（临床检验诊断学专业论文）gmcsf和bzlf1融合基因重组腺病毒表达载体的构建.pdf

i u ll l li l l l i ii i ii i ii il y 17 3 3 5 5 2 c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o r c a r r y i n gg m - c s f a n db z l f l g e n e a b s t r a c t o b j e c t i v e t h eh u m a n g r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r ( g m c s f ) g e n ea n d t h ee b v e n c o d i n gi m m e d i a t ee a r l yg e n e s ( b z l f l ) w e r ef u s e dt o b z g mg e n e t oc o n s t r u c tb z g mr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o ra n dt op l a y t h ef u s i o ng e n ec o d i n gp r o d u c t sg m c s fe n h a n c i n ga n t i t u m o ri m m u n i t ya n db z l f l i n d u c i n g l a t e n te b vt o l y r i cr e p l i c a t i o n t h ec o n s t r u c t i o no fb z g mr e c o m b i n a n t a d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rc o u l dp r o v i d ea ne x p e r i m e n t a lf o u n d a t i o na n dt h e o r e t i c a l b a s i sf o rk i l le b v p o s i t i v et u m o rc e l l s m e t h o d sg m - c s fe d n aw e r ec l o n e df r o mh u m a np e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l sa n db z l f le d n aw e r ec l o n e df r o mb 9 5 - 8c e l ll i n eb yr t - p c r t h ef u s i o ng e n e b z g mw a sc o n s t r u c t e dt h r o u g hap o l y p e p t i d el i n k e r ( g l y 4 s e r ) 3b yu s i n gs p l i c e d o v e r l a pe x t e n s i o n ( s o e ) t h ef u s i o ng e n eb z g m w a ss u b e l o n e di n t os h u t t l ep l a s m i d p a d t r a c k c m v t h es h u t t l ep l a s m i da n dt h eb a c k b o n ep l a s m i dp a d e a s y 一1w e r e r e c o m b i n a t e d h o m o l o g o u s l y i n e c o f ib j 5 1 8 3c e l l s ，t h e nf u s i o n g e n ee u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rp a d - b z g mw e r ec o n s t r u c t e d p a d b z g mv e c t o rw i t ha n t i b i o t i c c u l t u r ep l a t eb o l t i n gw e r et r a n s f e c t e di n t o2 9 3c e l l st oo b t a i nr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u s v a d - b z g m r t p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n gw e r eu s e dt oi d e n t i f yt h es t a t eo fh u m a n n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac