（临床兽医学专业论文）乳真蛋白和尿素与铵态氮检测方法研究.pdf

中文摘要 中文摘要 目前，人们对乳制品的需求量越来越大，而作为乳制品基本来源的原料乳供 应却呈明显短缺态势。在此情况下，一些不法者为了自身利益而非法向原料乳中 加入其他外源物质，获取不正当利益。当前牛奶的掺假主要针对乳蛋白成分，使 用的掺假物质主要包括缩二脲、三聚氰胺等化工原料、尿素、硫酸铵等农用化肥。 引起这种掺假现象蔓延的原因主要在于现有蛋白检测技术的缺陷以及掺假物质检 测方法的局限性。 本研究针对目前乳品业发展中存在的上述状况，分别对乳真蛋白( t p ) 和尿 素氮与铵态氮检测方法及其检测体系进行了研究。其中乳t p 的检测通过建立微 量化l o w r y 反应体系进行，尿素氮和铵态氮的检测通过建立酶解b e r t h e l o t 反应体 系进行。研究中对每种反应体系建立过程中所涉及到的主要问题进行了实验摸索， 并依据方法学要求，对建立的每种反应体系从各主要方面进行了详细评价。 实验结果表明，两种反应体系分别可以准确、高效、灵敏的对乳t p 和尿素 氮与铵态氮总量进行测定，酶解b e r t h e l o t 体系还能分别定量尿素氮与铵态氮浓 度。各检测体系的主要特点如下： 微量化l o w r y 反应体系在自动分析应用中，其t p 测定结果准确性高，与凯 氏定氮法( 不添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质时) 间无显著性差异； 反应体系中样品液蛋白浓度为1 0 - - , 1 0 0 t a g m l 线性良好，最低检测浓度为5 1 t g ；可 以将乳样做5 0 0 倍稀释后直接测定，乳蛋白含量在0 5 5 0 9 1 0 0 9 时可准确定量。 方法在不同样品、不同测定时间内的重复性良好；乳中可能存在或人为添加的叠 氮化钠、碳酸氢钠、硫酸钠、尿素、三聚氰胺、硫酸铵、盐酸羟胺、硫脲、亚硝 酸盐、蔗糖和氯化钠等不会对测定结果产生干扰，重铬酸钾只有在浓度超过 1 0 m g m l 时，才对反应产生影响，其能使反应结果升高。 酶解b e r t h e l o t 法测定乳中尿素氮与铵态氮，在0 5 4 0 0 m g n 1 0 0 9 范围内可 准确定量( 即尿素1 0 7 3 m g 1 0 0 9 0 8 5 8 9 10 0 9 或硫酸铵2 3 6 m g 1 0 0 9 1 8 8 8 9 1 0 0 9 ，相当于3 1 2 5m g 1 0 0 9 2 5 9 1 0 0 9 蛋白质的含氮量) ，添加回收率高 扬州大学硕士学位论文 ( 9 6 ) 、结果准确，能够准确定量尿素氮与铵态氮总量及分别浓度，既能对人 为添加的尿素、硫酸铵等进行测定，也可以检测牛奶中含有的内源尿素氮( m u n ) 。 反应中牛奶样品的前处理采用t c a 沉淀法，该过程在脲酶处理之后进行。方法在 不同样品、不同测定时间、不同操作人员间的重复性好，乳中可能同时存在的叠 氮化钠、碳酸氢钠、硫酸钠、蔗糖、葡萄糖和氯化钠等不会对测定结果产生干扰， 超过一定浓度的重铬酸钾( 1 0 m g m l ) 、过氧化氢( o 6 ) 、硫酸铜( 1 0 m g m l ) 、 盐酸羟胺( 1 0 m g m l ) 、硫脲( 5 0 m g m l ) 、亚硝酸盐( 1 0 m g m l ) 会对反应 产生影响，且均表现为对反应的抑制作用。 关键字：乳、真蛋白、尿素氮、铵态氮、微量l o w r y 法、酶解b e r t h e l o t 法 a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e q u i r e m e n ta m o u n t sf o rd i a r yp r o d u c ta r ei n c r e a s i n g ，b u tt h e r ei sa l lo b v i o u s l a c ko ft h er a wm i l kw h i c ht h eo r i g i nf o ri t i nt h i sc a s e ，s o m eb a d m e nm i xe x t e r n a l s u b s t a n c e si n t oi tf o rt h ei n t e r e s to ft h e m s e l v e s t h ep h e n o m e n o nf a s t e n so nm i 墩 p r o t e i n , a n di t sr e a s o n sc o n t a i nl a c ko fd e t e r m i n a t i o nm e t h o d sf o ri ta n dl o c a l i z a t i o no f d e t e c t i o nm e t h o d sf o ra d u l t e r a t i o n i nt h ef a c eo fa b o v e m e n t i o n e dc o m p l e x i o n ，w er e s e a r c ht