（中药学专业论文）复方米槁抭病毒软胶囊的提取纯化工艺研究.pdf

本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者： 旮矜论 日期：刀f 口年矿月纠日 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 作者签名j 獬新签名： r 期：弘fo 年期形同 a b s t r a c t 3 前言6 第一章绪论7 l 处方药材的主要化学成分及药理作用7 2 主要研究内容9 3 工艺路线图9 第二章含测方法的建立；1 l 1 仪器与试药l l 2 方法与结果1 1 2 1 提取液中绿原酸含量测定方法的建立1 1 2 2 提取液中甘草酸含量测定方法的建立1 5 3 小结与讨论1 9 第三章提取工艺研究：2 0 1 仪器与试药2 0 2 方法与结果2 0 2 1 指标成分的选择2 0 2 2 药材吸水率测定2 0 2 3 单独与合并提取方法选择2 l 2 4 煎煮时间对绿原酸含量的影响2 1 2 5 正交优选提取工艺2 2 2 6 浓缩方式考察2 5 3 小结2 6 第四章提取液分离纯化工艺研究2 7 1 分离纯化办法的选择2 7 2 醇沉工艺研究2 7 2 1 仪器与试药2 7 2 2 方法与结果2 8 3 大孔吸附树脂精制纯化工艺研究3 0 3 1 仪器与试药3 0 3 2 大孔吸附树脂预处理3 0 3 3 大孔树脂型号筛选3 l 3 4 药液上柱吸附参数优选3 3 3 5 树脂沈脱工艺参数优选3 8 3 6 树脂最佳纯化工艺验证试验4 l 3 7 树脂的再生方法4 2 3 8h p d 3 0 0 大孔吸附树脂纯化提取液工艺参数4 2 3 9 浓缩干燥方法4 3 4 小结4 3 5 讨论4 3 总结与展望4 5 1 总结4 5 1 1 指标成分的含量测定方法的建立4 5 1 2 提取工艺研究4 5 1 3 醇沉工艺研究4 5 1 l 大孔树脂纯化7 - 艺研究4 5 2 存在的问题4 5 3 研究特色与创新点4 6 4 展望4 6 参考文献4 8 附录一文献综述5 0 附录二h p l c 图谱5 8 附录三加样回收率报告简表9 7 致谢9 8 个人简介：9 9 中文摘要 复方米槁抗病毒软胶囊源自民间验方，是由米槁、山银花、甘草、m t 组成， 具有清热解毒之功效，主要用于病毒性感冒。本文在民问验方的基础上对处方、 工艺进行研究，优选处方及提取纯化工艺，制得工艺合理可行、质量稳定可控的 中间体，为软胶囊的研制奠定基础。 评价指标确定：建立了提取液中指标性成分绿原酸和甘草酸的含量测定分析 方法。方法学考察结果表明，分析方法准确、稳定。 提取工艺优选：以银花、甘草、m t 三味药材中主要有效成分含量为指标， 考察了单煎与合煎方式对各指标性成分提取率的影响，结果表明绿原酸在合提时 含量要高于单提，甘草酸提取率无明显变化，因此本试验采用三药合煎方式进行 提取；针对绿原酸的不稳定性，以绿原酸为指标，对银花的煎煮时i 可和加入方式 进行考察，结果，在首次煎煮的最后0 5 h 加入银花；以绿原酸、甘草酸的提取 率及干膏率为测评指标，采用正交设计，对提取时间、提取次数、加水量三个主 要影向因素进行考察，每个因素3 水平，数据采用综合评分法评价，结果最佳提 取工艺为：1 0 倍量水，煎煮3 次，每次2 h ，金银花在首次煎煮1 5 h 后加入。 纯化工艺优选：( 1 ) 通过预实验对提取工艺中所得提取液进行醇沉工艺及大 孔吸附树脂纯化的比较研究，确定纯化工艺路线为：提取液醇沉除杂回 收乙醇大孔吸附树脂精制。( 2 ) 醇沉除杂工艺进行参数优选。以绿原酸、甘 草舷的转移；簪及_ ：肯牢为测评指标，采1 】一交设计，以提取液的相对密度、乙珂窒 浓度、醇沉时i 、j 为考察因素，每因素3 水平，数据采用综合评分法进行评价，结 果敲佳醉沉工艺为药液相对密度为1 0 8 ( 0 5g m l 。叫) ，加9 5 乙酣使禽嘎乒跫达 7 0 ，放置1 2 h 。( 3 ) 大孔吸附树脂精制工艺参数优选。以甘草酸、绿原酸的比 吸附量及解吸附率为测评指标，通过静念吸附和解吸附实验，筛选较优的大孔吸 附树脂型号，结果确定以h p d 3 0 0 型号大孔树脂对提取液进行精制。进行动态吸 附参数优化。以绿原酸、甘草酸的转移率为测评指标，通过树脂动念吸附、沈脱， 对影响动态吸附的因素吸附流速、径高比、上样药液浓度进行堆因素考察， 绘制甘草酸、绿原酸的吸附泄露曲线考察上样泄漏点，结果最佳吸附参数为上样 药液浓度0 2 5 m g m l l ( 生药浓度) ，上样量为5 0 m l ，吸附流速为2 b v h ，径 i 贵i 钉巾仄学院坝l j 学化论文 高比为l ：8 。进行动态沈脱参数的优化。以沈脱液中甘草酸、绿原酸浓度及干 膏率为测评指标，对水沈用量、沈脱剂浓度、沈脱流速、沈脱剂用量进行了单因 素考察，绘制甘草酸、绿原酸的沈脱曲线，确定沈脱终点，结果最优沈脱参数为 水沈用量为1 b v ，沈脱剂浓度为7 0 乙醇，沈脱剂用量为2 5 b v ，沈脱流速为 2 b v h 。 