n e c e l l si n f e c t e dw i t hv a d - b z g m m i tw a su s e dt od e t e c t t h ep r o l i f e r a t i o no fc n ec e l l si n f e c t e dw i t hv a d - b z g m r e s u l t sg m c s fg e n ea n db z l f lg e n ew e r ef u s e dt ob z g mg e n e t h er e s u l to f d n as e q u e n c i n gd e m o n s t r a t e dt h a tb z g mh a si n s e r t e di nt h ee x p e c t e ds i t ei nt h e r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o ra n dt h ei n s e r t i o ns e q u e n c ew a se x a c t l yc o r r e c t r e c o m b i n a t i o na d e n o v i r u sv a d - b z g mw a sa c q u i r e db yt r a n s f e c t e dw i t hp a d - b z g m i n t o2 9 3c e l l s w e s t e r nb l o t t i n ga n dr t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f b z g mg e n ea n de b ve a r l yg e n eb m r f lc a nb ed e t e c t e di nc n ec e l l si n f e c t e dw i t h v a d b z g m ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tf u s i o ng e n ec o u l di n d u c ee b vf r o ml a t e n c yt ol y r i c p r o l i f e r a t i o nc y c l e t h er e s u l t so fm t i m a n i f e s t e dt h ei n h i b i t i o np r o l i f e r a t i o no fc n e c e l l sb yv a d - b z g mw a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o nb z g mr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sv e c t o rh a sb e e nc o n s t r u c t e d ，a n dc o u l d b ep a c k a g e di n t or e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sv a d b z g mi n2 9 3c e l l s t h ef u s i o ng e n e -：-f b z g mw a se x p r e s s e ds t a b i l i t yi nc n ec e l l si n f e c t e dw i t hv a d - b z g m v a d - b z g m c o u l de f f i c i e n t l yi n d u c ee b vf r o ml a t e n c yt ol y t i cr e p l i c a t i o nc y c l e ，t h e ni n h i b i t e dt h e p r o l i f e r a t i o no fc n ec e l l s ，w h i c hm i g h tp r o v i d ea ne x p e r i m e n t a lf o u n d a t i o nf o rf u r t h e r e x p l o r et h ef u n c t i o no fb z g mg e n e p o s t g r a d u a t es t u d e n t ：y i n gc u i ( c l i n i c a ll a b o r a t o r yd i a g n o s t i c s ) d i r e c t e db y ：p r o f c h e n g y ul i u ，p r o f b i n gl u o k e yw o r d s ：h e r p e s v i r u s4 ，h u m a n ；g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g