h ed e t e c t i o nm e t h o d sa n d s y s t e m sf o rm j t r u ep r o t e i n ( t p ) a n du r e an i t r o g e nt o g e t h e rw i t ha m m o n i u mn i t r o g e n s e p a r a t e l y t h et p sd e t e r m i n a t i o ne m p l o yt h em i c r o - l o w r ym e t h o dt h a ts e tu pb y e x p e r i m e n t a t i o n ，a n d f o ru r e a n i t r o g e n w i t ha m m o n i u m n i t r o g e n a r eu s e d u r e a s e - b e r t h e l o tm e t h o d i nt h es t u d y ，w er e s e a r c h e dt h em a j o ri s s u e sr e l a t i n gt oe a c h r e a c t i o ns y s t e mt h a tw a si nt h ep r o c e s so fe s t a b l i s h i n g ，a n de v a l u a t et h es y s t e m sb a s e d o nm e t h o d o l o g y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt w or e a c t i o ns y s t e m sa r ea c c u r a c y , e f f i c i e n c ya n ds e n s i t i v e ， n o to n l yd e t e c tt h et o t a la m o u n to ft pa n du r e an i t r o g e n 、析t ha m m o n i u m n i t r o g e n b u t d i s t i n g u i s hu r e an i t r o g e nf r o ma m m o n i u mn i t r o g e n t h ep r i n c i p a lc h a r a c t e r i s t i c so f e v e r ys y s t e m a r ef o l l o w i n g i nt h ea u t o - a n a l y z es y s t e m ，t h em i c r o l o w r yr e a c t i o n sr e s u l ti sa c c u r a t e ，a n dn o m a r k e dd i f f e r e n c e 谢t 1 1k j e l d a h lm e t h o d ( w h e nn oi n o r g a n i cn i t r o g e na n do r g a n i c n o n p r o t e i nn i t r o g e ns u b s t a n c e si ns a m p l e ) t h el i n e a ri sw e l lw h e nt h ep r o t e i n c o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f10 10 0 1 x g m li nr e a c t i o ns o l u t i o n ，a n di t sl e a s t d e t e c t i o nl i m i ti s5 9 9 t h es a m p l ec a nd i r e c td e t e r m i n a t i o nb yd i l u t i o n5 0 0t i m e s t h e m i l kp r o t e i nc a na c c u r a t eq u a n t i t a t i o nw h i l ei t sc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f0 5 扬州大学硕士学位论文 5 0 9 10 0 9 t h em e t h o d sr e p r o d u c i b i l i t yi sw e l lb e t w e e nd i s t i n c ts a m p l ea n da s s a y t i m e s o d i u ma z i d e ，s o d i u mb i c a r b o n a t e ，s o d i u ms u l p h a t e ，u r e a , a m m o n i u ms u l p h a t e ， h y d r o x y l a m i