（临床兽医学专业论文）锰致体外培养鸡胚脑神经元凋亡机理的研究.pdf

h ：1日d ，fl，；、 ， ， 口三王 i = 1 刊k 中文摘要i 英文摘要i i i 1 前言1 1 1 锰中毒与氧化应激l 1 2 锰中毒与线粒体损伤及能量代谢障碍2 1 3 锰中毒与钙稳态失衡3 1 4 锰中毒与a 突触核蛋白3 1 5 锰中毒与细胞凋亡4 1 6 试验目的与意义4 2 材料与方法。5 2 1 主要仪器与试剂5 2 1 1 主要仪器5 2 1 2 主要试剂。5 2 1 3 试验药品6 2 2 鸡胚脑神经细胞的制备、培养及处理6 2 3 检测项目与方法。6 2 3 1 鸡胚神经元的鉴定。6 2 3 2m n c l 2 对神经细胞活性影响的检测6 2 3 3m n c l 2 对神经细胞凋亡的形态学观察6 2 3 4m n c l 2 致鸡胚脑神经元氧化应激的检测7 2 3 5m n c l 2 致神经细胞凋亡的检测8 2 3 6 流式细胞仪检测线粒体膜电位( a y m ) 。8 2 3 7 线粒体呼吸链复合物活性检测方法8 2 3 8m n c l 2 对神经细胞内【c a 2 + 】i 浓度影响的检测。9 2 3 9 神经细胞内c a m 、a - s y n 基因m r n a 表达量的检测9 2 4 实验数据分析与统计l l 3 结果与分析1 2 3 1m n c l 2 对鸡胚脑神经元活性影响的检测结果1 2 3 1 1w s t - 1 比色法检测结果1 2 3 1 2l d h 活性的检测结果l2 3 2m n c l 2 对鸡胚脑神经元凋亡的检测结果1 3 3 2 1m n c l 2 对鸡胚脑神经元凋亡形态学检测结果1 3 3 。2 2m n c l 2 对鸡胚脑神经元d n a 损伤的检测结果1 5 3 2 3 锰对鸡胚脑神经元p s 影响的检测结果1 8 3 3m n c l 2 致鸡胚脑神经元氧化应激的检测结果2 0 3 3 1 细胞内r o s 含量的检测结果2 0 3 3 2 细胞内g s h 含量的检测结果2 l 3 4m n c l 2 对鸡胚脑神经元线粒体功能影响的检测结果2 1 东北农业大学农学硕十学位论文 3 4 1 锰致鸡胚脑神经元a y m 的检测结果2l 3 4 2 线粒体呼吸链复合物活性检测结果2 2 3 5m n c l 2 对鸡胚脑神经元内【c a 2 + 】i 影响的检测结果2 3 3 6m n c l 2 对鸡胚脑神经元内c a m 、a s y nm r n a 表达影响的检测结果。2 4 3 6 i 鸡胚脑神经元总r n a 提取与鉴定结果。2 4 3 6 2c a m 、a s y n 和g a p d h 基因p c r 产物鉴定结果2 4 3 6 3 实时定量p c r 检测结果2 7 4 讨论。3 2 4 1 鸡胚脑神经元分离、培养及鉴定3 2 4 2 锰对鸡胚脑神经元活性的影响。3 2 4 2 1 锰对鸡胚脑神经元抑制率的影响3 2 4 2 2 锰对鸡胚脑神经元培养上清中l d h 活性的影响3 3 4 3 锰对鸡胚脑神经元凋亡的影响3 3 4 3 1 锰对鸡胚脑神经元凋亡形态学的影响3 3 4 3 2 锰致鸡胚脑神经元d n a 损伤的影响。3 4 4 3 3 锰对鸡胚脑神经元磷脂酰丝氨酸的影响3 5 4 4 锰对鸡胚脑神经元氧化应激的影响3 5 4 4 。i 锰对鸡胚脑神经元内r o s 含量的影响3 5 4 4 2 锰对鸡胚脑神经元内g s h 含量的影响一3 6 4 5 锰对鸡胚脑神经元线粒体损伤及能量代谢的影响3 6 4 5 1 锰对鸡胚脑神经元线粒体膜电位的影响3 6 4 5 2 锰对鸡胚脑神经元线粒体呼吸链复合物的影响3 7 4 6 锰对鸡胚脑神经元庆j c a 2 + 】i 及c a m 基因m r n a 表达的影响。3 7 4 7 锰对鸡胚脑神经元内c t - s y n 基因m r n a 表达的影响。3 8 5 结论一3 9 致谢z i ( ) 参考文献4 l 攻读硕士学位期间发表的学术论文4 8 l i 专， c o n t e n t s c o n t e n ts c h i e s ea b s t r u c t i e n g l i s ha b s t r u c t i i i 1i n t r o d u c t i o n l 1 1m a n g a n i s ma n do x i d a t i v es t r e s s 1 1 2e f f e c t so fm a n g a n e s eo nm i t o c h o n d r i ad a m a g ea n de n e r g ym e t a b o l i s m 2 1 3t h ee f f e c to f m a n g a n e s eo nd i s q u i l i b r i u mo f c a l c i u mh o m e o s t a s i s 。