（临床兽医学专业论文）常见鳗鲡品种的rapd分析与鉴定.pdf

福建农林大学硕士学位论文 1 摘 要 目的：搜集 6 种鳗苗：日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡、莫桑比克鳗鲡、 西里伯斯鳗鲡。应用传统形态学分类方法，计测这 6 种鳗鲡的主要形态学性状， 通过统计比较，结合鳗苗实际产地，并对照鳗鲡种类分布的相关文献，从形态学 上对 6 组鳗鲡苗种进行种类鉴定。用随机引物扩增多态性 dna技术对鳗鲡基因 组 dna进行多态性分析，从分子生物学上确立这 6 个鳗鲡品种的分类和遗传关 系。 方法：采集相关鳗鲡品种，按照产地分组编号，用电子分析天平称量体重后，于 载玻片上平直放置鳗苗，用游标卡尺直接测量鳗苗全长、头长、眼间距，显微镜 载物台游标尺测量背鳍与臀鳍前端基部之间的距离后，将其压制成透明水封片， 在显微镜下观察计测其总脊椎骨数。记录其体重、全长、头长、眼间距、背鳍与 臀鳍前端基部之间的距离、脊椎骨数，进行统计分析比较，结合鳗苗实际产地， 并对照鳗鲡种类分布的相关文献，从形态学上对 6 组鳗鲡苗种进行种类鉴定。 方法：剪取鱼尾，提取 6 个种类的鳗鲡组织基因组 dna，摸索聚合酶链反应体 系组分和反应条件。选择 32 条不同的随机排列碱基序列的多聚核苷酸单链为引 物，进行 rapd- pcr 扩增反应，将产物通过琼脂糖凝胶电泳，制备 dna多态性 图谱。通过种间多态性比较分析，从分子生物学上确立这 6 个鳗鲡种类的分类； 同时，对扩增的条带进行统计，计算 6 个鳗鲡种类的遗传相似系数和遗传距离。 结果：根据测定的 6 组鳗苗的形态学数据：脊椎骨数量、长鳍型和尾鳍扇圆形， 背鳍与臀鳍前端基部之间的距离、体长、体重、头长、体高、眼间距等统计结果， 结合鳗苗实际产地， 并对照 tony robinet等对鳗鲡种类分布的描述确定了各组鳗 鲡的种类。日本组鳗鲡产地在北半球太平洋，靠近日本，为长鳍型，脊椎骨数为 116.150.62，背鳍与臀鳍前端基部之间的距离占全长的 7.129.08%，鉴定为日 本鳗鲡； 欧洲组鳗鲡产地在大西洋欧洲沿海， 为长鳍型， 脊椎骨数为 115.900.34， 背鳍与臀鳍前端基部之间的距离占全长的 10.611.3，鉴定为欧洲鳗鲡；美洲 组鳗鲡产地在大西洋北美洲沿海，为长鳍型，脊椎骨数为 103110，背鳍与臀 鳍前端基部之间的距离占全长的 7.88.2，鉴定为美洲鳗鲡；太平洋组鳗鲡产 地赤道附近太平洋，为长鳍型，脊椎骨数为 104.270.65，背鳍与臀鳍前端基部 福建农林大学硕士学位论文 2 之间的距离占全长的 12.815.2，鉴定为花鳗鲡；南非组鳗鲡产地在印度洋南 非东部沿海，为长鳍型，脊椎骨数为 103.370.35，背鳍与臀鳍前端基部之间的 距离占全长的 13.514.4，鉴定为莫桑比克鳗鲡；菲律宾组鳗鲡产地在菲律宾 沿海，为长鳍型，脊椎骨数为 104.090.62，背鳍与臀鳍前端基部之间的距离占 全长的 9.2710.7，鉴定为西里伯斯鳗鲡。 经过 rapd电泳条带分析，筛选出 13 个扩增产物谱带清晰、多态性较好的 引物，用这 13 个引物共扩增出 129 条条带，片段大小范围为 2502500bp。其 中莫桑比克鳗鲡和西里伯斯鳗鲡产生的条带最多，出现了 28 条带，其他组产生 条带数目依次为花鳗鲡 25 条带，日本鳗鲡 20 条带，美洲鳗鲡 17 条带，欧洲鳗 鲡 11 条带。其中引物 s21 可单独作为 6 个鳗鲡种类的种间分子标记。根据公式 对获得的条带进行遗传距离分析， 统计得到 6 种鳗鲡的种间相似性系数和遗传距 离：莫桑比克鳗鲡与日本鳗鲡相似性系数为 0.4762，与花鳗鲡相似性系数为 0.4905，与美洲鳗鲡相似性系数为 0.1952，与欧洲鳗鲡相似性系数为 0.2262，与 西里伯斯鳗鲡相似性系数为 0.2524；日本鳗鲡与花鳗鲡相似性系数为 0.4333，与 美洲鳗鲡相似性系数为 0.2738，与欧洲鳗鲡相似性系数为 0.3333，与西里伯斯鳗 鲡相似性系数为 0.2833；花鳗鲡与美洲鳗鲡相似性系数为 0.2429，与欧洲鳗鲡相 似性系数为 0.2667，与西里伯斯鳗鲡相似性系数为 0.4262；美洲鳗鲡与欧洲鳗鲡 相似性系数为 0.5833 与西里伯斯鳗鲡相似性系数为 0.2976；欧洲鳗鲡与西里伯 斯鳗鲡相似性系数为 0.1595。将遗传距离实验数据输入计算机，用 ntsys 软件 进行聚类分析，采用 upgma 法构建 6 个鳗鲡种类的亲缘关系图。聚类分析显 示欧洲鳗鲡与美洲鳗鲡亲缘关系最近，首先聚为一类；花鳗鲡与莫桑比克鳗鲡有 较近的亲缘关系，日本鳗鲡与之也较接近，而西里伯斯鳗鲡关系稍远，这 4 种鳗 鲡聚为一类。本结果说明鳗鲡亲缘关系与鳗鲡的地理分布密切相关，除受地理分 布影响外，可能还受洋流运动的影响。 