n eh y d r o c h l o r i d e ，t h i o u r e a , n i t r i t e ，s u c r o s ea n ds o d i u mc h l o r i d ei nm i l k d o n ti n f l u e n c er e s u l t p o t a s s i u md i c h r o m a t ei n c r e a s e r e a c t i o nr e s u l ti nt h e c o n c e n t r a t i o na b o v e10 m g m l t h er e c o v e r yr a t ea l eh i g h ( 9 6 ) a n dd a t aa r ee x a c t ，w h e nt h eu r e a s e b e r t h e l o t m e t h o du s e df o rd e t e r m i n a t i o no u t s i d eu r e an i t r o g e na n da m m o n i u mn i 廿o g e ni nm i l k t h el i n e a ri sw e l lw h e nt h en i 仃o g e nc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo fl - - 4 0 i _ t gni n r e a c t i o ns o l u t i o n ，a n di t sl e a s td e t e c t i o nl i m i ti s 0 0 9 “gn t h eu r e an i t r o g e na n d a m m o n i u mn i t r o g e ni nm i l kc a nc a na c c u r a t eq u a n t i t a t i o nw h i l ei t sc o n c e n t r a t i o ni nt h e r a n g eo f0 5 - 4 0 0 m g 1 0 0 9 ( c o r r e s p o n dw i t hu r e a1 0 7 3 m g 1 0 0 9 - - v 0 8 5 8 9 1 0 0 9 o r a n a m o n i u ms u l f a t e2 3 6 m g 10 0 9 - - 。1 8 8 8 9 10 0 9 e q u i v a l e n tt on i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n i np r o t e i nq u a n t i t y3 1 2 5m g l o o g 2 5 9 l o o g ) ，b e c a u s eo f s a m p l ed i l u t i o nt o1 5 0 t i m ea f t e rb yu r e a s eh y d r o l y s i s t h er e p r o d u c i b i l i t yi sw e l la m o n gd i f f e r e n ts a m p l e ， a s s a yt i m ea n do p e r a t o r s o d i u ma z i d e ，s o d i u mb i c a r b o n a t e ，s o d i u ms u l p h a t e ，s u c r o s e ， g l u c o s ea n ds o d i u mc h l o r i d ei nm i l kd o n ti n f l u e n c er e s u l t p o t a s s i u md i c h r o m a t e ( 10 m g m l ) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( 0 6 ) ，c o p p e rs u l f a t e ( 10 m g m l ) ，h y d r o x y l a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( lo m g m l ) ，t h i o u r e a ( 5 0 m g m l ) a n dn i t r i t e ( l0 m g m l ) d e c r e a s e r e a c t i o nr e s u l ti nt h ea b o v ec o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：m i l k ，t r u ep r o t e i n , u r e an i t r o g e n , a m m o n i u mn i t r o g e n , m i c r o l o w r ym e t h o d , u r e a s e b e r c h e l o tm e t h o d 符号说明 v i l 符号说明 声明与授权书 学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借 阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国 科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过 网络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名： ) k 耄南 导师签名： 匆 专矿 球锄 哆一么 ， 氧 她 矽 聪 弘 汶 。 