r ef u s i f o r m ，as m a l lq u a n t i t yf i b r o b l a s t sa r er a d i a lm o r p h o l o g y ，a n da l s oaf e wr o u n do ra n o m a o t h e rc e l l si nt h e m a f t e r3dt h e s ec e l l sc a no v e r g r o wb o t t o mo fc u l t u r ef l a s ka n ds h o wl o n g f u s i f o r m s e l l e c t i n gg o o dt h i r dg e n e r a t i o nm e f t op r e p a r ef e e d e rl a y e ro nq u a d f i p u n t a lp l a t ew h i c hi s c u s t o d i t e db yg e l a t i na f t e rc o n d u c t e db ym i t o m y c i n 2 2t h er e s e a r c ho nt h ev i c a r i a n c ec u l t i v a t i o no ft h eb l a s t u l ai n n e rc e l lm a s sd e r i v e df r o mt h e c h i m e r ab ym a l ee m b r y oa n dp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o t h i se x p e r i m e n tt a k et h es i n g l ec e l li s o l a t i o nf r o mt h ei n n e rc e l lm a s so fs i xp a r t h e n o g e n e t i c b l a s t u l a ，i t tm a yc o l l e c t11 8 3m o n o p l a s to na v e r a g e ，c u l t i v a t i n ga n dg e n e r a t i n gf o rt h em o n o p l a s t i nv i t r o ，w ef o u n dt h a tt h em o n o p l a s to ff i v ep a r t h e n o g e n e t i cb l a s t u l ai c mc a nb ec u l t i v a t e di nv i t r o e a c hp a r t h e n o g e n e t i cb l a s t u l am a yo b t a i n1 6 7c e l lc o l o n yo na v e r a g e 2 3s t u d yo nt h er a t eo fd i f f e r e n ts e xs o u r c ed e r i v e df r o mt h ec h i m e r ab l a s t u l ai c mv i c a r i a n c ec e l l s e xi d e n t i f i c a t i o nt om i c r o c o l o n yo ft h et h ee s c so b t a i nf r o mt h ec h i m e r au s i n gt h ed u p l e x i n g p c r ，t h er a t i oo ft h ep a r t h e n o g e n e t i cc e l l sa n dm a l ec e l l si sa v e r a g e5 ；1 2i nt h em i c m c o l o n y t h e v l a b s i 。r a c l l r e s u l ti n d i c a t et h a tt h ed o u b l cp c rc a nd e t e c tt h es o u r c eo ft h ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oc e l l sf r o m c h i m e r ab l a s t u l ai c m c o n c l u s i o n ：a d o p t i n gm a n i p u l a t i o nm e d i u mw h i c hc o n t a i nl o m m o l ls r c l 2a n d5 u g m l c bt o d e a lw i t ht h eo o c y t e sf o r4h o u 璐g a i n st h eh i g h e s th e t e r o z y g o s i sd i p l o i