关键词：鳗鲡 种类 形态学 rapd 鉴定 福建农林大学硕士学位论文 3 abstract objective: applying a tradition method basis on the morphology classification, count and measure the main morphology properties of six kinds of eel, be tied in the actual product place of eel seedling, compare by the relevance document that eel kind distributes, and identify that six groups of eel seedlings on the morphology. use the random amplified polymorphic dna technology to analyze the polymorphism in eel s geneome dna, and establish the classification and inheriting relation on molecular biology of these six kinds of eel. method: collect the kinds of eel that related, be divided into groups and being numbered according to place of production, use the electron analytical balance weighing, placing the eel seedling flat on the flat, use caliper to measure the eel seedling the overall length, the head length, and eye spacing directly. after measuring the fore- base distance between the dorsal fin and the anal fin, press and make it into a transparent water closing glass plate, and measure general spine number by observing under the microscope. record the weight, the overall length, the head length, the eye spacing, the fore- base distance between the dorsal fin and the anal fin, the general spine number, and compare the statistical data and analysis. being tied in the actual place of production eel seedling, compare by the relevance document about eel kinds distributes, and identify that six groups of eel seedlings on the morphology. method: clip fishtail, extract six kinds of eel organization geneome dna, and try to find out the best condition of the polymerase chain reaction system. 32 random primers were adopted to analyze the polymorphism in rapd- pcr profiles. the outcome is passed though by agarose gel electrophoresis to preparat for collecting the illustrative plates of dna diversification. establishes the method of classify these six kinds of eel by analysis the dna diversification on molecular biology, at the same time, carrying out statistics the data about the strip expanding, and calculating the inherit distance and similarity of six kinds of eel. results: according to morphology of six groups of eel seedlings: spine quantity , long fin type and caudal fin fan are circular, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base, body strong point, weight, strong point, body