论 字 钇 抖 撒 日 沩厂文 年 顶篓 飙 撑 彤 沩 引 项 链 体 朱秀高：乳真蛋白和尿素与铵态氮检测方法研究 1 选题背景 第一章前言 自上世纪8 0 年代实行改革开放至今，我国综合国力得到极大提升，人们的 生活水平也发生了巨大变化。俗语云“民以食为天”，在与人民生活紧密相关的衣 食住行四个方面，饮食结构的变化最能说明改革所带来的改变。伴随人们收入水 平的提高与健康饮食知识的普及，目前人们已经不再满足于大鱼大肉、山珍海味， 而是越来越注重食物的营养和品质。牛奶作为一种优质乳品，因其含有丰富均衡 的人类所需各种营养成分，而被越来越多的人所接受。据报道我国城镇居民2 0 0 8 年的乳类消费量为人均2 2 7k g ，比1 9 9 2 年增长1 4 6 2 ；而农村居民2 0 0 7 年乳 类的消费量为人均3 5 2k g ，比1 9 9 2 年增长2 0 3 ；与之相比同期肉类仅增长2 0 0 和4 0 9 0 。这数字的变化不仅说明人们对于牛奶的需求量越来越大，另一个侧 面也说明国内的奶牛养殖量和乳产量也在增长，资料显示，2 0 0 8 年国内奶牛存栏 为1 2 3 3 5 万头，比1 9 7 8 年增长了2 5 倍；同期我国的奶类总产量为3 7 8 1 5 万t ， 比1 9 7 8 年增长了3 8 倍。 面对人们牛奶消费总量的急剧增长，虽然国内奶牛存栏量在短期内得到了迅 速补充，但也仅能部分满足人们需求，这也是目前全球奶业发展所面临的趋势。 美国农业部预测，2 0 1 0 年全球前2 0 位牛奶生产国的牛奶消费量将上升3 1 ，而 同期奶产量增幅只有2 1 。造成国内牛奶短缺的原因一方面除了奶牛数量不足 外，另一方面是由于奶牛品种和饲养管理所引起的奶牛单产过低。据统计，2 0 0 8 年我国奶牛平均单产为4 8 0 0k g ，这一数字虽然比1 9 7 8 年提高6 0 ，但与世界平 均水平6 0 0 0k g 、发达国家8 5 0 0k g 相比，差距还十分明显，因此，为了满足人 们需求，除了要继续加大奶牛存栏量外，还需在培育优良高产品种和提高饲养管 理水平上下功夫。 乳类需求的增加在带动奶牛养殖量迅速上升的同时，也给乳制品行业发展带 来了前所未有的机遇，而乳制品生产企业的增多进一步加剧了原料奶的短缺状况。 2 扬州大学硕士学位论文 根据某省奶业协会统计，该地区2 0 0 7 年规模以上乳品加工厂有7 8 家，其总体设 计产能为日加工鲜奶6 0 0 0t ，但该省质检局2 0 0 8 年9 月的统计结果显示，所有企 业实际日加工鲜奶为1 2 3 8t ，还不到设计产能的四分之一。引起这一现象的最主 要原因在于原料奶供应不足，很多企业因为收不到鲜奶而不得不停止生产。面对 乳品业巨大的利润蛋糕，一些企业为了从中获益就降低原料奶收购的质量标准， 从而使得一些掺杂有外源物质的鲜乳进入加工环节，用这些类型鲜乳生产出的乳 制品入市流通，被消费者购买食用后，一方面会直接对食用者的身体健康产生不 利影响，另一方面也会使该企业的产品质量，在消费者心目中大打折扣，长此以 往将会严重影响企业发展，甚至使之倒闭，严重者还会引起消费者对整个行业的 不信任。2 0 0 8 年下半年震惊世界的三聚氰胺奶粉事件，不仅使有着5 0 多年历史 的三鹿集团一夜间轰然倒下，更使全世界对中国产乳制品产生了集体不信任感， 这一事件所造成的后果不仅仅表现在将辛苦多年培育起来的市场拱手让给了国外 企业，更为严重的是对直接食用这些产品的婴幼儿所造成的身体伤害，可能会影 响其一生。虽然目前该事件已经阶段性结束，但其所带来的阵痛还远未平息。 深入分析三聚氰胺奶粉事件，多数文章认为目前乳蛋白检测中所依赖使用的 凯氏定氮法在这一事件发生中起到了帮凶作用，掺假者正是在充分了解到该方法 缺陷后，才将含氮量为6 6 、可显著提升乳蛋白检测含量的三聚氰胺添加到鲜乳 中，以获取不正当利益。长期以来生鲜乳收购多实行按质论价，而判断鲜乳品质 的主要标准之一就是乳蛋白含量，但是由于测定方法和条件限制，目前并不能直 接测定鲜乳中的实际蛋白即t p 含量。根据对乳成分的分析，鲜乳中的含氮物质可 以分为两类：一类是乳蛋白，在全乳中一般含量为2 8 - - 一3 8 ；另一类为非蛋白 氮( m ) n ) ，占乳总氮的6 左右，而且这一类物质在正常乳中变动幅度不大，所 以，在实际乳蛋白测定中多使用凯氏定氮法精确测定乳中的含氮量，然后将得到 的含氮量通过计算转换为乳中的蛋白浓度，即乳的粗蛋白含量。