3 1 4t h ee f f e c to f m a n g a n e s eo n a s y n 3 1 5t h ee f f e c to f m a n g a n e s eo na p o p t o s i s 4 1 6o b j e c t i v ea n ds i g n i f i c a n c e 4 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 5 2 1m a i nl n s t r i m e n ta n dr e a g e n t s 5 2 1 1m a i ni n s t r u m e n t s 5 2 。1 2m a i nr e a g e n t s 5 2 1 3e x p e r i m e n t a ld r u g s 6 2 2 p r i m a r yc u l t u r ea n dt r e a t m e n to f n e u r o ni nc h i c k e ne m b r y o 6 2 3d e t e c t i o ni t e r n sa n dm e t h o d s 6 2 3 1i n d e n t i f i c a t i o no f c h i c k e ne m b r y o n i cn e u r o n 6 2 3 2d e t e c t i o no f t h ea c t i v i t yo f e h i c k e ne m b r y o n i cn e u r o ni n d u c e db ym n p 6 2 3 3o b s e r v a t i o no fa p o p t o t i cm o r p h o l o g yi n d u c e db ym 一+ 。6 2 3 4d e t e c t i o no f o x i d a t i v es t r e s si n d u c e db ym n + 。7 2 3 5d e t e c t i o no f a p o p t o s i sb ym n 。+ 8 2 3 6d e t e c t i o no f 、i ，mb yf l o wc y t o m e t r y 8 2 3 7d e t e c t i o no f t h ea c t i v i t i e so f m i t o c h o n d r i a lr e s p i r a t o r yc h a i nc o m p l e x 。8 2 3 8d e t e c t i o no f c a + 1 i 9 2 3 9d e t e c t i o no f t h ee x p r e s s i o no f c a m , 1 ：i s y nm r n ab yr e a l - t i m ep c r 9 2 4a n a l y s i sa n ds t a t i s t i c s 1l 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 1 2 3 1d e t e c t i o nr e s u l to f t h ea c t i v i t yo f c h i c k e ne m b r y o n i cc e l li n d u c e db ym n p 1 2 3 1 1d e t e c t i o nr e s u l to f w s t - la s s a y 1 2 3 1 2d e t e c t i o nr e s u l to f l d ha c t i v i t y 1 2 3 2d e t e c t i o nr e s u l to f a p o p t o s i s 1 3 3 2 1d e t e c t i o nr e s u l to f a p o p t o t i cm o r p h o l o g yi n d u c e db ym a n g a n e s e 1 3 3 2 2d e t e c t i o nr e s u l to fd n ad a m a g ei n d u c e db ym a n g a n e s e 15 3 2 3d e t e c t i o nr e s u l to f p s 18 3 3d e t e c t i o nr e s u l to f o x i d a t i v es t r e s si n d u c e db ym n ”2 0 3 3 1d e t e c t i o nr e s u l to f r o s 2 0 ：；3 2d e t e c t i o nr e s u l to f g s h 2 l 3 4d e t