ec o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r ；g e n e s ，i m m e d i a t e - e a r l y ；g e n ef u s i o n ；g e n e t i cv e c t o r s -ll l_，lj l l ， lr l； o l 目录 弓i 言1 第一章材料与方法1 1 1 仪器、试剂和耗材1 1 2 目的基因的制备3 1 3 构建g m c s f 和b z l f l 融合基因b z g m 8 1 4 腺病毒穿梭载体p a d t r a c k c m v - b z g m 的构建1 0 1 5 在r e c a + b j 5 1 8 3 宿主菌中构建重组子1 3 1 6 重组腺病毒载体转染2 9 3 细胞1 5 1 7 重组腺病毒融合基因的表达1 5 1 8w e s t e r nb l o t t i n g 检测外源基因的表达1 5 1 9 重组腺病毒对e b v 阳性c n e 细胞的作用1 6 第二章结果1 7 2 1 目的基因r t - p c r 电泳结果1 7 2 2 融合基因p c r 电泳结果1 7 2 3 融合基因的序列测定1 8 2 4 重组穿梭质粒p a d t r a c k c m v - b z g m 的鉴定2 1 2 5 大肠杆菌r e c a + b j 5 1 8 3 中重组腺病毒载体p a d b z g m 的构建2 2 2 6 重组腺病毒载体的包装2 3 2 7e b v 阳性c n e 细胞中重组腺病毒的表达2 3 2 8w e s t e r nb l o t t i n g 检测外源基因的表达2 4 2 9r t p c r 检测早期基因的表达2 4 2 1 0m t i 检测结果2 5 第三章讨论2 6 第四章结论3 2 参考文献3 3 综述3 6 参考文献5 7 攻读学位期间的研究成果6 8 致谢6 9 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明7 0 引言 引言 e b 病毒( e p s t e i n b a r rv i r u s ，e b v ) 是嗜b 淋巴细胞的疱疹病毒，为致瘤病毒 之一，与人类恶性肿瘤( 如b u r k i t t 淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病、免疫缺陷病人的b 淋巴细胞瘤及胃癌等) 的发生有关【卜们。研究表明，e b v 阳性癌组织中e b v 基因组 存在于几乎所有的癌细胞中，提示e b v 可能是治疗e b v 阳性肿瘤的理想靶点。e b v 即刻早期基因b z l f l 是诱导潜伏期病毒活化进入裂解期的关键基因，其编码蛋白 为转录激活因子，可激活病毒早期基因和晚期基因使病毒进入裂解期进行复制。 e b v 大量增殖后经细胞膜释放可导致肿瘤细胞溶解死亡，起到选择性杀伤e b v 阳 性肿瘤细胞的作用1 7j 。 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( g m c s f ) 主要由t 淋巴细胞和巨噬细胞产生， 是一种具有多种生物活性的细胞因子，将g m c s f 基因转入宿主体内，可以提高其 免疫原性，从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答【8 l 。本研究拟将人g m c s f 编码基因和 e b v 即刻早期基因b z l f l 进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体， 深入探讨融合基因表达对e b v 阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗e b v 相关肿瘤提供实验基础和理论依据。 1 1 仪器、试剂和耗材 第一章材料与方法 1 1 1 主要仪器 ( 1 ) d n a 扩增仪4 8 0 型( 美国p e 公司) 。 ( 2 ) 可调式微量移液器( 法国g i l s o n 公司) 。 ( 3 ) 电泳仪、水平及垂直电泳系统( 美国b i o r a d 公司) 。 ( 4 ) t f x 2 0 m 紫外透射仪( 法国v i l b e rl o u r m a t 公司) 。 ( 5 ) r s 2 3 2 c 型紫外分光光度计( 德国e p p e n d o r f 公司) 。 ( 6 ) 高速低温台式离心机( 德 e p p e n d o r f 公司) 。 ( 7 ) 电子天平b s 2 0 0 s 型( 德国s a r t o r i u s 公司) 。 ( 8 ) 电转仪( 美国b i o r a d 公司) 。 ( 9 ) 二氧化碳培养箱( 美国s h e l l - l a b 公司) 。 ( 1 0 ) 倒置荧光显微镜b x 4 0 b x f l a 3 型( o l y m p u s 公司) 。 ( 1 1 ) 超声粉碎仪( t o y o z v m id e n g e n k i k ic o l t d 公司) 。1 ( 1 2 ) m i c r o p l a t er e a d e r5 5 0 型酶标仪( 美国b i o r a d 公司) 。 ( 1 3 ) 颗粒制冰机( 日本s a n y o 公司) 。 1 第一章材料和方法 ( 1 4 ) 普通台式离心机t g l - 1 6 c 型、恒温水浴锅、微波炉、超净工作台、 s h 7 _ c 恒温振荡培养箱和照相装置等均为国产仪器。 ( 1 5 ) 倒置显微镜( o l y m p u s 公司) 。 1 1 2 主要试剂和耗材 ( 1 ) 质粒、菌株和包装细胞系：携带g f p 报告基因的腺病毒穿梭质粒 p a d t r a c k c m v ，e 1 区和e 3 区缺失的复制缺陷5 型腺病毒骨架质粒p a d e a s y 1 ， 大肠杆菌b j 5 1 8 3 和d h l 0 b 以及人胚肾2 9 3 细胞均由中国疾病控制中心性病艾滋 病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。e b v 阳性b 9 5 8 细胞、e b v 阳性c n e 细胞系 日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。 ( 2 ) 限制性核酸内切酶p a ci 及p m ei 购自n e we n g l a n db i o l a b s 公司。 ( 3 ) d n a m a r k e r 、d a t p 、限制性内切酶e c o r v 和b g l i i ，t 4d n a l i g a s e 及p m d l 8 tv e c t o r 购自宝生物工程( 大连) 有限公司。p f ud n ap o l y m e r a s e 为 北京全式金生物技术有限公司。 ( 4 ) x g a l 、i p t g 、碱性磷酸酶为p r o m e g a 公司产品。质粒提取试剂盒为 北京天根生物技术有限公司产品。 ( 5 ) d n a 转染试剂盒l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 购自i n v i t r o g e n 公司。 ( 6 ) 逆转录试剂盒( 美 p r o m e g a 公司) 。 ( 7 ) q i a q u i c kp c rp u r i f i c a t i o nk i t 购自德国q i a g e n 公司。 ( 8 ) d h a n k s 粉剂系h y c l o n e 公司产品。 ( 9 ) r p m i1 6 4 0 和d m e m 培养液、t r l z o l 、胎牛血清购自美国g i b c o 公司。 ( 1 0 ) 蛋白酶k 购自德国m e r c k 公司，胰蛋白酶购自美i 垂l s i g m a 公司。 ( 1 1 ) t a qd n a 聚合酶、d n t p 、m g c l 2 、1 0 x b u f f e r 等p c r 反应试剂、琼脂 糖( 大连宝生物工程有限公司) 。 ( 1 2 ) p c r 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 ( 1 3 ) 1 5 m le p p e n d o r 借，0 5 m le p p e n d o 艚，1 0 a l 、2 0 0 p l 、1 o m l 吸头等 一次性实验材料( 上海生工生物工程技术服务有限公司) 。 ( 1 4 ) 电泳缓冲体系t r i s ，e d t a 、硼酸、丙烯酰胺、甲酰胺、过硫酸胺、 s d s ，亚甲基双丙烯酰胺、溴酚蓝均为美国p r o m e g a 公司产品。 ( 1 5 ) 饱和酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇、氢氧化钠、甲醛、磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠和枸橼酸钠均为国产试剂。 ( 1 6 ) p v d f 膜( a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司) 。 ( 1 7 ) k o d a ks c i e n t i f i ci m a g i n gf i l m ( 美国k o d a k 公司) 。 ( 1 8 ) e c 啦测系统( a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司) 。 2 青岛大学硕二t 学位论文 ( 1 9 ) h h v - 4z e b r a ( v e 2 0 ，b z l f l 抗体) ( s a n t ac r u z 生物技术公司) 。 