当使用该方法测 定的乳品中没有掺入任何外源含氮物质时，得到的结果能够真实反映乳的蛋白含 量状况；但如果其中含有外源含氮物质， 干扰，从而严重影响测定结果的准确性。 那么这些物质就一定会对测定结果产生 因此，面临当今乳品质量中所发生的一 系列问题，有必要对传统测定方法进行改革，直接进行孚l t p n 定，通过t p 含量来 朱秀高：乳真蛋白和尿素与铵态氮检测方法研究 确定乳品质，给予合适价格，让掺假者无利可图。现今，美国、法国、澳大利亚 等国已经开始实施根据乳中t p 含量对鲜乳进行计价的措施【1 】。 目前，对国内而言实行按t p 含量进行计价的关键在于找到一种合适的可以 直接测定乳中t p 的方法。虽然在一些有关乳品的国家标准中也有测定t p 的方法 介绍，但这些方法多需要进行样品前处理，且程序复杂，容易给测定结果带来误 差。在前期试验中发现应用l o w r y 法测定乳中t p 具有一定可行性，而从检索到 的资料看，目前还没有关于应用l o w r y 法测定乳t p 的报道，根据预实验情况， 因为乳中还含有其他成分，所以为了使测定结果更为准确还需要对l o w r y 法在反 应试剂组成、反应条件及样品前处理等方面进行改良，使该方法在实际应用中操 作简单、结果准确。 在进行乳中1 l p 含量测定方法研究同时，考虑到单纯测定t p 可能会使一些掺入 外源含氮物质的原料乳混入生产中，对产品质量产生影响，根据目前调查，乳中 常见的外源含氮物质主要有尿素及铵态氮类农用化肥，三聚氰胺、缩二脲、羟甲 基羧基氮等有机氮物质。在当前，国家对三聚氰胺采取重拳打击的态势下，可能 存在某些不法者将尿素等作为主要掺假物质的现象。所以确定同时进行此类物质 测定方法研究，该研究包括两方面内容，分别为乳中尿素氮与铵态氮类物质总量 的测定和二者各自含量的测定。进行该项研究的另一方面意义在于，如果鲜乳中 不含有外源尿素氮和铵态氮，也可以对乳中所含有的m u n 进行定量。目前，m u n 作为进行奶牛生产性能测定( d h i ) 的必检指标，被广泛应用在改善奶牛营养、 降低养殖成本和提高繁殖率等方面，不过根据翟少伟统计【2 】，目前国内并没有统 一的m 1 烈测定方法，这就造成各文章报道的测定数据间可比性差，对该项目的深 入研究造成一定制约，因此，该项研究的另一个目的就是要通过实验确定一个适 合于在不同条件下应用的m 1 肘测定方法，以使不同研究者之间的结果可以相互借 鉴，提高研究效率，避免研究的重复性。 2 乳的正常组分及影响乳成分的因素 牛乳是奶牛产后为维持其后代正常生长发育所分泌的富含各种营养成分且 易于被消化吸收利用的一种流体。健康奶牛在产后一个星期内所产的乳称为初乳， 4 扬州大学硕士学位论文 其后一直到泌乳结束这一阶段内所产的乳称为常乳，初乳与常乳相比除了含有常 乳所具有的各种营养成分外，还含有大量免疫球蛋白，这些球蛋白被吸收后可以 直接升高犊牛血液中的抗体水平，提高犊牛对外界环境中病原性微生物侵袭的抵 抗力。一般来说，通常所指的鲜乳为常乳，常乳中含有丰富均衡的蛋白、维生素 和矿物质等营养元素，研究证实，牛乳中所含有的各种营养成分及其配比与人乳 相近，因此非常适合于人类饮用。目前已经对乳中的正常营养组分有了深入了解， 大体可以用图1 表示。这些营养成分在乳中所占的比例及品质会受到饲料、饲养 环境、管理方式及奶牛健康状态等因素影响而发生一定变化。本部分重点就与实 验相关的内容展开论述。 2 1 乳的正常组分 2 1 1 真蛋白 由于受测定方法影响，通常所说的乳蛋白主要是指粗蛋白( c p ) ，它有t p 和 n p n 两部分组成，其中t p 是乳的主要营养成分，也是乳营养价值的体现。乳t p 主要有血液中游离氨基酸被乳腺细胞摄取后经细胞内粗面内质网和高尔基体的联 合作用形成和转化为乳t p 的各种组分，最后通过泌乳活动与其他营养成分一起 排出乳腺。也有一部分t p 是通过胞饮胞吞或其他受体通道直接由血液中进入乳 腺腔与其他乳成分混合。 正常情况下乳t p 由酪蛋白、乳清蛋白及其他少量脂蛋白组成，这些蛋白在 总蛋白含量中各自所占的比例较为固定，其中酪蛋白含量最多、乳清蛋白营养价 值最高。 资料统计，虽然乳蛋白含量受多种因素影响，但一般较为稳定，正常鲜乳中 蛋白含量为3 - - 一4 左右。 朱秀高：乳真蛋白和尿素与铵态氮检测方法研究 2 1 2 乳尿素氮 图1 牛奶的营养成分组成 f i g 1t h ec o m p o n e n to fn o u r i s h m e n ti nm i l k 乳中含氮物质扣除t p 后称为n p n ，它有多种成分组成，包括尿素、铵盐、 肌酸、肌酸酐、尿酸、马尿酸及小分子肽等，其中尿素所占的比例最大，含量为 3 5 - - 4 8 。目前的研究结果公认，m u n 主要的直接来源为血液尿素氮( b u n ) 扩散进入乳中形成，而b u n 主要来自两个方面：含氮物质在胃肠道内的消化和 肝脏中氨基酸的代谢。 过去，人们一直认为在奶牛生理能够承受条件下尽可能多的增加饲料蛋白， 6扬州大学硕士学位论文 能够增加乳蛋白含量，但是这一理论在实际生产中并没有起到很好效果，因为乳 蛋白含量与饲料蛋白浓度之间并不是呈线性关系。