height, eye spacing etc., be tied in the actual product place of eel seedling, compare by the 福建农林大学硕士学位论文 4 relevance document that eel kind distributes written by tony robinet, identify that six groups of eel seedlings on the morphology. the production place of japan group eel is in the northern hemisphere of pacific ocean, near to japan, a long fin type, the number of spine is 116.15 0.62, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base of the overall length accounts for 7.129.08% , identify that for anguilla japonica; group of anguilla anguilla place of production is along the coast in atlantic ocean europe, a long fin type, the spine number is 115.90 0.34, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base of the overall length accounts for 10.6 11.3%, identify that for anguilla anguilla; group of america eel place of production is along the coast in atlantic ocean north america, a long fin type, the spine number is 103110, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base of the overall length accounts for 7.88.2% , identifies that for anguilla rostrata; group of pacific ocean eel place of production for the equator vicinity pacific ocean, a long fin type, the spine number is 104.27 0.65, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base of the overall length accounts for 12.815.2% , identify that for anguilla mormorata; group of south africa eel place of production is along the coast in indian ocean south africa east, a long fin type, the spine number is 103.37 0.35, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base of the overall length accounts for 13.514.4%, identifies that for anguilla mossambica; group of the philippines eel place of production is along the coast in the philippines, a long fin type, the spine number is 104.09 0.62, the distance between the dorsal fin and the anal fin fore- end base of the overall length accounts for 9.2710.7% , identify that for anguilla celebesensis.the outcome is passed though by agarose gel electrophoresis to sift out 13 random primers that increasing the production of fairly good stretching of simultaneous limpid, much morphology, this 13 use together increasing comeout 129 strips belt, range of