e c t i o nr e s u l to f m i t o c h o n d r i a lf u n c t i o n 2 1 东北农业大学农学硕士学位论文 3 4 1d e t e c t i o nr e s u l to f a y m 2l 3 4 2d e t e c t i o nr e s u l to f m i t o c h o n d r i a lr e s p i r a t o r yc o m p l e x 2 2 3 5d e t e c t i o nr e s u l to ff c d + 1 i 2 3 3 6d e t e c t i o nr e s u l to f t h ee x p r e s s i o no f c a m l - s y nm r n ab yr e a l - t i m e 2 4 3 6 1i d e n t i f i c a t i o no f t o t a lr n a 2 4 3 6 2i d e n t i f i c a t i o no f p c rp r o d u c t i o no f c a m ，a s y ng e n e 2 4 3 6 3t h er e s u l t so f i m p c r 2 7 4d i s c u s s i o n s 3 ：1 4 1c u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no f c h i c k e ne m b r y o n i cn e u r o n 3 2 4 2e f f e c to fm n ”o nt h ea c t i v i t yo fc h i c k e ne m b r y o n i cn e u r o n 3 2 4 2 1e f 艳c to fm n ”o nt h es u r v i v a lp r o b a l i t i t yo fc h i c k e ne m b r y o n i cn e u r o n 。3 2 4 2 2e f r c c to fm n ”o nt h ea c t i v i t yl d h 3 3 4 3e f i e c to fm n o nc h i c k e ne m b r y o n i cc e l la p o p t o s i s 3 3 4 3 1e f f e c to fm n 什o nc h i c k e ne m b r y o n i cc e l la p o p t o t i cm o r p h o l o g y 3 3 4 3 2e f 梵c to fm n ”o nd n ad a m a g e 3 4 4 3 3e 毹c to fm n ”o np s 3 5 4 4e 能c to fm n ”o no x i d a t i v es t r e s s 一3 5 4 4 1e 仃e c to fm n ”o nt h ec o n t e n tr o s r 3 5 4 。4 2e f i e c to f m n 2 + o nt h ec o n t e n to f g s h 3 6 4 5e f f e c to fm n 计o nm i t o c h o n d r i ad a m a g ea n de n e r g ym e t a b o l i s m 。3 6 4 5 1e f l e c to fm n ”o n 、i ，m 3 6 4 5 2e 腩c to fm n ”o nm i t o c h o n d d a lr e s p i r a t o r yc h a i nc o m p l e x 3 7 4 6e f f e c to f m n ”o n c 矿+ 1 ia n dt h ee x p r e s s i o no f c a mm r n a 3 7 4 7e f f e c to fm n 什o nt h ee x p r e s s i o no fa - s y nm r n a 3 8 5 c o n c l u s i o n 3 9 a c k n o w l e d g e m e n t 4 0 r e f e r e n c e s 4 1 a c a d e m i ca r t i c l e sp u b l i s h e dd u r i n gt h em a s t e rd e g r e e 4 8 i v 令蔓 ； t 矿l一 。屯誊器r每 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 洼! 