关键词：甘草酸，绿原酸，醇沉工艺，大孔吸附树脂，提取，纯化 q i n g r e ji e d u ，w a sm a i n l yu s e df o rv i r a li n f l u e n z a o nt h eb a s iso ff o l k p r e s c r i p t i o nt h ep r e s c r i p t i o na n dt h ef o r m u l a t i o np r o c e s sw a si m p r o v e d a n dt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o np r o c e s sp a r a m e t e r sw a so p t i m i z e d ，a n d f i n a l l yg o tt h ei n t e r m e d i a t e sw h o s ef o r m u l a t i o np r o c e s si sa v a i l a b l ea n d w h o s eq u a l i t yi s s t a b l e p i c ku pt h ee v a l u a ti o ni n d e x e s ：t h e i p l cm e t h o dw a se m p l o y e di nt h is p a p e rt od e t e r m i n et h ec o n t e n to fc h l o r o g e n i ca c i da n dg l y c y r r h i z i ca c i d i nt h ee x t r a c t am e t h o d o l o g i c a ls u r v e yr e s u l t ss h o wt h a tt h ea n a l y t i c a l m e t h o di sa c c u r a t ea n ds t a b l e t oo p t i m i z ee x t r a c t i o np r o c e s s ，t h em a i na c t i v ec o m p o n e n t so ft h e t h r e eh e r b sa si n d i c a t o r sw a sc h o s e nt oi n v e s t i g a t et h ei m p a c to f s e p a r a t e dd e c o c t i o na n dm i x e dd e c o c t i o no nt h ec o n t e n to fi n d e xc o m p o n e n t t h er e s u lt ss h o w e dt h a tc h l o r o g e n i ca c i dc o n t e n ti nm i x e d d e c o c ti o ni s h i g h e rt h a nt h a ti ns e p a r a t e dd e c o c t i o n ，g l y c y r r h i z i ca c i de x t r a c ti o n w a sn os i g n i i c a n tc h a n g e t h e r e f o r e ，t h r e eh e r b sw e r ee x t r a c t e dt o t a l l y i nt h i se x p e r i m e n t s e c o n d ，b e c a u s eo ft h ei n s t a b i l i t yo fc h l o r o g e n i ca c i d t h i se x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt oi n v e s t e g a t et h ed e c o c t i o nt i m ea n dt h e j o i n e dw a y a sar e s u l t ，a tt h el a s t0 5 ho ft h ef i r s tb o i l i n gj o i nf l o s l o n i c e r a e t h ew a t e r e x t r a c t i n gp r o c e s s e so ft h et h r e eh e r b sw e r es t u d i e d b yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n tw it h t h ec o n t e n to fe f f e c ti v ec o m p o n e n t sa n d s o li d - e x t r a c tp e r c e n ta si n d e x e x t r a c t i n gt i m e ，e x t r a c t i n gt i m e sa n d w a t e ra m o u n tw e r ec h o s e na sf a c t o r s ，a n dt h r e el e v e l sw e r