fragment big or small is 2502500bp. the strip belt that anguilla mossambica and anguilla celebesensis among them produce has been the most, 28 strips belt have appeared , the group creation strip belt number has been 25 strips belt other in proper order spend an eel, 20 has brought the anguilla japonica along, anguilla rostrata 17 strips belt, anguilla anguilla 11 strips belt. attractly, primers s21 among them is a molecular mark of six kinds of eel interspecific crossing alone. carry out inheritance on the strip belt gaining according to formula from when analytical, the modulus counting the interspecific crossing similarity getting six kinds eels is at a distance of with inheritance: the 福建农林大学硕士学位论文 5 anguilla mossambica and the anguilla japonica similarity modulus are 0.4762, with the anguilla mormorata similarity modulus is 0.4905,the modulus is 0.1952 with anguilla rostrata similarity, the modulus is 0.2262 with anguilla anguilla similarity , the modulus is 0.2524 with anguilla celebesensis similarity; the anguilla japonica and the anguilla mormorata similarity modulus are 0.4333, the modulus is 0.2738 with anguilla rostrata similarity, the modulus is 0.3333 with anguilla anguilla similarity , the modulus is 0.2833 with anguilla celebesensis similarity; the anguilla mormorata and the anguilla rostrata similarity modulus are 0.2429 , the modulus is 0.2667 with anguilla anguilla similarity , the modulus is 0.4262 with anguilla celebesensis similarity; the anguilla rostrata and the anguilla anguilla similarity modulus are 0.5833 and the anguilla celebesensis similarity modulus is 0.2976; the anguilla anguilla and the anguilla celebesensis similarity modulus are 0.1595. will inherit the distance experiment data entry computer, the clustering being in progress with ntsys software analyses, adopt upgma to follow the affinity relation picture structuring six eel breeds. the anguilla anguilla and anguilla rostrata genetic relationship clustering analysis is demonstrated are nearest , the primo is gathered being of the same class; but the anguilla mormorata and the anguilla mossambica have closer genetic relationship , the anguilla japonica and that approach also comparatively, anguilla