垫逡查墓丝孟蔓挂型虚明笪：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：静音 日期：二咖年月2e 1 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本 授权书) 学位论文作者签名：际耆 日期：，咖年多月2 日 导师 签 名：缸支 e 1 期：五痧年月b 日 、s j ! f0 i：盍 一l 摘要 摘要 锰为一种浅灰色过渡性金属元素，在工农业生产中应用广泛，如干电池、电焊条、农用灭菌 剂和化肥的制造与使用。锰也是一种主要的环境和工业污染物，过量摄入会对脑、肝、肺等产生 不同程度的损害作用，其中神经系统是锰毒性作用的主要靶器官。近年来，国内外对锰的神经毒 性机制进行了大量的研究，但主要集中在人和鼠，而对禽类的研究很少。本试验以原代培养的鸡 胚脑神经元为研究对象，在含终浓度为0 、1 5 、2 、2 5m m o l lm n c l 2 的d m e m 培养液中培养 2 4h ，应用流式细胞仪、原位末端标记、d n a 电泳分析、荧光染色、电子显微镜、实时定量p c r 染料法等方法，从细胞形态学变化、d n a 断裂变化、氧化应激、细胞内游离c a 2 + 浓度、线粒体 膜电位及c a mm r n a 表达水平等方面，研究m n c l 2 诱导鸡胚脑神经细胞凋亡的形态学变化、生 物学改变及可能的调控环节，初步探讨锰诱导鸡胚脑神经元凋亡的机制。研究结果表明： 1 应用尼氏体染色、a o e b 双荧光染色、透射电镜、d n al a d d e r 、t u n e l 法、流式细胞仪观 察不同浓度的m n c l 2 对鸡胚脑神经元的影响，结果表明m n c l 2 能诱导鸡胚脑神经元发生凋亡， 且凋亡具有剂量依赖性。 2 锰能够诱导鸡胚脑神经元发生氧化应激，导致g s h 含量降低，r o s 生成增加，破坏机体的抗 氧化系统及清除自由基的功能，造成鸡胚脑神经元发生氧化损伤，这可能是锰诱导鸡胚脑神经细 胞凋亡的机制之一。 3 锰能够使鸡胚脑神经元内线粒体呼吸链复合物l 、i i 、i i i 、i v 、v 活性和a1 l r m 降低，导致线 粒体损伤和能量代谢障碍，证实m n c l 2 可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。 4 锰中毒可使鸡胚脑神经元内 c a 2 + i 升高，c a m 基因m r n a 表达量降低，钙稳态发生紊乱， 提示钙稳态失衡在锰致鸡胚脑神经细胞凋亡中起一定作用。 5 锰中毒可使鸡胚脑神经元内c t s y n 基因m r n a 表达量增加，提示锰的神经毒性可导致a - s y n 发生变化。 综上所述，锰中毒可导致鸡胚脑神经元形态结构改变，抑制线粒体呼吸链复合物活性，影响 抗氧化功能，引发神经细胞钙稳态失衡，诱导鸡胚脑神经细胞发生凋亡。 关键词锰；鸡；神经元；细胞凋亡；线粒体呼吸链复合物：钙稳态 t ；扣 a b s t r a c t s t u d i e so nt h em e c h a n i s mo f m a n g a n e s e - i n d u c e da p o p t o s i so f n e u r o ni nt h e c h i c k e nb r a i n a b s t r a c t m a n g a n e s e ( m n ) i sal i g h tg r a yt r a n s i t i o n a lt u n g s t e n ，i ti sw i d e l yu s e di ni n d u s t r i a la n da g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n ，s u c ha sd r yc e l lb a a e f i e s ，m e t a lp e n c i l s ，s t e r i l i z i n ga g e n t sa n dc h e m i c a lf e r t i l i z e r a s 锄 m a j o re n v i r o m e n t a la n di n d u s t r i a lp o l l u t a n t s ，e x c e s s i v em a n g a n e s ed i s t u r b sn e r v o u sf u n c t i o n ，l i v e r f u n c t i o na n dl u n gf u n c t i o na n dr e s u l t si nm a n g a n i s m b r a i ni st h em a i nt a r g e to r g a no fm a n g a n i s m i n r e c e n ty e a t s ，m o s to ft h es t u d i e sf o c u so nt h er o d e n