1 1 3 常用试剂配置 ( 1 ) t s s 液：7 0 m l 水中加入胰化蛋白胨( b a c t o - t r y p t o n ) l g ，酵母提取物 ( y e a s t e x t r a c t ) 0 5 9 ，n a c l0 5 9 ，聚乙二醇( p e g 4 0 0 0 ) l o g ，二甲基亚砜( d m s o ) 5 m l ，1 mm g c l 25 m l ，调至p h 6 5 ，加水至1 0 0 m l ，0 2 2 # m 滤器过滤，一2 0 保存。 ( 2 ) l b 培养基：1 0 9 l n a c i ，1 0 9 l 蛋白胨，5 9 l 酵母提取物，1 5 9 l 琼脂( 用 于铺平板) ，用n a o h ( 2 m o l l ) 调p h 至7 o ，高压灭菌。 ( 3 ) 1 t o o l i 腐萄糖溶液：1 8 9 葡萄糖溶于足够无菌双蒸水中，再用无菌双蒸水 补足至l j l 0 0 m l ，然后用0 2 躯m 的滤膜过滤除菌。 ( 4 ) s o c 培养基：蛋白胨2 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l0 5 9 ，l m o l l 氯化钾2 5 m l ， 溶解并加水定容至1 l ，分成1 0 0 m l 的小份，高压灭菌。培养基冷却至室温后，再在 每1 0 0 m l 的小份中加入l m l 灭过菌的l m o l l 氯化镁和2 m l 灭菌的l m o l l 的葡萄糖溶 液。 ( 5 ) 氨苄青霉素：用纯水配铝1 5 0 m g m l 贮存液，过滤除菌，- - 2 0 保存备用， 使用浓度1 0 0 p g m l 。卡那霉素：用纯水配$ 1 5 0 m g m l 贮存液，过滤除菌，一2 0 保 存备用，使用浓度3 5 t g m l 。链霉素：用纯水配隹j l j 5 0 m g m l 贮存液，过滤除菌，一2 0 保存备用，使用浓度3 5 比g m l 。 ( 6 ) t r i s 甘氨酸缓冲液：2 5 m m o l l t r i sb a s e ，2 5 0 m m o l l - e 氨酸，0 1 s d s 。 ( 7 ) 1 0 x p b s 缓冲液：1 4 4 9n a 2 h p 0 4 ，8 9n a c i ，o 2 9k c l ，0 2 4 9k h 2 p 0 4 溶于 8 0 0 m l d d h 2 0 中，用h c i i 周p h 值至7 4 ，定容至l jl l ，1 0 3 4 x 1 0 5 p a 灭菌2 0 m i n 。 ( 8 ) 细胞裂解液：1 s d s ，2 0 m mt r i s h c ip h 7 0 ，l m mp m s f 和1 3 - 巯基乙 醇。 ( 9 ) 3 0 丙烯酰胺：丙烯酰胺2 9 9 ，亚甲基双丙烯酰胺1 9 ，溶于6 0 m l 水中，加 水定容至1 0 0 m l ( p h = 7 o ) ，0 4 跏m 滤器过滤。 ( 1 0 ) l x s d s 凝胶加样缓冲液：5 0 m m o l l t r i s c l ( p h 6 8 ) ，1 0 0 m m o l ld t f ( i 伍 用前加) ，2 s d s ( 电泳级) ，0 1 溴酚蓝，1 0 甘油。 ( 1 1 ) 考马斯亮蓝染色液：9 0 m l 甲醇：水( 1 ：1 ，v ) 和1 0 m l 冰乙酸的混合 液中溶解0 2 5 9 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，过滤后使用。 ( 1 2 ) s d s p a g e 脱色液：3 0 甲醇，1 0 乙酸。 ( 1 3 ) 电转移缓冲液：2 5 m m o l l t r i s ，1 9 2 m m o l l 甘氨酸，0 1 s d s ( w ) ， 2 0 甲醇( v ) ，p h 8 3 。 1 2 目的基因的制备 3 第一章材料和方法 4 青岛大学硕士学位论文 l i n k e r ( g l y 4 s e r ) 3 为编码1 5 个氨基酸组成的疏水性多肽的d n a 序列，序列为： 5 g g t g g c g g t g g a a g c g g c g g t g g c g g a a g c g g c g g t g g c g g c a g c 3 。 g m c s f 上游引物p 1 序列为：5 g a a g a t c t a t g c t g c t c i t g g g c a c t g t - 3 。 下游重叠引物p 2 序列为： 5 鱼鳗q 盥螋q g ! 墅鳗巡鳗幽! i 要巡q q 巡堡c t c c t g g a c t g g c t c c c a 3 。 b z l f l 上游重叠引物p 3 序列为： 5 - 鱼鱼殴鱼q 鱼哑q 巡鱼q 鱼幽鱼鱼鱼鱼鱼鱼鳗鱼! 鳗鳗鱼鲍 g a c c c aa a c l f g a c t r c t g 3 。 下游引物p 4 序列为：5 - g c g a t a t c i t a g a a a t i t a a g a g a t c c t c g t g - 3 - 。 