es e l e c t e df o r e v e r yf a c t o rt oo p t i m i z et h ep r o c e s s e s t h eu l t i m a t ee x t r a c t i n gp r o c e s s e s 贵m 中医学院倾l j 学位论义 w e r ed e t e r m i n e da sf o ll o w s ：t h r e eh e r b sw e r ee x t r a c t e dw i t hl o - f o l dw a t e r f o r2 o hb yd e c o c t i o n ，a n dr e p e a t e df o r3t i m e s a n dj o i nt h ef l o s l o n i c e r a ea tt h el a s t0 5 ho ft h ef i r s tb o il i n g p u r i f i c a t i o np r o c e d u r ep a r a m e t e ro p t i m i z a t i o n ：( 1 ) i nt h ep r e e x t r a c t i o ne x p e r i m e n t sa l c o h o lp r e c i p i t a t i o na n dm a c r o p o r o u sr e s i n p u r l f i c a t i o nm e t h o dw e r ee m p l o y e dt or e f i n et h ew a t e re x t r a c t s f i n n a l y d e t e r m i n et h ep u r i f i c a t i o np r o c e s sr o u t e ：e x t r a c t a l c o h o lp r e c i p i t a t i o n t or e m o v ei m p u r it y r e c o v e r yo f 。e t h a n o l m a c r o p o r o u sr e s i nr e i l i n i n g ( 2 ) o p t i m i z ep a r a m e t e ro f a l c o h o l p r e c i p i t a t i o np r o c e s s t h e a l c o h o l p r e c i p i t a t i o np r o c e s s e so i e x t r a c tw e r es t u d i e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t w i t ht h ec o n t e n to fe f t e c t i v ec o m p o n e n t sa n ds o l i d e x t r a c tp e r c e n ta s i n d e x t h ee x t r a c tr e l a t i v ed e n s i t y ，e t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n dt i m ef o r a l c o h o lp r e c i p i t a t i o nw e r ec h o s e na sf a c t o r s ，a n dt h r e el e v e l sw e r e s e le c t e df o re v e r yf a c t o rt oo p ti m iz et h ep r o c e s s e s t h eo p ti m u ma l c o h o l p r e c i p i t a t i o np r o c e s s e sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：t h el i q u i dr e l a t i v e d e n s i t yi s1 0 8 ( 0 5g m l 叫) ，u s e9 5 e t h a n o lt om a k ea l c o h o l c o n c e n t r a t i o nb e7 0 ，w h i l ep l a c et h e1i q u i df o r1 2 hb yi o 。