ta n dh u m a nb e i n g , w h l i eo n l yaf e wf o c u so nt h e p o u l t r y t h i ss t u d yt o o kt h ep r i m a r yn e u r o ni nt h ec h i c k e nb r a i n 嬲am o d e l n e u r o n sw e r ec u l t i v a t e di n t h ed m e mf o r2 4hw i t ht h ef i n a ic o n c e n t r a t i o no fm n c l 2 ( 0 ，1 5 ，2 ，2 5m m o i l ) i no r d e rt os t u d yt h e m e c h a n i s mo fm a g a n e s e i n d u c e da p o p t o s i so ft h en e u r o ni nc h i c k e nb r a i n ，s o m ei t e m sa b o u tt h e a c t i v i t yo fc e l l ，a p o p t o s i s ，m i t o c h o n d r i a lr e s p i r a t o r yf u n c t i o n ，o x y g e ns t r e s s ，c a l c i u mh o m e o s t a s i sa n d t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fc a mm r n aa n da - s y ni nt h en e u r o nw e r ed e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e da s f o l l o w s ： 1 a p p l y i n gn i s s lb o d ys t a i n i n g ，a o e bd o u b l ef l u o r e s c e n c ec o l o r a t i o n ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ，d n al a d d e r , t u n e la n df l o wc y t o m e t r ya s s a yt od e t e c ta p p o t o s i si n d u c e db ym a n g a n e s e i nn e u r o n s n er e s u l t ss h o w e dt h a tm n c l 2c o u l di n d u c ea p o p t o s i so ft h ec h i n k e ne m b r y o n i cn e u r o n s w i t hd o s e - e f f e c tr e l a t i o n 2 m a n g a n e s ei n d u c e dt h eo x i d a t i v es t r e s so fn e u r o n ，d e c r e a s e dt h ec o n t e n to fg s h ，a n di n c r e a s e d t h ec o n t e n to fr o s ，a n dd e s t r o y e da n t i o x i d a t i v ed e f e n s es y s t e mo fn e u r o n , r e m o v et h ef l e er a d i c a l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm n c i 2c o u l dc o u s eo x i d a t i v ed a m a g ei nt h en e u r o no ft h ec h i c k e n 3 t h ea c t i v i t yo fm i t o c h o n d r i a lr e s p i r a t o r yc h a i nc o m p l e x ( i ，i i ，i i i ，i va n dv ) a n daym d e c r e s e d i th i n t e dt h a te x c e s s i v em a n g a n e s ec o u l di n d u c et h ed a m a g eo fm i t o c h o n d r i aa n dt h e d i s t u r b a n c eo fe n e r g ym e t a b o l i s