设计g m c s f 下游引物p 5 序列为：5 - g c g a t a t ct c a c t c c t g g a c t g g c t c - 3 。 b z l f1 上游引物p 6 序列为：5 - g c a g a t c t a t g a t g g a c c c a a a c t c g a c - 3 。 分别扩增g m c s f 和b z l f l 基因序列，用于构建g m c s f 重组腺病毒载体和 b z l f l 重组腺病毒载体，作为融合基因b z g m 的对照。上述序列下划线部分为 l i n k e r ，斜体部分为酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 ( p a g e 纯化) ，扩增产物g m c s f 长为4 7 0 b p ，b z l f l 长为7 8 5 b p ，融合基因长为 1 2 1 0 b p ( g m c s f 和b z l f l 均携带互补的4 5 b p 的l i n k e r ，因此融合基因的大小为 4 7 0 b p + 7 8 5 b p - - 4 5 b p ) 。 1 2 4 反转录p c r ( r t _ p c r )采用逆转录试剂盒要求的标准条件进行r n a 逆转录。反应体积为2 0 # l ，反应体系包括：m g c l 2 5 m m o l l ( 私1 ) ，1 0 x 逆转录缓冲 液和l ，d n t pl m m o l l ( 犁1 ) ，a m v 逆转录酶1 5 u ( o 6 比1 ) ，核酸酶抑制剂o 5 u ( 0 耻1 ) ， o l i g o ( d t ) 1 5 引物0 耻g ( 珈1 ) ，模板r n a1 g ( 靴1 ) ，加无r n a s e 水至终体积2 0 l 。4 2 反应l h ，9 9 。c5 m i n ，然后快速冷却至4 0 c ，以灭活逆转录酶，并防止逆转 录酶与c d n a 结合，逆转录得到的c d n a 用作p c r 反应模板。p c r 反应体系见 表1 。 反应条件为：9 4 预变性5 m i n ；然后9 4 6 0 s ，5 5 6 0 s ，7 2 9 0 s ，扩增3 5 个循环；最后7 2 延伸1 0 m i n 。分别进行g m c s f 和b z l f l 基因p c r 扩增，p c r 扩增产物于含溴化乙锭( o 5 , u g m 1 ) 的1 2 琼脂糖凝胶中电泳1 h ，紫外透射仪下观 察电泳结果。 5 ； - 【 l l l l l i l ： i ，r ，p l l r l i l ， f l 第一章材料和方法 1 2 5i m p c r 扩增产物的纯化按, 照q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒说明书进行操 作，步骤如下： ( 1 ) 1 2 琼脂糖电泳分离目的片段，长波紫外灯下观察并从凝胶切取目的片 段。 ( 2 ) 按胶重：p e 缓冲液1 ：3 的比例加入p e 缓冲液，6 0 c 水浴融化凝胶，然后 加入纯化柱中。 ( 3 ) 将纯化柱置于2 m l 收集管上，1 30 0 0 r m i n 离心3 0 6 0 s 。 ( 4 ) 弃去收集管中液体，于纯化柱中加入0 7 5 m lp e 缓冲液，置于收集管上， 以1 30 0 0 r m i n 离, g , 3 0 - - 一6 0 s 。 ( 5 ) 弃去收集管中液体，将纯化柱1 30 0 0 r m i n 继续离, l 二q m i n 。 ( 6 ) 将纯化柱置一新收集管上，在纯化柱中央加入5 似le b 缓冲液，静置l m i n 。 ( 7 ) 1 30 0 0 r m i n 离，i 二, l m i n ，洗脱d n a 片段( 离心管内即为纯化的d n a 片段) ， - - 2 0 保存备用。 1 2 6 制备转化用感受态大肠杆菌本实验采用经典c a c l 2 法制备感受态细 胞。 l 从一7 0 冰箱中取出冻存的d h l o b 菌，接种至l b 平板培养基，3 7 。c 培养1 6 2 0 h 形成劐 睑菌型 土 眺取单个菌落接种至3m l 的l b 液体培养基中，3 7 。c 摇床上剧烈振荡1 6 叫 6 青岛大学硕士学位论文 1 2 7 1t a 克隆分别将纯化的g m c s f 和b z l f lp c r 扩增产物插入高效克隆 载体p m d l 8 t ，转化入e c o i ld h l 0 b 感受态细菌，进行t a 克隆( 按照试剂盒说明 书进行操作) ，在含有x g a l 和i p t g 的氨苄青霉素l b ( a l b ) 平板上进行蓝白斑选 择。 1 2 7 2t a 克隆的鉴定挑取单个白色菌落，接种入1 5 m la l b 液体培养基，采 用高纯度质粒小提中量试剂盒( t l 蝌g e n 公司) 提取质粒d n a 。步骤如下： ( 1 ) 柱平衡步骤：向吸附柱c p 4 中加入5 0 0 d 的平衡液b l ，1 20 0 0r m i n 离 心l m i n ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 ( 2 ) 取1 5 m l 过夜培养的菌液加入离心管中，1 20 0 0r m i n 离心l m i n ，尽量吸 除上清。 ( 3 ) 向留有菌体沉淀的离心管中加入5 0 ( 0 1 溶液p 1 ，使用漩涡振荡器彻底悬 浮细菌细胞沉淀。 ( 4 ) 向离心管中加入5 0 ( 0 1 溶液p 2 ，温和地上下翻转6 - 一8 次使菌体充分裂解。 ( 5 ) 向离心管中加入7 0 0 t l 溶液p 3 ，立即温和地上下翻转6 - - 一8 次，充分混匀， 此时会出现白色絮状沉淀。1 20 0 0r m i n 离心1 0 m i n ，此时在离心管底部形成沉淀。 7 巫 匝 亘 2 1一亡匕 i 第一章材料和方法 ( 6 ) 将上一步收集的上清液分次加入过滤柱c s ，1 20 0 0r m i n 离心2 m i n ，小 心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱c p 4 ，1 20 0 0r m i n 离心l m i n ， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱c p 4 放入收集管中。 ( 7 ) 向吸附柱c p 4 中加入5 0 0 d 去蛋白液p d ，1 20 0 0r m i n 离心l m i n ，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱c p 4 放入收集管中。 ( 8 ) 向吸附柱c p 4 中加入7 0 0 t l 漂洗液p w ，室温静置5 r a i n 后1 20 0 0 r m i n 离心l m i n ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c p 4 放入收集管中。 ( 9 ) 向吸附柱c p 4 中加入5 0 ( 0 1 漂沈液p w ，1 20 0 0r r a i n 离心l m i n ，倒掉收 集管中的废液。将吸附柱c p 4 重新放回收集管中置于1 20 0 0r m i n 离心2 m i n ，目的 是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 ( 1 0 ) 将吸附柱c p 4 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 1 0 0 3 0 吮l 洗脱缓冲液t b ，室温放置2 m i n 后1 20 0 0r m i n 离心l m i n ，将质粒溶 液收集到离心管中。 以提取的质粒d n a 为模板进行p c r 扩增鉴定，p c r 体系如表1 所示，扩增产 物于含有溴化乙锭( 0 5) 的1 2 琼脂糖凝胶中电泳 ，紫外透射仪下观, u g m l 5 0 m i n 察电泳结果。 1 2 7 3 序列测定将t a g m c s f 和t a b z l f l 阳性克隆送往北京华大基因研究 中心进行d n a 序列测定，测序结果与g e n e b a n k 中g m c s f 和e b v 标准株编码基 因序列进行比对。 1 3 构建g m c s f 和b z l f l 融合基合b z g m 1 3 1 纯化的g m c s f 和b z l f lc d n a在编码( g l y 4 s e r ) 3 多肽的d n a 片段连接下，根据重叠延伸( o v e r l a p p i n ge x t e n s i o n ) 原理进行基因重组。以 t a g m c s f 和t a - b z l f ld n a 阳性克隆为模板进行p c r 扩增，扩增g m c s f 基因 的上下游引物为p 1 和p 2 ；扩增b z l f l 基因的上下游引物为p 3 和p 4 ，于是分别获 得携带l i n k e r 互补序列的g m c s f 和b z l f ld n a 片段。反应体系同表1 。将 g m c s f 和b z l f lp c r 产物行0 8 琼脂糖凝胶电泳，回收纯化后作为模板，以p 1 和p 4 为上下游引物进行重叠延伸p c r 反应，获得g m c s f 和b z l f l 的融合基因 片段，命名为b z g m 基因( 图1 ) 。p c r 反应体系见表2 。由于该反应由高保真t a q e 催化，为了使融合基因b z g m 与p m d l 8 t 载体顺利连接，需在p c r 产物3 端加 一个a 尾，具体操作如下。 8 青岛大学硕士学位论文 上 = p 3 - _ _ _ 一p 4 p ip 4 i 啊 i 。d 一 图1 重叠延伸p c r 获得b z g m 融合片段 表2 融合基因扩增p c r 反应体系 反应条件为：9 4 预变性2m i n ；然后9 4 3 0s ，6 0 3 0s ，7 2 2m i n ，扩 增3 0 个循环；7 2 延伸7m i n 。在延伸结束后，拿出p c r 产物冷却至室温后加入 t a qe 0 4g l ，d a t p ( 1 0 0m m ) 1 1 d ，放入p c r 仪中继续7 2 延伸3 0m i n 。