c ( 3 ) o p t i m i z e p a r a m e t e ro fm a c r o p o r o u sr e s i nr e f i n i n gp r o c e s s s t a t i ca d s o r p t i o na n d d e s o r p t i o ne x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e dw i t ht h ea d s o r p t i o nc a p a c i t ya n d d e s o r p t i o nr a t eo fe f f e c t i v ec o m p o n e n t s a sm e a s u r e m e n ti n d i c a t o r st o f i l t e rm a c r o p o r o u sr e s i nm o d e l t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a th p d 3 0 0 m a c r o p o r o u s r e s i nw a ss u i t a b l ef o r r e f i n i n g e x t r a c t t h e d y n a m i c a d s o r p t i o np a r a m e t e ro p t i m i z a t i o n t h r o u g ht h er e s i nd y n a m i ca d s o r p t i o n a n de l u ti o ns i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，t h ef a c t o r st h a ta f f e c tt h ed y n a m i c a d s o r p t i o n a d s o r p t i o nv e l o c i t y ，d i a m e t e rh i g hr a t i o ，t h ec o n c e n t r a t i o n o ft h es a m p l el i q u i dw e r ei n v e s t i g a t e dw i t he f f e c t i v ec o m p o n e n t st r a n s f e r r a t ea st h em e a s u r e m e n to fi n d i c a t e r s t h e nt h es t u d yb yd r a w i n g g l y c y r r h i z i ca c i da n dc h l o r o g e n i ca c i dt h ea d s o r p t i o nl e a k a g ec u r v e s d e t e r m i n e dt h el e a kp o i n t ，t h eb e s tp u r i f y i n gc o n d i t i o nw e r ea sf o l l o w s ： 4 贵| ；几中医学院坝i j 学位论文 t h eb e s tc o n c e n t r a ti o no fs a m p l es o l u ti o nw a s0 2 5 m g m l 叫( c r u d ed r u g c o n c e n t r a t i o n ) ，t h es a m p l ev o l u m ew a s5 0 m l ，a d s o r p t i o nf l o wr a t ew a s2 b v h a n dah i g hd i a m e t e rr a t i ow a s1 ：8 o p t i m i z ed y n a m i ce l u t i o np a r a m e t e r s s i n g l ef a c t o rs t u d yw i t ht h e c o n t e n to fe f f e c t i v ec o m p o n e n t sa n d s o l i d e x t r a c tp e r c e n ta si n d e xw a sc a r r i e do u ti no r d e rt oi n v e s t i g a t e t h ee f f e c to ft h ef a c t o r s w a t e ra m o u n to fw a s h i n g ，e l u t i o nc o n c e n t r a t i o n ， e l u t i o nf l o wr a t e ，e l u t i o na g e n to nd y n a m i ce l u t i o np r o c e s s ，w h i l em a p p e d t h eg l y c y r r h i z i ca c i da n dc h l o r o g e n i ca c i de l u t i o nc u r v et od e t e r m i n et h e e l u t i o ne n d t h er e s u l t so ft h eo p t i m a ld o s a g eo fe l u t i o np a r a m e t e r sw e r e t h a tw a s h e dw a t e rc o l u m nw a s1 b v ，e l u