m 4 m a n g a n e s ei n c r e a s e dt h ec a l c i u mi o nc o n c e n t r a t i o nw i t h i nn e u r o n s ( c a 2 + 】i ) a n dd e c r e a s e dt h e e x p r e s s i o no fc a mm r n a 1 1 1 i si n d i c a t e dt h a tm a n g a n e s ec o u l di n d u c ed i s e q u i l i b r i u mo fc a l c i u m h o m e o s t a s i s 5 m a n g a n e s ed e c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fa - s y nm r n a ，t h e nt h er e s u l th i n t e dt h a tt h e n e u r o t o x i c i t yo fm a n g a n e s ec o u l di n d u c et h ec h a n g eo fa - s y n i tw a sc o n c l u d e dt h a tm a n g a n i s mc a nc h a n g et h em o r p h o s t r u c t u r eo ft h ec h i n k e ne m b r y o n i c n e u r o n sa n di n h a b i tt h ea c t i v i t yo fm i t o c h o n d r i a lr e s p i r a t o r yc h a i nc o m p l e x ，i n d u c eo x i d a t i v es t e s s s ， c a u s ed i s e q u i l i b r i u mo fc a l c i u mh o m e o s t a s i s ，i n d u c et h ea p o p t o s i so fn e u r o n s i ti n c l u d e dt h a t m a n g a n e s ec a r lc a u s et h ed a m a g eo fn e u r o ni nt h ec h i c k e nb r a i n i i i 东北农业大学农学硕士学位论文 k e y w o r d sm a n g a n e s e ；n e u r o n s ；a p o p t o s i s ；m i t o c h o n d r i ar e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x ；c a l c i u m i v c a n d i d a t e ：c h e nl e i s p e c i a l i t y ：c l i n i c a lv e t e r i n a r ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f x us h i w e n 一 ， 前言 1 前言 锰为一种浅灰色过渡性金属元素，散布在自然界中，有多种氧化态( 从+ 7 到3 ) ，在工农业 生产中应用广泛，如干电池、电焊条、农用灭菌剂和化肥的制造与使用。锰的某些化合物如高锰 酸钾( k m n 0 4 ) 是很强的氧化剂，具有杀菌作用。在医学上得到广泛的应用。动物体内的锰是 多种酶的组成部分或酶的激动剂，参与生长发育、糖与脂肪代谢、繁殖、凝血过程、神经及内分 泌系统活动等( 李兴升等，2 0 0 6 ； c r i t t e n d e np le ta l ，2 0 0 8 ；m o n t e sse ta l ，2 0 0 8 ) 。但锰也是 一种主要的环境和工业污染物，过量摄入会对脑、肝、肺等产生不同程度的损害作用，甚至具有 致癌、致畸、致突变作用( a s c h n e r m e t a l ，2 0 0 5 ) ，其毒性作用是一个多器官、多系统的过程， 而神经系统是锰毒性作用的主要靶器官。 慢性锰中毒早期多表现为神经衰弱综合症和植物神经功能紊乱，应用w h o 推荐的神经行为 核心测试组合( n c t b ) 检测发现，锰致神经行为功能改变主要表现在情感、记忆力、注意力、 协调性等方面( 林洁，2 0 0 0 ) 。对锰电焊作业工人神经行为功能进行测试，发现锰接触组在紧张、 抑郁、愤怒方面的得分明显低于对照组，同时接触组平均反应时和最慢反应时得分，以及数字广 度、数字译码、视觉记忆的平均得分均低于对照组，而且在利手的敏捷度和目标追踪总分、追踪 正确得分中，接触组均与对照组有较明显差异( 吴萍等，2 0 0 2 ；张文红等，2 0 0 6 ) 。