终产物 于含溴化乙锭( o 5t t g m 1 ) 的o 8 琼脂糖凝胶中电泳中8 0 v 电泳1 h ，紫外透射仪 下观察电泳结果。将加a 后的融合基因产物琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，用 q i a g e n 纯化试剂盒将其纯化。 1 3 2 融合基因的序列测定 9 蕊 第一章材料和方法 1 3 2 1t a 克隆将上述纯化产物插入高效克隆载体p m d l 8 t ，转化自制感受态 细胞e c o l id h l 0 b ，进行t a 克隆( 按照试剂盒说明书进行操作) ，在含有) 【g a l 和 i p t g 的氨苄青霉素l b ( m 卫) 平板上进行蓝白斑选择。 1 3 2 2t a 克隆的鉴定挑取单个白色菌落，用1 2 7 2 中提到的高纯度质粒小 提中量试剂盒( t i a n g e n 公司) 提取质粒d n a 。以质粒d n a 为模板，反应体系 参照表2 进行p c r 扩增，扩增产物于含溴化乙锭( o 5 g m 1 ) 的0 8 琼脂糖凝胶 中电泳中8 0 v 电泳1 h ，紫外透射仪下观察电泳结果。 1 3 2 3 序列测定将t a b z g m 阳性克隆送往北京华大基因研究中心进行d n a 序列测定，测序结果与g c n c b a n k 中g m c s f 和e b v 标准株编码基因序列进行比 对。 1 4 腺病毒穿梭载体p a d t r a c k - c m v - b z g m 的构建 融合基因经测序确证序列正确无误后，用限制性内切酶b g li i 和e c o r v 双酶切 分别消化t a b z g m 质粒以及穿梭载体p a d t r a c k c m v ( 质粒p a d t r a c k c m v 含有 c m v 启动子、g f p 报告基因、卡那霉素k a n 抗性标志、p a ci 酶切位点、p m ei 酶切 位点) ，将目的基因定向亚克隆到穿梭质粒上，l x t s s 法转化e c o l id h l 0 b 菌株， 利用含卡那霉素的培养基筛选重组p a d t r a c k c m v b z g m 质粒，具体步骤如下。 1 4 1 融合基因及载体p a d t r a c k - c m v 双酶切和回收纯化的重叠延伸 p c r 产物及载体p a d t r a c k c m v 分别同时用限制性核酸内切酶a g li i 和e e o r v 双酶 切消化，反应体系见表3 。将表3 中的各种试剂加至0 5 m l 离心管中混匀，3 7 水浴5 h 。 用0 8 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，待d n a 完全消化后( 电泳显示单一条带) ， 用上述1 2 5 方法回收纯化酶切产物。 表3 双酶切反应体系 试剂试剂量 d n a 样品 1 0 x hb u f f h e c o r v w i i 无菌d d h 2 0 2 0 p g 2 0 p l 1 0 ，1 1 ( 1 5 u d ) 1 0 m 1 ( 1 0 u d ) 补虿2 蛳l 1 4 2 融合基因与载体连接将酶切后的融合基因和载体按1 ：1 、1 ：3 、3 ：1 的摩尔比混合，用t 4d n a l i g a s e j 挫行连接反应，反应体系见表4 ( 以3 ：1 摩尔比为 1 0 青岛大学硕上学位论文 例，具体操作步骤参见文献f 9 1 ) 。将表4 中各种试剂加至0 5 m l 离心管中混匀，1 6 ( 2 过 夜反应。 表4 连接反应体系 试剂试剂量 p a d t r a e k c m v 融合基因 t 4d n al i g a s e t 41 0 b u f f e r 无菌d d h 2 0 1 q u l 0 抛 1 0 p l ( 3 5 0 u a 1 ) 1 o ”1 补至1 蛳l 1 4 3 重组质粒的转化 将上述连接产物( 重组质粒) 转化自制的e c o l id h l 0 b 感受态细菌，在卡那霉 素( 浓度3 5 9 9 m 1 ) l b 平板上培养1 8 2 4 h 后，观察菌落生长情况，同时设立空质 粒转化对照和阴性对照( e c o l id h l 0 b ) 。b z g m 融合基因重组质粒构建流程见图2 。 第一章材科和方法 l 1 1 2 1 口1 匕：3 | c 计 珏了1 l 图2p a d - t r a c k c m v - b z g m 的构建示意图 连接产物的具体转化步骤如下： ( 1 ) 取1 0 0 夥1 冰浴上融化的感受态细菌，加入l o # l 连接产物，轻轻混匀，在冰 浴中放置3 0 m i n 。 ( 2 ) 4 2 。c 水浴热激9 0 s ，然后快速将管转移到冰浴2 m i n ，该过程不要摇动离 心管。 ( 3 ) 向每个离心管中加入5 0 0 t l 无菌的s o c 培养基，混匀后置于3 7 。c ，2 0 0 r m i n 培养1