t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s7 0 e t h a n o l ， w a s h e da g e n tc o l u m nw a s2 5 b v ，e l u t i o nf l o wr a t ew a s2 b v h k e yw o r d s ：g l y c y r r h i z i ca c i d ， c h l o r o g e n i ca c i d ， a l c o h o lp r e c i p i t a t i o n p r o c e s s ，m a c r o p o r o u sr e s i n ，e x t r a c t i o n ，c l a r i f i c a t i o n 口i 饵1 中医学院坝i ：学位论文 1 l j l 刚吞 感冒足人类最常见的疾病之一，中医学称“伤风”，西医学足指由病毒引起 的上呼吸道感染，具有不同程度的全身症状及舁炎、咽炎、扁桃体炎等局部症状， 其症状可轻可重。其主要病原体为异病毒，其次为副流感病毒、腺病毒、埃及病 毒、柯萨奇病毒以及呼吸道合胞病毒，常易合并细菌感染。其中流行性感冒 传染性t 、f 簟插迅速、易发生流行，扒统计”1 ，全球静地每年约1 l o 的成年人 因感染而发病，且免疫力低下者如老年人易出现合并症而死亡，流感已严重威胁 公众健康。疫l 肖可预防流感，似其研究和生产总足慢r 病毒变异的速度；西药抗 流感病毒虽见效快、疗效高，但易产生耐药性并有一定的毒副作用。而中医药治 疗流感则体现了中医辨证施治、标本兼治的特色，在改善症状上和客观指标方面 都显示了一定的优势，有良好的发展前景。 抗流感病毒的单味中药大多为清热药，少数为补益类中药，对单味药及其有 效成分治疗作用机理的研究，已取得了一些进展。”，如对黄芩、鱼腥草、大青叶、 板蓝根、甘草、黄芪等进行了有效成分或有效部位的抗流感病毒实验研究。银翘 散、金欣口服液、柴莪退热栓、双黄连片、双花喷雾剂等各复方制剂以不同剂型 形式，通过抑制病毒增殖或促进干扰素形成或增强机体细胞免疫功能等多途径抑 制流感病毒n 1 。综上，中药单味药或复方抗流感病毒的药效是肯定的，同时也可 以看出抗病毒中药剂型己不再足传统汤剂，各种新剂型也应用于此类药物，大大 方便了患者服用。 随着科学技术的不断发展，超临界c 侥萃耿、大孑l 吸附树脂分离纯化、减压 浓缩等现代的提耿分离、浓缩技术越来越广泛的用于中药生产中，实现了中药材 的传统水煎到不同精制程度的浸膏制备的现代化，为制备新型中药制剂奠定了基 础，各种高效精密的分析仪器和分析方法也为中药制剂的制备过程、质检过程提 供了有利保障，为制备安全有效、质量稳定的各种新制剂创造了良好条件，改善 了传统汤剂服用剂量大、口感差、质量不可控等缺点。 本课题对复方米槁抗病毒软胶囊的提取纯化工艺进行研究，制得质量稳定的 中问体，旨在为开发出安全性高、疗效好、质量稳定的中药抗病毒新药提供实验 依据。 6 贵阿1 中医学院倾i j 学位论义 第一章绪论 复方米槁抗病毒软胶囊由大果木姜子、甘草、山银花、m t 组成，其中大果 木姜子和山银花的原药材即米槁和黄褐毛忍冬均为贵州地产药材，复方米槁抗病 毒软胶囊的研制，方面可满足流感患者的需求，为公众健康服务；另一方面， 又可结合西部大开发战略及退耕还林还草政策，带动贵州中药材的种植和综合利 用，兴黔富民，得到广泛的社会效益和良好的经济效益。 1 处方药材的主要化学成分及药理作用 米槁( c i n n a m o m u mm i g a oh w l i ) 为樟科植物，入药部位为干燥果实，药 材名为大果木姜子。具散寒去湿、行气止痛之功。在我省民间药用历史悠久，对 上乎吸道疾病、咳喘、腹痛有良好的治疗作用。 米槁中主要含挥发油。大果木姜子精油中主要成分是1 ，8 一桉叶素、香桧烯、 柠檬烯和q 一松油醇等；脂肪油中含癸酸和月桂酸；此外，还含有z n 、c u 、f e 、 c a 、m g 、c o 等微量元素瞄1 。 现代药理研究表明哺”，大果木姜子油可抗实验性心率失常，可抗流感病毒， 以大果木姜子油为主药的大龙合剂对感染流感病毒甲型的小鼠及肺适应株( p r 8 ) 有明显保护作用，能提高小鼠外周血白细胞数和t 细胞数目，提示本品可能通过 增强机体免疫力达到抗病毒作用。 大果小篓了抗流感病前的有效部位为挥发 i f i ，制刹成型【f l 以成品精油形式加 入，本课题不在对其提取工艺进行研究。 黄褐毛忍冬( l o n i c e r af u j v o t o m c n t o s f lh s ue ts c c h e n g ) 为忍冬科植物， 入药部位为干燥花蕾或带初开的花。具清热解毒，凉散风热之功。用于痈肿疔疮， 喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等协1 。作为贵州银花药材的主流品 种之一，已被纳入2 0 1 0 版中国药典，列为山银花药材基源植物之一呻1 。 黄褐毛忍冬主要含有挥发油( 如芳樟醇、a 一松油醇、香叶醇等) 、有机酸类 ( 绿原酸、异绿原酸、咖啡酸等) 、黄酮类( 如木犀草素) 、皂苷类等盯1 ，与f 品 金银花基本相似。