celebesensis relation is slightly distant , this 4 kinds eels get together to be of the same class. result explains that the eel genetic relationship and the eel geographical distribution go hand in hand , may accept the effect that ocean current moves except being affected by the geographical distribution. keywords: rapd, identifies, eel, kind, morphology 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独 立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致 谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 福建农林大学硕士学位论文 6 前 言 1 鳗鲡种质资源现状 1.1 鳗鲡的种类与分布 鳗鲡在分类学上隶属于硬骨鱼纲、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属，为洄游性鱼类， 具有特殊的生活史，一般在淡水中生活、海水中产卵孵化1。1858 年 kaup 报道 该属鱼类有 45 种；1870 年 gunther 将其归并成 28 种；1939 年 schmidt 等根据 系统发生学和地理分布学，认为世界上鳗鲡属总共有 19 种(包含亚种)2：欧洲鳗 鲡、美洲鳗箭、日本鳗鲡、大鳗鲡、雷恩东澳鳗鲡、花鳗鲡、西里伯斯鳗鲡、大 口鳗鲡、古鳗鲡、波罗洲鳗鲡、印度鳗鲡、东非鳗鲡、莫桑比克鳗鲡、内陆鳗鲡、 双色鳗鲡、菲律宾鳗鲡、灰鳗鲡、澳洲鳗鲡和新澳鳗鲡；1984 年福建鱼类志编 写组记载了另 3 种：短头鲠鲡、乌耳鳗角和福州鳗鲡1。 在分布于世界各地的 22 种鳗鲡中，除欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡分布于大西洋之 外，其余的 l6 种均分布于印度太平洋一带3：日本鳗鲡分布于太平洋，产地在中 国、日本、朝鲜；欧洲鳗鲡分布于大西洋，产地在欧洲、非洲北部；美洲鳗鲡分 布于大西洋，产地在北美洲东部至加勒比海、格陵兰岛；花鳗鲡分布于印度洋、 太平洋，产地在印度洋马达加斯加岛东至太平洋中部诸岛、北至中国、南至印度 尼西亚；莫桑比克鳗鲡分布于印度洋，产地在南非东部、马达加斯加；西里伯鳗 鲡分布于印度洋、太平洋，产地在印度、马来西亚、菲律宾、新几内亚西部；等 等。分布于亚洲的有以下 7 种：西里伯斯鳗鲡、烟纹鳗鲡、花鳗鲡、加里曼丹鳗 鲡、日本鳗鲡、太平洋双色鳗鲡和双色鳗鲡4。 1.2 鳗鲡资源变动状况 世界上产量较多的有 6 种，即欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、澳洲鳗鲡、印非鳗鲡、 日本鳗鲡和花鳗鲡5，进行人工养殖的仅有日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡和澳 洲鳗鲡和太平洋双色鳗鲡 5 种6，被广泛作为养殖的种类主要是欧洲鳗鲡、美洲 鳗鲡和日本鳗鲡 3 种7。 福建农林大学硕士学位论文 7 60 年代前期，世界鳗鲡的产量以欧洲鳗鲡为主到了 70 年代和 80 年代， 日本鳗鲡的产量跃居第一，美洲鳗鲡位于第二，欧洲鳗鲡则退居第三8。目前， 除日本鳗鲡的产量仍保持较小增长外， 美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡的产量均有不同程度 的下降，这主要与其被开发的迟早和利用的强度密切相关9。 由于鳗鲡的特殊生活史，养鳗业形成以来，其养殖所需种苗一直依赖于捕捞 天然海区中的鳗苗。而鳗鲡的繁殖生物学、人工催熟与育苗迄今为止依然是世界 性科技难题，随着世界鳗鲡养殖的迅速发展，各国鳗苗需求量急增，堵截围捕下 海亲鳗、滥捕鳗苗的情况越演越烈，导致进入海洋的亲鳗和进入河流的仔鳗数量 越来越少， 而亲鳗进入深海产卵后便死去， 如此年复一年， 原有的资源损失殆尽， 却得不到有效的补充， 再加上全球生态环境变化， 天然鳗苗群体的数量急剧减少， 部分鳗鲡种类已列入濒危物种10，鳗鲡苗种资源的匮乏问题日益严重。如何能 可持续性地利用鳗鲡资源已成为养鳗业不得不重视的一大问题。 2 我国鳗鲡养殖种类概况 我国大陆海岸线漫长，为暖流能达到的边缘海区，水文状况适宜，众多的江 河流入造成了我国鳗鲡溯河期长、分布广的有利条件，因此鳗鲡种类和数量多于 近邻国家。我国大陆和台湾省已报告订名的鳗鲡有如下 10 种11：日本鳗鲡、花 鳗鲡、西里伯斯鳗鲡、双色鳗鲡、中华鳗鲡、疏斑鳗鲡、烟纹鳗鲡、福州鳗鲡、 乌耳鳗鲡、短头鳗鲡；我国鳗鲡养殖种类以日本鳗鲡和欧洲鳗鲡为主。 