dp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ， c u l t i v a t i n gi nt h ec z b + 1 5 f b sm e d i u mg r o w t ht ot h e4 - c e l ls t a g ea n dt h e nc h a n g et h em e d i u m w i t hc z b + 1 5 f b s + 1 1 m g m l g l u ，r e m o v et h ez o n ap e l l u c i d aa f t e rd e v e l o p e dt ot h e8 - c e l l m o r e 8 - c e l ls t a g ee m b r y o sc a l lb eg a i n e d6 4 6 8 ha f t e ri n j e c th c g b ys p i r t i n gt h ee m b r y ot h r o u g hu t e r i n e t u b e ，r e m o v i n gt h ez o n ap e l l u c i d aa n dt h e ns e x i n gb yd u a lp r i m e rd o u b l ep c r s e l e c t i n gt h e8 - c e l l s t a g em a l ee m b r y op o l y m e r i z ew i t hz o n ap e l l u c i d af r e ep a r t h e n o g e n e t i c8 - c e l le m b r y ob yw o w ，t h e c h i m e r ac a nd e v e l o pt oc h i m e r ai nv i t r o s t r a g g l i n gt h eb l a s t u l ai c mt om o n o p l a s t ，a n dt h e n c u l t i v a t eo nt h em e fc a no b t a i nt h ec e l lc o l o n y s e xi d e n t i f i c a t i o nt om i c r o c o l o n yo ft h et h ee s c s o b t a i nf r o mt h ec h i m e r au s i n gt h ed u p l e x i n gp c r ，t h er a t i oo ft h ep a r t h e n o g e n e t i cc e l l sa n dm a l e c e l l si sa v e r a g e5 ；1 2i nt h em i c r o c o l o n y n er e s u l ti n d i c a t et h a tt h ed o u b l ep c rc a nd e t e c tt h e s o u r c eo ft h ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oc e l l sf r o mc h i m e r ab l a s t u l ai c m k e yw o r d s ：p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ；m a l ee m b r y o ；c h i m e r a ；b l a s t u l ai n n e rc e l l m a s s ：s e xi d e n t i f i c a t i o n v i i 独创性声明 学位论文题目：整煎邀佥煎雌墅膛发直国塞塑遨佥塞暨直邀绳胞丕回 性别塞遗比室盟究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 套丢乡曩 签字日期：2 0 0 9 年5 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名统孚纭 导师签 拶、 ， 签字日期：年 月 日 签字日期：年 ， f u 月 日 文献综述 第一部分文献综述 动物的生殖方式分有性生殖和无性生殖。一般而言，有性生殖的子代是由父母双方提供 配子，形成合子最终发育而成的个体；无性生殖的子代则主要是指通过体细胞核移植产生的 重构胚或卵母细胞激活后发育而成胚胎或个体。哺乳动物在几百万年的进化过程中形成了这 种既保持遗传多样性又适应多变环境的独特生殖模式，即有性生殖。但随着生物技术的不断 发展，人类却可以通过对细胞进行体外操作而获得无性生殖后代。1 9 9 7 年“多利羊”的诞生， 开启了哺乳动物无性繁殖的先河；2 0 0 4 年“辉夜姬”的出现，则预示着孤雌生殖也将为世界带 来新的奇迹，“辉夜姬”是世界上首例没有父亲的孤雌小鼠i 。 孤雌生殖是指在没有精子参与的情况下，卵母细胞被激活后发育为一个胚胎和个体的过 程，即由雌性配子产生胚胎或个体1 2 1 。