一味增加饲料蛋白含量不仅造 成养殖成本升高，同时由于多余氮不能被机体有效利用而通过粪尿排泄到环境中， 造成了土壤、水体等污染。为了更好了解饲料蛋白被奶牛机体利用状况，动物营 养学家们研究了多种指标对体内蛋白代谢的指示能力，结果发现b u n 要比其他指 标更为适用，但b u n 的测定也存在一定缺陷即样品采集过程复杂且采集过程容易 对奶牛产生应激。随着人们对蛋白质在体内代谢过程的进一步了解，m u n 因为与 b u n 存在着高度相关性而引起人们注意【3 - 引，与b u n 相比，m u n 的测定过程要更 为简单和快捷。基于对这一新发现的重视，国内外科学家展开了对m u n 作为反刍 动物蛋白质营养状况指标的深入研究。f a v e r d i n 等在分析了来自饲喂7 8 种不同日 粮的4 1 9 头奶牛的m u n 数据后指出，m u n 浓度与b u n 浓度及日粮蛋白生产净能 比值之间存在高度相关性，并且m u n 与氮利用率之间的相关性要好于瘤胃氨浓度 指标，不过由于m u n 仅能解释氮利用率变异的5 5 ，所以作者认为特定的m u n 值只能大体指示泌乳期奶牛的蛋白代谢状况【6 】。s c h e p e r s 等利用3 5 6 头奶牛研究了 1 1 种饲料条件下m u n 的变化，结果发现由于在奶牛群体之间和群体内部存在差 异，所以利用m u n 值对单个奶牛的蛋白代谢状况进行评估准确性不高，但是利用 混合乳样的m u n 浓度可以有效对瘤胃降解蛋白进行评估r 7 1 。此外，其他研究者也 从不同角度对m u n 与蛋白营养状况之间的关系进行了试验，结果均显示m u n 的 变化能够指示反刍动物体内的蛋白营养状况，但这一指标受到较多因素的影响， 因此该指标更适用于同一群体奶牛之间饲料蛋白水平的纵向比较。与国外研究相 比，我国对m i 肘的认识较晚，系统性的研究报告还较为少见。赵秀英等对采自呼 和浩特市的部分乳样进行了m 烈测定，结果显示组内m u n 的数值变化较大，因 此作者认为利用该指标并不能很准确的综合评定奶牛营养状况，还需配合其他营 养指标的使用【8 1 。翟少伟在国内首次系统性研究了中国荷斯坦奶牛m u n 变化与日 粮蛋白质营养之间的关系，结果显示日粮蛋白质水平能够极显著影响血浆尿素氮 ( p u n ) 和m u n ，而对奶产量、各种乳成分及其含量均无显著性影响，且m u n 与p u n 之间存在显著的线性关系，其试验结果表明m u n 可以灵敏的反映出日粮蛋 白质变化【2 】。 朱秀高：乳真蛋白和尿素与铵态氮检测方法研究 除了在m u n 与饲料蛋白营养状况方面进行深入研究外，伴随养殖场主对精细 化养殖的要求和降低饲养成本的需求以及人们对规模化养殖所带来环境污染的认 识，目前也有一些国内外研究者对m u n 作为反刍动物氮排泄量的反映指标进行了 研究。j o n k e r 等利用m u n 、乳产量、乳蛋白浓度和日粮粗蛋白含量作为自变量建 立数学模型对尿氮( u n ) 和粪氮( f n ) 的排泄情况进行预测和评估，结果显示 在实际应用过程中该模型能够精确预测氮的排泄量，且均值与线性产生明显误差 的情况较少【9 】。k a u f f m a n 等研究了u n 和m u n 之间的关系，结果发现在一定的m u n 浓度范围内二者呈线性关系，这种浓度范围因奶牛品种而异，如果将体重( b w ) 作为评估二者关系的一项考虑指标则这种品种问的差异就不再显著，作者经验证 后推荐使用公式：u n ( g d ) - - 0 0 2 5 9 ( 士0 0 0 0 6 ) b w ( k g ) x m u n ( m g d 1 ) ，来利用m u n 和b w 评估u n 排泄量【1 们。国内学者张美莉等人利用拉丁方设计法对m u n 浓度与总 氮排泄量( t n e ) 之间的关系进行了研究，发现二者有着显著的线性关系，且相 关系数较高，据此作者认为这一试验结果提示可以应用m u n 浓度作为预测t n e 的 重要指标【l l 】。在翟少伟的报告中作者也对m u n 和t n e 、u n 及f n 之间的关系进行 了试验，结果m u n 与三者均显著相关，报告中作者还提出了用m u n 预测t n e 的 方程：m u n = 1 5 4 6 x t n e + 1 9 3 4 1 2 。 m u n 作为正常牛奶中的一个组分，因为其测定样品取材方便、含量与b u n 高度相关等优势，不仅被广泛用于评价奶牛机体的营养状况，近来也有不少报道 指出m u n 与奶牛繁殖机能间存在一定的负相关性，不过这一结论目前还存在一定 争议。g o d d e n 等人研究了6 0 个牧场1 3 个月的d 测定数据，对m u n 与牧场奶牛 繁殖性能之间的关系进行分析，统计结果显示利用m u n 对奶牛繁殖性能进行评估 受到多方面条件限制【l2 1 。t r e v a s k i s 等利用m u n 对过量含氮日粮与奶牛繁殖障碍之 间的关系进行了研究，结果发现对于放牧奶牛来说，没有证据表明高m u n 含量与 奶牛繁殖障碍之间存在相关性【l3 1 。为了使正常牛奶中含有尽可能少的m u n ，一些 研究者从遗传角度对m u n 进行了考察，但未取得明显进展。 