我国是世界上最大的鳗鲡生产国，全国共有鳗鲡养殖场 17001800 个，养殖 面积约 10 万亩，年产量约 13 万吨，我国养殖规模所需的日本鳗鲡苗种量应在 50 吨左右，欧洲鳗鲡苗种 60 吨，苗种需求年总量约 100 吨以上。我国年进口欧 洲鳗鲡苗种量约 60 吨、约 1.5 亿尾，养殖的欧洲鳗鲡占鳗鲡产量的 1/3 以上，出 口的烤鳗中欧洲鳗鲡约占 40。2008 年度欧洲鳗鲡苗种产量约为 90 吨，为正常 年景的 1/2；日本鳗鲡苗种产量约为 35 吨，为正常年景的 1/3。欧洲鳗鲡苗种资 源已经接近枯竭，年产量急剧下降，2007 年 6 月 315 日，在荷兰召开的“ 华盛 顿公约” (cites)缔约国会议，将欧洲鳗鲡列入公约濒危动植物附录 ii，并于2009 年 1 月起正式实施12；近年亚洲地区的日本鳗鲡苗种资源量维持在 100 吨左右， 福建农林大学硕士学位论文 8 年捕捞量近年均维持在 80100 吨，日本鳗鲡资源也严重衰退，苗种资源严重短 缺，导致苗种价格暴涨。而人工繁殖鳗鲡苗种在近年内还不可能形成生产能力。 因此，苗种资源将严重制约我国鳗鲡产业的正常发展。 在我国，积极保护苗种资源，拓展养殖新品种，是促进鳗鲡养殖发展的重要 基础。为合理地开发利用鳗鲡资源，部分地区在 1994 年开始已经展开鳗鲡养殖 品种拓展的研究13。起初少量引进美洲鳗鲡试养，主要在江苏、福建进行试验， 这一阶段美洲鳗鲡的养殖未见较为成熟的技术路线报道，但美洲鳗鲡与欧洲鳗 鲡、日本鳗鲡的养殖条件、生长规律等方面已经可到明显的区别14。2005 年， 部分养殖场又进行了其他鳗鲡种类的引进试养试验，如产于东南亚菲律宾、印尼 的种苗、产于非洲、澳洲的鳗鲡苗种等13。但由于对鳗鲡品种资源背景、生物 学习性缺乏认识，各品种引进后按照现有的鳗鲡养殖技术进行常规养殖，损失率 过高，影响了鳗鲡养殖新品种的开拓研究。因此，调查研究鳗鲡遗传关系及种类 鉴定，防止鳗鲡种质混杂及盲目统一化管理饲养，成为扩展鳗鲡养殖种类，确保 养鳗业稳定发展的关键。 3 鳗鲡种类的传统形态学分类 不过，国内外许多学者对如此众多的鳗鲡种类的分类尚存有不同意见。新种 和新记录种命名混杂，种质鉴定依据不明。长期以来，有关鳗鲡的分类问题一直 存在众多争议。而对我国所存有的鳗鲡分类与种数也众说纷纭，被多数学者认可 的分类为 22 种14：1939 年 schmidt等根据系统发生学和地理分布学区分记录的 19 种，加上 1984 年福建鱼类志编写组记载的 3 种1。如此众多种类，在传统分 类学上主要按照形态学标记方法进行分类15。目前，用于鉴别鳗鲡种类的主要 形态特征和指标主要有：体色、斑纹、背鳍基部到肛门的距离与体长的比例、脊 椎骨数、鳃条数、胸鳍条数、头长以及齿状数等。以往进行过较完整鳗鲡系统分 类只有 ege 在 1939 年的形态研究16。进行鳗鲡属物种鉴种与形态测量的形质， 根据 ege 报道(1939)包括有全长、肛前长、背鳍前长、头长、口裂长、眼嘴角 长、躯干长、上颚骨沟、鼻骨上颚骨齿带比例、表皮杂色斑及脊椎骨数等。 但由于部分形态学指标可塑性大、存在种间覆盖、缺乏可比性，经常会出现 福建农林大学硕士学位论文 9 划分结果不一致的现象。一些鳗鲡品种间的外部形态极为相似，特别是苗种阶段 更是难以区分。因此，单靠形态学进行鳗鲡的分类鉴别不够可靠，应借鉴其他生 物学鉴定指标加以区分。 4 分子标记技术在渔业上的研究与应用 目前在渔业管理和渔业生产中，涉及鱼类种质鉴定的问题主要从细胞水平、 蛋白质水平和dna水平着手进行，常用的方法有免疫学方法、同功酶电泳技术、 dna指纹图谱、线粒体dna技术(mito- chondrial dna，mtdna) 、限制性片段长 度多态性(restriction fragment length polymorphism，rflp)、随机扩增多态性dna (random amplified polymorphic dna，rapd) 、小卫星dna(minisatellite dna)、 微卫星(microsatellite dna)又称简单序列重复(simple sequence repeat，ssr)等标 记技术17。 4.1 渔业分子标记技术的应用概况 近年来，新的标记类型不断出现，关于鱼类分子生物学方面的研究也随之迅 速发展起来。 2006年，杨少闻，刘楚吾用识别5、 6碱基序列的17种限制性内切酶， 通过单、双酶切分析，分别构建了5种石斑鱼的酶切物理图谱，其中两种内切酶 的酶切谱带可作为鉴别这5种石斑鱼的rflp标记18；2009年李鸥、赵莹莹等利用 45对微卫星分子标记(ssr)，以草鱼自然群体为试验材料，探讨野生群体遗传多 样性研究中所需的最适样本量与标记量19，此外微卫星技术也已应用于大西洋 鲑20、鲶21、罗非鱼22的分子标记和遗传多样性研究中；2007年，王亮晖等运用 aflp技术分析了鲤鱼雌雄之间的差异23，有关aflp的应用也见于对鲶鱼24、虹鳟25 和牡蛎26的研究报道；此外还可见到rapd用于对鲶鱼27的研究；snp用于对鲶 鱼28的研究等等。至少有几百种分子标记现在都可以用于对上面提到的一些水 产动物种类的研究。 4.2 鳗鲡分子标记研究进展 有关鳗鱼种类鉴定、种间亲缘关系、种质资源结构等方面，在分子水平方面 福建农林大学硕士学位论文 10 的研究处于起始阶段，尤其以多个种类间遗传关系的报道数量较少。 