孤雌生殖现象普遍存在于昆虫等低等生物，脊椎动物如 鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类等也存在着一定程度的孤雌生殖现象。低等动物及两 栖类的孤雌胚可以在自然条件下发育成完整个体【3 1 ，而在自然界中，还没有哺乳动物经过孤雌 发育产生完整个体的报道。 个体发育过程依赖于早期胚胎细胞基因组内部由d n a 结构决定的先后表达调控的顺序即 基因组d n a 结构上存在调控发育的程序。该发育调控程序在两性细胞成熟过程中开始建立到 配子形成后发育到囊胚阶段完成，在此期间伴随基因组的去甲基化使其处于重编程后“置零” 状态，只有在此状态才可以显露其控制发育程序的编程顺序。在以后的发育过程中只是按照 此时序和空间排序，在不同发育阶段通过d n a 的甲基化和核小体的去乙酰化过程，按照已有 的编程关闭和活化某些基因，使细胞出现由发育阶段所决定的特征性变化，既分化。这些变 化就是阶段性出现的表观遗传特征性状1 4 1 。 众所周知，与传统的孟德尔遗传方式不同，分别来自父母方的两个等位基因中只有一方 呈现表达，另一方被印迹，即不表达或表达甚微，这种遗传方式称为印迹遗传。动物基因组 的这种依赖单亲传递遗传信息的现象称为基因印迹( g e n ei m p r i n t i n g ) ，又称亲源印迹( p a r e n t a l i m p r i n t i n g ) 。出现印迹遗传的基因称为印迹基因( i m p r i n t e dg e n e ) 。调控发育程序的印迹基因 程序因为存在于d n a 结构上，应属调控基因性质。在基因组中的任意两条同源染色体中应该 数量相等，只是基因大小和所控制的表观遗传特色可以有所变化i s l 。在两条同源染色体都存在 的情况下，在发育的某个阶段显露某些表观遗传特征的基因表达活性应该由某一来源为主的 ( 父源或母源) 同源染色体所控制而启动。若为父源则为父源基因印迹作用。否则为母源基 因印迹作用决定。整个个体各个阶段表观遗传特征的基因表达程序即为发育程序1 6 1 。整个启动 其基因表达程序的顺序则为基因印迹作用。由父源和母源基因印迹作用共同构成，也就是说 在个体发育过程中当某条染色体上某个决定某一表观特征的基因需要表达时，其启动表达的 主要调控结构不是在父源染色体上，就是在母源染色体上用。如果父源染色体缺乏时，存在于 母源染色体的相类似的印迹基因是否能够被调节而发挥作用来替代父源染色体的作用，关系 到个体发育程序是否能够运行下去的问题，这种作用事实是父源基因印迹缺失弥补作用，机 体内个体发育过程中是否存在这种作用至关重要。涉及父源或者母源基因印迹控制个体发育 程序是稳定不变的，或者是可调易变的核心问题。 自然状态下哺乳动物的孤雌胚胎不能发育成个体，被认为是缺乏父源基因印迹作用所致。 两南大学硕十学位论文 美国b o s t o n 儿童医院等研究机构的研究人员分离出通过孤雌生殖生产的胚胎干细胞，并证明 这些干细胞能够分化为许多组织i s l 。但与有性生殖胚胎干细胞不同的是，不是全部的组织，认 为与缺失父系印迹的基因组有关。 哺乳动物卵母细胞经孤雌激活后。多数情况下只能发育至胚胎附植前后。以小鼠为例， 其孤雌激活的胚胎只能存活至妊娠期的第1 0 天1 9 1 ，其主要原因是缺乏父源性印迹基因的表达， 胚胎在附植过程中缺乏胎盘、胎膜等胚外组织发育的支持，使得胚胎在子宫附植失败，导致 胚胎死亡l t 川。因此在胚胎正常的发育过程中双亲基因组的参与是必要的，目前认为由于存在双 亲基因组表型遗传修饰的差异，不同亲代来源的等位基因在表达也存在差异，从而使得在缺 乏父源性印迹基因的情况下，胚胎不能正常发育。 2 0 世纪9 0 年代以来，随着哺乳动物细胞核移植研究的开展，孤雌激活、发育和正常受精 卵的生理学及形态学反应得到较为深入的研究，并开始在分子水平上研究激活和孤雌胚发育 的特性和机理，在实验动物、家畜及人卵母细胞激活方面均取得了较大进展。 2 0 0 4 年四月在自然杂志刊登了以日本东京农业大学t o m o h i r ok o n o 为首的日韩研究小组 以孤雌生殖方式繁殖小鼠的研究成果。该研究保留了不成熟卵子中母源染色单体不能表达l g f 2 基因( 该基因正常有性生殖情况下，只能在父源染色体组中表达，受父源基因印迹调控) ，剔 除了h 1 9 基因，并剔除了能够抑制i g i 2 基因表达的调节蛋白结合位点，使母源染色体组也能 够表达l g f 2 ，弥补了缺失父系基因的印迹作用 1 1 o 在孤雌胚胎发育的早期仅仅“操纵”h 1 9 和l g f 2 这两个基因就可以“绕过”小鼠有性生殖过程中雄性基因发挥的作用，使孤雌胚胎最终发育为成 活个体并取名为“辉夜姬”，该孤雌生殖小鼠存活到成年并出生了一窝健康的小鼠后代i l 引。这 种突变使得对胚胎发育起重要作用的类胰岛素样生长因子基因( i g f 2 ) 适当的表达，辉夜姬 因此顺利发育为具有生殖能力的成年鼠1 1j 。 由于雄性基因组在胚胎发育中是必须的，那么通过将孤雌激活胚胎与雄性胚胎嵌合发育 同样可以达到促进孤雌胚胎发育的作用。