从目前统计资料看，尽管m u n 含量受到多种因素影响，但正常乳中m u n 浓 度在一个固定范围内。多数研究者认为一般正常乳中m u n 含量为1 2 16 m g d l 1 4 , 1 5 。 8 扬州大学硕士学位论文 2 1 3 其他 维生素、矿物质、脂肪、糖等也是正常牛奶中的组分，这些物质多为乳腺细 胞直接从血液中吸收而来或者由前体物质进行合成后，在腺泡腔内与水分和蛋白 等混合形成乳汁，贮存于乳池中，最后通过泌乳活动经乳导管和乳头排出乳腺。 这些物质的存在对于牛奶营养作用的体现也是必须的。 2 2 影响乳成分的因素 由于牛奶中各成分均直接或间接来自于血液，据报道每生产1 l 牛奶约需 4 0 0 8 0 0 l 血液流经乳房，而血液中这些物质的含量主要受到饲养管理水平等外 在因素影响，此外奶牛个体的生理状态等内在因素也会使这些物质的含量发生变 化。 2 2 1 内在因素 目前关于内在因素对牛奶成分含量影响的报道主要集中在品种、胎次、泌乳 阶段、产奶量、健康状况等几个方面。 c e r b u l i s r 等人对几种不同品种牛主要乳成分的均值进行了比较，其中t p 含量 娟姗牛最高为3 5 4 、荷斯坦最低为2 9 7 ；乳脂成分娟姗牛最高为4 6 4 、短角 牛最低为3 5 9 【1 6 】。其他研究者进一步试验发现品种间乳成分的差异与品种间牛 只体重和乳产量的不同有一定关联【1 7 1 ，但具体关系还有待于深入研究。而根据目 前的研究结果，不同品种间m u n 含量并没有显著性差异。 胎次对于乳成分的影响，目前比较公认的研究结果是，随着胎次增加，乳t p 含量呈下降趋势，但m 肘的变化幅度较d x l 3 , 1 5 , 1 9 。 母牛产犊后其泌乳量在3 0 5 天泌乳期内随时间延长而发生规律性变化，根据 奶产量不同可将整个泌乳期分为初期、高峰期、中期和末期四个阶段。从目前研 究结果看，一些研究者认为- 孚l t p 从产后一直到5 1 0 周间呈快速下降趋势，然后 一直到泌乳末期缓慢上升。a r u n v i p a s 等研究指出m 肘浓度在产后第一个月内较 低，到第四个月时达到高峰，然后一直到泌乳末期逐渐下斛1 9 】。而另外一些研究 朱秀高：乳真蛋白和尿素与铵态氮柃测方法研究 9 者的试验结果则与此不同1 2 0 】。 通过对同一品种、同一胎次及同一泌乳阶段不同泌乳量奶牛群体的乳成分分 析，g o d d e n 等人发现m u n 与乳产量之间没有很好的相关性【2 ，但这结果与o l t e r 等人【2 2 】的结论相反。在同一奶牛群体内乳产量对其他乳成分的影响并没有显著性 差异。 疾病状态下，奶牛的泌乳量下降，甚至停止，但对乳成分的影响不大，从理 论方面来说只有发生乳腺损伤疾病时，乳成分才会出现一定程度的变化。r o w l a n d 报道患乳房炎腺区的牛奶与健康乳腺的牛奶成分相比，t p 含量仅有轻微变化，这 是因为患病腺区的乳中发生了t p 成分的转移，即乳清蛋白含量升高而酪蛋白含量 下降【2 3 1 。而有关疾病状态下m u n 含量的变化，目前还没有很明确结论，这主要与 疾病性质有关，因为m u n 主要来自于b u n ，而b u n 主要由肝脏形成，所以肝脏 发生疾病时很可能会对m u n 含量产生影响，不过，这还需要进一步试验与临床诊 断确认。 2 2 2 外在因素 很早以来人们就已经认识到饲养管理水平等外在因素能够对乳成分产生影 响，主要包括饲料组成、营养配比、环境温湿度和挤奶方式等。 奶牛能够利用的饲料种类有很多，目前奶牛饲养者多根据奶牛所处生理阶段 对营养成分的需求来配比不同类型的饲料原料，这一饲养方式称为全混合日粮技 术( t m r ) 。日粮中使用不同饲料原料进行组合，能够对乳成分产生一定影响， 据报道日粮中添加含脂大豆和棉籽饼粕能够提高牛奶的乳脂率，而饲料中尿素的 使用也能够达到相同效果。e m e r y 报道使用谷物或粗饲料作为能量补充源时，每 增加1m e a l 单位净能( n e ) ，乳蛋白量可上升0 。1 5 2 4 1 ，不过，目前这种机理还 不能清楚地进行阐述，而饲料中添加脂肪等油类物质时，可引起乳蛋白浓度降低。 s p o m d l y 发现日粮代谢能( m e ) 含量与- 孚l t p 浓度和产量之间存在正相关性 【2 5 】，d e p e t e r s 等分析大量数据后指出，随日粮n e 吸收量增加，t p 含量和产量也呈 递增趋势，n e 吸收每增加1 m e a l ，t p 含量相应增加0 0 2 3 、产量增加0 0 2 k g 2 6 1 。 1 0扬州大学硕士学位论文 b r o d e r i c k 等研究发现日粮c p 含量、干物质吸收水平等与m u n 之间存在正相关性， 而日粮每单位c p 浓度的n e 含量及n e 吸收程度与腻间为负相关性【3 1 。c a n n a s 等 人的研究则证实m u n 和b u n 与日粮c p 含量间存在紧密相关，而与日粮c p 吸收程 度间的相关性较弱【2 7 1 。 夏季高温条件下，奶牛会出现热应激反应，空气湿度的增大会加重这一反应 过程。所以夏季奶牛的产奶量会出现一定程度下降，而由于夏季奶牛饮水量增加， 采食量下降，牛奶中蛋白含量就会降低。