2003 年梁俊、李道季等29采用pcr 扩增单位点微卫星的方法研究了日本鳗 鲡和欧洲鳗鲡的遗传差异：微卫星等位基因数目分布范围为 826，35 组被试的 显著性检验的结果表明其杂合性显著缺乏，日本鳗鲡 4 个亚种群的 f 值揭示了 日本鳗鲡亚种群内存在较弱但显著的遗传分化， 同时测算得出日本鳗鲡与欧洲鳗 鲡两个远缘种之间存在显著差异，计算 goldstein 的遗传距离并由此推算出两个 种的分化时间约为 200 多万年；2009 年龚小玲等30采用微卫星分子标记技术， 获得的微卫星有 76 条，设计引物 55 对，将筛选出的 18 对引物对澳洲鳗鲡 1 个 群体的 40 个个体进行了遗传多样性分析， 获得了 17 个微卫星位点适于澳洲鳗鲡 群体结构的研究分析。 5 rapd 技术及其渔业养殖上的应用前景 5.1 rapd 技术的原理 随机引物扩增多态性 dna 技术(random amplified polymorphic dna， rapd)，它是美国科学家 williams 等31于 1990 年建立的一种在 pcr(polymerase chain reaction)基础之上的可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标 记技术。rapd技术以基因组 dna为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸 序列(通常为 10 个碱基对)为引物，在热稳定的 dna 聚合酶(taq 酶)作用下，进 行 pcr 扩增。 扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、 溴化乙锭 （eb） 或 sybr green ? 等染色来检测扩增产物 dna 片段的多态性，以此反映基因组相应区域 dna多态性。当检测的 dna在扩增区域发生 dna片段插入、缺失，或引物结 合位点上的碱基突变时，pcr 产物就会增加、缺失或发生分子量的改变。 根据这个原理，虽然对每一个引物而言，其检测的 dna多态性是有限的， 只要使用能对整个基因组进行扫描的足够多的引物，就可以通过 rapd 技术对 生物的整个基因组 dna进行多态性检测，分析其多态性32；同样的，由于种类 间存在基因型差异，就一定可以得到某种类在某引物扩增下的特征性标记条带， 而引物不具有种属特异性，可应用于分类学研究，同时也避免了形态分类中趋同 进化的干扰，故 rapd技术也可在种类鉴定中发挥作用33。 福建农林大学硕士学位论文 11 作为一种遗传标记技术，rapd以方便、快捷、经济等优点作为可靠有力的 遗传分析手段，已被广泛应用于遗传多样性的研究、种类鉴定、物种分类和演化 的研究、构建遗传连锁图谱、杂交分析34和标记辅助育种等领域，对水生动物 的资源保护和遗传育种起到了现实的指导意义。 5.2 rapd 的特点、优势 rapd具有 pcr 快速、简便、样品用量少，灵敏度高，多态性检测率高、 可自动化等优点，另外，相较于其他分子标记技术还有一些独到之处： 5.2.1 设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析，合成一套引物可以用于 不同生物基因组分析35，也可选择大量引物对同一基因组 dna进行细致分析。 5.2.2 不需要同位素，安全性好，简便易行，不需要筛选探针制备克隆、分子杂 交标记等复杂程序，可直接对基因组 dna进行分析，省去诸多准备性工作。 5.2.3 不依赖于种属特异性和基因组的结构。在渔业管理和生产应用中，并且也 在鳗鲡种类、遗传关系等分子生物学方面研究尚未建立任何基础的情况下，rap d 技术比其他分子标记技术更适宜于对其进行 dna的多态性分析。 5.2.4 只要使用足够多的引物，能对整个基因组进行扫描，就可以通过 rapd技 术对生物的整个基因组 dna进行多态性检测，同时，亦得到某种类在某引物扩 增下的特征性标记条带，可在种类鉴定中发挥作用。 然而，rapd技术也有它自身的局限，rapd技术受许多因素影响，它要求 严格的反应条件，所以实验的稳定性和重复性极易受影响，因此，在进行 rap d 分析时，必须建立可重复的反应体系。另外，rapd 技术是显性遗传，不能识 别杂合子位点，遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮 盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降36。 