张德兴等( 2 0 0 1 ) 研究发现过量锰可破坏新生小鼠海马结构，导致小鼠学习、记忆功能出现障碍。慢性锰中毒中后 期表现为不可逆的锥体外系神经受损，并伴有神经症状，出现类似帕金森综合症症状( p a lp ke t a l ，1 9 9 9 ) 。h u a n g 等( 1 9 9 8 ) 对5 名慢性锰中毒患者进行了1 0 年追踪，研究显示其帕金森病病 情逐年加重，以步态、僵直和书写等的改变最为明显，晚期表现典型的锥体外系受损症状，如肌 力减退、表情呆板、眼球运动不灵活，书写困难，字越写越小，走路时表现为前冲步态，转弯、 后退时易跌倒( 荆俊杰，2 0 0 8 ) 。此外，研究发现长期接触锰会对锥体束产生损害作用，表现为 随着锰作业年限的增加，脑运动传导时间明显延长，常规肌电图时限延长，电压增高( 王守正等， 2 0 0 4 ) 。 锰进入脑组织后，有选择性的贮留在纹状体神经细胞的突触内，使突触内的神经元数量减少。 大鼠染锰后，神经元树突棘数量增加，呈剂量效应关系。电镜下观察，可见黑质和尾壳核溶酶体 数量增加，部分皮质神经细胞核出现异常，脑细胞线粒体局部嵴消失或紊乱，出现空泡化，线粒 体异常( 张素蓉，2 0 0 4 ) 。 锰中毒的研究已有近百年的历史，国内外很多研究证明，锰中毒主要损害神经系统，其中脑 是其主要的靶器官。锰中毒对神经系统具有多方面的影响。 1 1 锰中毒与氧化应激 锰是生物体必需的微量元素之一。机体内的锰以m n 2 + 、m n ”和m n 4 + 3 种状态存在于细胞中， 其氧化性的强弱依次为m n 4 + m n 3 + m n 2 * ( 张杰等，2 0 0 8 ) 。锰中毒时，大量的锰被氧化，在价 态的转化过程中产生单电子转移，生成大量带有不配对电子自由基( h a m a ide ta l ，2 0 0 1 ) 。急 性产生的大量自由基在体内堆积，作用于生物膜的不饱和脂肪酸，使脂质过氧化增加，导致细胞 膜结构发生改变，细胞正常生理功能受损，发生锰中毒。m n c h 可引起脂质过氧化，大量的证据 表明锰可催化脂质过氧化过程中氧自由基的产生( h o n d ae ta l ，2 0 0 4 ) 。s t r e d r i c k 等( 2 0 0 2 ) 通过 体外培养人神经母细胞瘤( s k - n s h ) 细胞和儿茶酚胺能( c a t h a ) 细胞来研究锰的毒性，结 东北农业大学农学硕士学位论文 果显示，锰暴露可引发神经细胞毒性，细胞内活性氧( r o s ) 含量增加，证实了r o s 的形成参 与了锰中毒的致病机制。张芳林等( 2 0 0 8 ) 通过线粒体孵育液染锰来研究锰对大鼠脑线粒体的影 响，结果显示，与对照组相比，5 0 、5 0 0 、1 0 0 0m m o l l 染锰组丙二醛( m d a ) 含量显著升高， 5 0 0 、1 0 0 0m m o l l 染锰组还原型谷胱甘肽( g s h ) 含量显著降低，且在一定范围内随着m n c l 2 浓度的增加，m d a 含量有升高趋势，g s h 含量有降低趋势。徐兆发等( 2 0 0 7 ) 给大鼠腹腔注射 1 5 0l l l m o l k gm n c l 2 溶液，结果显示大鼠肝、脑和肾组织m d a 含量显著增加，g s h 含量降低， 表明锰可诱发氧化应激造成组织损伤。z h a n g 等( 2 0 0 8 ) 采用大鼠皮下注射2 0 0g m o l k gm n c l 2 ， 注射剂量为5m l k g ，连续注射2 1 d ，研究发现锰使脑神经细胞内线粒体g s h 含量降低，超氧化 物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 活性下降，m d a 含量升高。刘祯等( 2 0 0 4 ) 用不同浓度的二价锰和三价锰( o 2 5m m o i l 、0 5 0m m o l l 、o 7 5m m o l l ) ，分别作用体外培养 的神经母细胞瘤细胞( s h s y 5 y ) 2 4h ，结果显示，三个浓度组的过氧化氢酶( c a t ) 活性，s o d 和g s h p x 活性降低，中、高浓度组的g s h 含量明显下降，中、高浓度组m d a 含量升高，与 对照组比较差异具有显著性。陈小敏等( 2 0 0 6 ) 通过检测锰电焊作业人员血清m d a 含量、s o d 和g s h p x 活性，发现锰接触组m d a 含量显著升高，s o d 和g s h p x 活性显著降低。上述结果 表明，过量的锰可引起体脂质过氧化增加，损害机体抗氧化能力，从而导致氧化应激的发生。 1 2 锰中毒与线粒体损伤及能量代谢障碍 线粒体在细胞中起着重要作用，被认为是细胞内的“动力站”( m d n o r e n b e r g ，e ta l ，2 0 0 7 ) 。 它是动物细胞进行有氧