目前许多学者的研究已经证实，夏季牛 奶中蛋白含量要低于冬季【2 8 铷】。有关m u n 随环境温湿度发生变化的情况，目前还 没有一致性结论，多数意见偏向于与t p 变化趋势相同。 挤奶方式对乳成分的影响主要表现在不同挤奶时间取得的牛奶中含有不同 量m u n 和t p ，不过，关于m u n 和t p 在不同时间乳中含量变化趋势，各研究者报 道并不统一【3 1 ，3 2 1 ，甚至也有一些学者指出在不同时间得到的牛奶中，二者并没有 显著性差异【3 3 1 。 了解与掌握对乳成分产生影响的各因素，在实际生产中可以： 第一：优中选优。加大优质高产品种的选育力度，努力从根本上提高奶牛群 体的生产水平； 第二：趋利避害。在日常饲养管理中可以根据奶牛所处生理状态的变化和环 境条件的变化，灵活调整饲料类型与养分组成，加大管理力度，为奶牛的稳定生 产，提供保障。 3 原料乳的掺假状况及原因分析 原料乳的掺假起于何时，目前并没有见到相关资料报道。但从所掌握的资料 看，这一现象从现代乳品工业发展起始就一直存在，不仅持续时间长，掺假手段 也是五花a f - j ，且有随检测技术不断进步而不断更新的特点。原料乳的掺假可以 分为三种情况：针对单一乳成分的掺假即单一掺假、针对几种乳成分的掺假即联 合掺假和针对牛奶整体的掺假即人造原料奶。牛奶的掺假对世界范围内乳品工业 的发展来说都是一个所要面临的问题，不过一些国家和地区由于经过长时间发展 朱秀高：乳真蛋白和尿素与铵态氮检测方法研究1 1 已经形成了比较完备的食品安全法律体系，使得掺假者在法律威慑或宗教信仰的 制约下，从最初敢于掺假到停止尝试，目前在这些国家和地区已经鲜有关于乳品 掺假的报道。我国目前正处于社会主义初级阶段，按经济水平来说是一个发展中 国家，在全国上下齐心发展经济、提升人民生活水平的过程中，难免会出现一些 问题，乳品掺假就是这其中比较突出的一点，由于乳制品业利润丰厚，而原料乳 供应明显不足，为了获取私利，一些不法人员就置人民的生命安全于不顾，非法 向乳中添加其他物质或利用一些物质人工勾兑鲜乳，在这一过程中监管的缺失或 不到位起到了推波助澜作用。本部分围绕目前国内鲜乳掺假的特点进行论述，并 分析了产生这种现象的可能原因。 3 1 掺假状况 向原料乳中掺假主要是将与乳中所含成份相似的物质通过一定方式加入到 乳中，使之通过感官等一般手段不易被发现，而获取不正当利益的现象，目前原 料乳的掺假特点主要表现在以下几个方面。 3 1 1 掺假物质多样化 从目前资料的调查情况看，原料乳中能够检测出的掺假物质可谓是品种繁多 3 4 - 4 2 ，既有传统的如水、豆浆、淀粉、尿素等一般物质，又有脂质末、水解植物 蛋白( h v p ) 、水解动物蛋白( m 心) 等食品性添加剂，甚至还发现有亚硝酸盐、 吐温8 0 等有毒有害物质。多数作者将这些物质分为两类即电解质和非电解质。 3 1 2 掺假手段多元化 调查发现，目前原料乳的掺假已不再局限于单纯针对某一种物质，而是几种 方法联合使用，这样就使得掺入后的鲜乳更难以辨别。同时，为了使掺入乳中的 物质特别是固体物质能够更好的在其中溶解，一些掺假者就想出了各种手段，甚 至这其中还有某些科研单位的协助。 1 2 扬州大学硕士学位论文 3 1 3 掺假检测多滞后 检测手段要明显落后于掺假物质的更新，这是当前乳品检测行业所面临的一 个尴尬局面。如三聚氰胺事件发生之初，三鹿技术部门都还没有搞清楚这究竟是 一种什么物质，更不用说及时开发与之相适应的检测方法。前面提到当前乳品中 检出的掺假物质多种多样，而目前所能够使用且结果具有广泛认可性的检测方法 却不是很多，并且大部分为具有高度专一性的单一物质检测法【4 3 1 。 3 2 原因分析 乳品掺假问题由来已久，刘迎春对于此的总结为：1 9 世纪开始流行、2 0 世 纪上半叶普遍化、2 0 世纪中叶精湛化m 】。对这种现象，我们也一直通过采取各种 措施来压制其发展，并努力使之消失，但截至目前并未起到明显效果【4 5 4 9 】。而曾 经面临同样问题的欧美等国家，通过长时间行动，目前已经很少再见到此种情况 的发生。与之相比，造成国内目前状况的原因可能为以下几个方面。 3 2 1 乳品掺假利润丰厚 掺假物质的廉价易得与牛奶出售后的丰厚回报是掺假者能够铤而走险、丧失 良知的根本动力。牛奶作为一种营养含量丰富的物质，在常温及以上条件下易于 变质，而一些养殖户由于没有任何保存设备，所以极易造成鲜乳在存放过程中的 酸败，为了掩盖真相、减少损失，就通过向乳中添加碱粉等物质来中和乳的酸度， 用这些劣质鲜乳来换取正常乳的价格。还有一部分养殖者单纯为了追求利润，而 故意向乳中添加水分、尿素等其他物质来提高乳的总量，以赚取不当利益。 3 2 2 掺假环节监管缺失 目前，关于乳品掺假的各项法律法规都还不是十分健全，已有的规范在实际 操作过程中由于适应性和人为因素的存在，其执行效果也受到一定影响。我国目 前实行的乳品质量管理标准中，针对乳品质量的检测主要包括三个方面即理化性 质、营养元素和微生物检测，用于掺假物质检测的标准和方法自8 3 版至今，并未 发生多大变化。监管方面由于存在多头管理，不同部门间因为各自利益关系，很 朱秀高：乳真蛋白和尿素与