5.3 rapd 技术在渔业上的应用 张德春等对鲤鱼的两个品系建鲤和兴国红鲤进行了rapd分析，找到了建鲤 与兴国红鲤品系间的rapd分子遗传标记；郑光明等以池塘养殖的鲮、麦鲮和野 鲮为材料，提取血液基因组dna进行了rapd扩增，通过缩短扩增反应时间和电 泳时间，快速鉴定3种不同的鲮鱼，建立了一套dna分子水平上快速鉴定鱼种的 福建农林大学硕士学位论文 12 方法；邓怀等37使用14种10 bp的随机引物对青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、 鲤鱼、团头鲂、胭脂鱼、土鲶和黄颡十种鱼进行rapd扩增，13种引物都得到较 清晰的dna带，其中9种引物扩增的带谱可以作为种间鉴定的标记；callejas和 ochando则成功地将rapd技术用于伊比利亚岛的8种鲤属鱼类的鉴定，仅使用了 10个随机引物，每个种都有数量不同的种特异性rapd标记38；另外，董在杰39 对建鲤基因组dna的rapd分析结果显示：建鲤群体内的遗传相似系数为 0.91810.0738，多态位点比例为0.4167，平均杂合度为0.1884。表明建鲤种质较 纯群体内的遗传变异程度较小,建鲤优良性状产生的分子学基础是等位基因的 杂合程度较高。 5.4 鳗鲡 rapd 技术的应用 rapd技术在鳗鲡研究中对于种类鉴定， 遗传渐渗和物种演化、 遗传多样性、 进化关系与系谱分析研究，以及构建遗传连锁图谱40，基因定位、性别鉴定以 及开拓育成杂交鳗鲡新品种等方面具有很大的应用前景。因此，近年来有关鳗鲡 rapd分析的研究也逐渐发展起来。 qiu jia jing和 yi ping li的实验41中将 29 个随机引物用以日本鳗鲡， 欧 洲鳗和派克鳗鲡（海鳗）的 rapd分析，共产生 299 个片段，分别统计计算出： 日本鳗鱼和鳗鱼派克之间的遗传相似性是 0.68 而遗传距离是 0.32，欧洲鳗和派 克鳗鱼之间的分别是 0.72 和 0.28，而以及日本鳗和欧洲鳗之间的分别是0.74 和 0.25； 2002 年杨弘、王希道等42利用 rapd技术从 32 个随机引物中筛选出 20 个引物，对日本鳗、欧洲鳗、美洲鳗的 dna进行扩增，均得到 113 条大小不 等的 dna片段，长度大部分在 5002300bp。其中 14 个引物共扩增出 37 个特 异性标记， 可用来区分这 3 种鳗鱼， 并且其分析结果与形态学分析的结果相一致； 2006 年胡庚东、尤洋、陈家长等43也运用 rapd技术在 20 种随机引物中筛选出 4 种随机引物进行扩增反应，得到日本鳗、欧洲鳗和澳洲鳗这 3 种鳗鱼的特异性 扩增条带、种间相似性指数(日本鳗和欧洲鳗之间的相似指数为 0.5565，日本鳗 和澳洲鳗、欧洲鳗和澳洲鳗的相似指数分别为 0.5102 和 0.5278)和遗传距离，认 为 3 种鳗鱼的遗传距离都比较大。 然尔，相较于分子标记技术在其他鱼类的广泛应用，目前有关鳗鲡 rapd 福建农林大学硕士学位论文 13 分析的研究还仅限于鳗鲡的个别种类之间，对于分布于太平洋、印度洋、大西洋 的其他诸多鳗鲡种类未有分子生物学方面的比较研究。 6 研究目的及意义 面对鳗鲡种类传统分类学指向不明，鳗苗养殖缺乏种质区别指导，资源混杂 的情况，研究不同鳗鱼的种内遗传结构及种间遗传差异，建立识别各种鳗鱼的分 子遗传标记已成为当务之急。虽然，大多数分子生物学标记技术都能弥补传统形 态学分类方法的不足，但仍存在制备特异性探针、设计特异引物的预备性工作较 为复杂等问题。并且，这些方法仅能用于鳗鲡的种类鉴定，无法判定鳗鲡种间的 亲缘关系。因此，而本课题选用 rapd技术进行研究，目的在于以下两个方面。 6.1 建立鳗鲡种类分子生物学的鉴定方法 在苗种资源问题已经成为阻碍鳗鲡养殖稳定发展的制约因素的大背景下， 利 用 rapd技术对鳗鲡种类分子生物学上的鉴定方法进行研究，建立起一套快速、 简便、高效的鳗鲡种类鉴定方法将对品种引进和相关研究具有重要意义。在采用 分子标记技术鉴定鳗鲡种类的基础上，有计划地开展对已知资源量、生物学习性 和具有养殖潜力的鳗鲡种类的养殖技术研究，以推广成熟技术，推动鳗鲡养殖业 的健康、稳定、可持续性发展。 6.2 分析多个种类鳗鲡的遗传关系 从 dna多态性的差异来分析多个种类的鳗鲡的遗传相似性，确定其种属系 统的关系，为研究鳗鲡在分子生物学上的分支分类关系奠定基础，为探索鳗鲡品 种间生物学习性的差异研究和鳗鲡苗种资源的保护， 提供准确的遗传背景资料和 依据。 福建农林大学硕士学位论文 14 第一章 鳗鲡的形态学研究 鳗鲡在分类学上隶属于硬骨鱼纲、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属。按照传统的形 态学标记方法进行鳗苗的分类鉴定， 主要通过观察鳗苗外观特征， 根据鳍型比例、 脊椎骨数等区分44。 1 试验材料 1.1 仪器 xsp- 4c解剖镜 上海光学仪器厂 bonso digi2000电子天平 德国sartorius 游标卡尺 上海量具厂 1.2 材料 载玻片，纱布。 1.3 试验动物 鳗苗由天马水产贸易公司和融兴养鳗场提供。按采集地点分为6组，分别依 次标识为：南非组、日本组、太平洋组、美洲组、欧洲组、菲律宾组。每组选择 50尾体态正常的健康个体。 2 试验方法 各组鳗苗的主要计测项目为其体重、全长、头长、眼间距、背鳍与臀鳍前端 基部之间的距离（以下简称背臀距） 、脊椎骨数。 将鳗苗用干纱布吸干体表水分，电子分析天平（感量0.01mg）称量体重后， 于载玻片上平直放置鳗苗，采用直接测量的方法对其主要形态性状分别进行测 福建农林大学硕士学位论文 15 定：游标卡尺（精度为0.02mm）测量全长、头长、眼间距，解剖镜载物台