本研究就是在上述理论的指导下，从解决无性生殖 孤雌胚胎发育过程中由于缺乏父源印迹基因作用而入手，创新了研究模式，其结果不但能够 验证有性生殖发育过程的某些表观遗传规律，而且还有望探索一种能够促使孤雌胚胎干细胞 形成类似于有性生殖形式获得的健康胚胎干细胞系的方法，为干细胞组织替代性治疗开辟一 条新的更加科学有效的途径。 第一章小鼠孤雌胚胎与雄性胚胎嵌合发育影响因素研究 孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s ) 一词最早由o w e n ( 1 9 8 4 ) 提出，是指在没有雄性参与的情 况下，由卵母细胞发育产生个体的过程【1 2 1 。最近该概念已经被重新定义，即为无雄性配子的 任何作用，由雌性配子产生的胚胎，不论其是否发育成个体，均称为孤雌生殖【玎j 。 在自然界中，爬行类动物、鱼类动物、鸟类动物也存在着一定的孤雌生殖现象。两栖类 动物的卵子能够为实验激活、卵裂，并且有少数可以发育成个体。我国生物学家朱洗等由蛙 子宫取出蛙卵，使其卵膜粘有蛙血后用细针刺激，结果其中1 0 - 2 0 与受精卵一样进行正常卵 裂，并获得两只单性繁殖蛙i x 4 1 。 实验诱导哺乳动物孤雌发育的研究始于上个世纪3 0 年代，p i n c u s 等采用改变温度和渗透 压的方法激活兔卵，获得卵裂，并报道移植至受体后产生家兔后代，为后来的研究奠定了重 2 文献综述 要基础【l 量1 6 j 。在随后的4 0 5 0 年代，研究者们采用改变温度、渗透压以及使用麻醉剂来激活 小鼠【1 7 1 、大鼠【1 8 ，1 9 】、仓鼠例、家兔【2 l l 、雪貂和绵羊【2 2 】的卵母细胞，进行孤雌激活和孤雌胚发 育的研究。2 0 世纪7 0 - - - 8 0 年代许多学者开始研究提高孤雌激活率和发育率方法的研究。2 0 世纪9 0 年代以来，随着哺乳动物细胞核移植研究的开展，卵母细胞孤雌激活得以较为深入的 研究，在实验动物、家畜及人卵母细胞激活方面取得了较大进展。 因为孤雌生殖是人为激活卵母细胞获得的单一亲系的胚胎，这种胚胎含有来自母源基因 组拷贝，因此与卵子的供体有更具体的匹配，尤其能使细胞表面名为m h c 的抗原紧密匹配， 这些蛋白在每个个体几乎都是唯一的，当一个外源物质进入身体时，m h c 蛋白成为免疫系统 t 细胞的靶标，所以m h c 不匹配是移植的器官、移植的组织排斥的一个主要原因。由此，由 核移植得到的遗传学匹配全能胚胎干细胞和孤雌生殖得到的胚胎干细胞是移植用干细胞的潜 在来源瞄】。但是，两者相比，由于孤雌胚胎干细胞来源于生殖系卵母细胞，经历较少的分化 增殖与长时间分裂突变的过程、且端粒酶活性又具永生性，由这种干细胞诱导的分化细胞功 能强，生命周期长，如果以这种干细胞作为克隆的供体细胞，其克隆后代的生理健康程度将 会优于体细胞克隆的干细胞。因此研究孤雌生殖个体的发育规律对研究人类治疗性克隆的意 义重大。此外，观察孤雌胚与其它类型胚胎嵌合发育能力，研究哺乳动物胚胎发育过程中印 迹基因的表达情况，克服孤雌发育的障碍，对克隆繁殖具有高产性能的母畜健康后代群意义 重大。 1 哺乳动物卵母细胞孤雌激活研究进展 哺乳动物卵母细胞的人工激活是研究孤雌发育启动、体外受精和早期胚胎发育机理等相 关内容的重要手段，同时也是细胞核移植和显微注射受精技术的重要步骤。 1 1 卯母细胞激活的概念与原理 成熟的卵母细胞已经储备了充足的蛋白质、细胞器、r n a 、d n a 和能量，并且其中期纺 锤体始终处于聚合解聚的动态平衡之中，其他许多代谢过程也都十分旺盛，随时为进一步的 发育做好准备。受精时，精子使休眠的卵母细胞复苏，启动一系列的生化事件的发生、代谢 的变化和减数分裂的完成，最终导致细胞分裂。卵母细胞的这种复苏过程被称为卵母细胞的 激活。 然而，在没有精子的作用下，体内的卵母细胞也可能由于其他的因素越过m i i 期阻滞， 发生卵裂并继续发育。这种现象称为孤雌发育。如果孤雌发育能产生个体则称为孤雌生殖。 孤雌生殖在无脊椎动物较为普遍，脊椎动物中除哺乳类外均有孤雌生殖现象四l 。哺乳动物的 卵母细胞往往可以孤雌发育，例如l t s v 品系的小鼠，自发发育率很高，2 4 日龄以上雌鼠的 卵巢作组织切片观察时，均可见到卵裂胚胎。 采用人工的方法，包括物理、化学和生物方法，同样可以刺激哺乳动物卵母细胞孤雌发 育。并且利用核移植技术得到的重构卵也可以经人工激活而继续发育。 卵母细胞激活过程中会出现一系列的生理生化变化。其中，c a 2 + 的变化在卵母细胞激活中 起着至关重要的作用。哺乳动物受精时，精子激活卵子引起卵子细胞内发生持续数小时的反 复性的短暂的c a 2 + 升高，这就是c a 2 + 振荡( c a “o s c i l l a t i o n ) 。c a 2 + 振荡是哺乳动物卵子受精过 3 两南大学硕+ 学位论文 程中的普遍现象1 2 4 1 。通常c a “振荡是在精卵相互作用后的几分钟到十几分钟之内发生的。第 一次c a 2 + 升高一般可持续2 m i n 多的时间，第二次和第三次c a 2 + 升高也会持续较长时间，而以 后的每次c a 2 + 升高持续时间大约为1 r a i n 左右。第一次c a ：+ 升高的幅度明显高于后来的c a ：+ 升高的幅度。这些多次重复的c a 2 + 升高的间隔在每个卵子