黄褐毛忍冬中的绿原酸、咖啡酸的含量均高于f 品会银花，且 挥发油中的芳樟醇、双花醇、香叶醇等有效成分的含量均不低于萨品金银花m 1 。 贵阳中医学院倾f ：学位论文 其中绿原酸的结构式如图卜1 。 h ： o h o 飞三： 图1 - 1 绿原酸结构式 药理作用研究表明，金银花具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、 抗氧化、免疫调节等作用。其中与抗病毒相关的实验研究表明阳m 1 ，金银花水提 液细胞外抗柯萨奇及埃柯病毒作用明显；对流感病毒、孤儿病毒、疱疹病毒增多 有抑制作用；有明显抗腺病毒作用。有效部位的体外抗病毒实验表明n 门，金银花 中的咖啡酰奎宁酸类对合胞病毒、副流感病毒p i v 3 有显著的抑制作用，同时绿原 酸对合胞病毒、柯萨奇病毒等具有明显抑制作用，因此本课题将绿原酸含量作为 测评指标之一对其进行评价。 甘草为豆科植物甘草g t v c ：v r r h i z au r a l e n s sf i s c h 、胀果甘草g 1 v c l v r r h z a i n t y a t eb a t 或光果甘草甜v c y y h i z ag l a b r al 入药部位为干燥根及根茎。性 平，味甘，能补脾益气，i l i 热解毒，止咳祛痰，调和诸药。甘草的主要化学成分为 三萜皂苷类( 如甘草酸、甘草次酸) 、黄酮类( 如甘草苷) 及多糖类。其三萜皂 苷类主要为甘草甜素，为甘草酸的钾、钙盐。 o h 图1 - 2 甘草酸结构式 甘草的药理作用研究主要集中在甘草酸、甘草次酸、甘草黄酮及甘草多糖。 甘草酸足甘草的最重要的有效成分，具有抗炎、抗病毒、调节免疫、抗肿瘤、保 肝等药理作用 1 2 o 与抗病毒相关的作用中，甘草酸能抑制很多不相关的d n a 、r n a 病毒的生长，且不影响正常细胞的活性，如可抗s a r s 病毒，除抑制病毒复制外， 还抑制病毒的吸附和穿透功能；可抗流感病毒a ：，主要是通过刺激t 细胞产生y 贵掰1 中仄学院硕i ：学位论义 干扰素实现的，体外实验没有显示任何影响a ：型流感病毒活性或复制的活性的 作用；体外抗病毒实验研究发现，甘草水提液对呼吸道合胞病毒( r s v ) 有明显 的抑制作用，而甘草酸则未见明显抑制作用，但不排除甘草酸可能通过体内作用 实现抑制病毒的作用n 3 4 】。甘草多糖n 司对腺病毒3 型( a d v i i i ) 导致细胞的c p e 有明显抑制作用，发挥直接杀伤作用。鉴于甘草酸的重要性，也将其作为测评指 标对制备工艺各环节进行评价。 因此，本试验中以绿原酸和甘草酸为指标成分，优选提取及除杂、精制工艺。 2 主要研究内容 本课题主要对复方米槁抗病毒软胶囊处方药材中的黄褐毛忍冬、甘草、m t 三味药材进行水提工艺研究，并对提取液进行除杂精制工艺研究。具体包括： ( 1 ) 提取液中指标成分的含量测定分析方法的建立 ( 2 ) 水提部分的提取工艺研究 ( 3 ) 提取液的醇沉工艺研究 ( 4 ) 醇沉后提取液的大孔吸附树脂精制工艺研究 3 工艺路线图 ( 1 3 倍，l o 倍，1 0 倍) 3 次，每次2 h ，滤过 减压浓缩 对密度为1 0 8 ( 2 0 。c ) 9 5 乙醇，使药液含醇量达7 0 冷藏1 2 h ，离心5 m i n ( 4 0 0 0 r m i n 叫) 上清液 i 减压浓缩，回收乙醇 i 使生药浓度为0 2 5 m g m l 。 药液 经h p d 3 0 0 型号大孔树脂进行吸附 上样药液与树脂柱体积比为l ：1 ，吸附流速2 b v h 一 径高比l ：8 ，吸附温度5 0 9 l l 贵m 中仄学院f i ! ；! i j 学位论文 吸附饱和的树脂柱 i 先用1 b v 水沈，沈脱流速2 b v h 叫 l 继刚2 5 b v 7 0 乙醇沈脱，收集醇沈脱液 沈脱液 l5 5 减压回收乙醇， j r 浓缩至相对密度为1 1 左右( 2 0 ) 浓缩液中间体 j r5 0 。c 真一i 微波f i 燥，粉碎 叶ii i j j 体 1 0 戎l ；兀中医学院帧l j 学位论文 第二章含测方法的建立 绿原酸是金银花的抗菌抗病毒的有效成分之一，相比其它已有测定方法的有 效成分如木犀草素、咖啡酸而言，含量较高，测定方法也较成熟，且足抗病毒的 有效成分；另外，甘草酸是甘草抗病毒的主要有效成分，也足研究的比较全面的 一种化学成分，因此，在本课题中选择绿原酸和甘草酸作为制备工艺的评价指标， 优选工艺参数。本章建立提取液中绿原酸、甘草酸含量测定方法，为后续提取、 纯化工艺研究提供依据。 1 仪器与试药 2 0 1 0 c h t 高效液相色谱仪( 同本岛津公司) ，u v - v i s 检测器，自动进样；a u y 2 2 0 型电子天平( 同本岛津公司) ；a e 2 4 0 型电子天平( 上海梅特勒仪器有限公司) ； 绿原酸对照品( 中国药品生物制品检定所，批号1 1 0 7 5 3 - - 2 0 0 4 1 3 ) ，甘草酸 对照品( 中国药品生物制品检定所，批号11 0 7 3 1 - 2 0 0 5 1 0 ) ，甘草购自甘肃武山 县医药公司( 据0 5 版中国药典一部甘草项下各要求进行检测，均符合规定) ； 黄褐毛忍冬购自飞龙阿绿色实业有限公司( 据0 3 版贵州省中药材、民族药材 质量标准项下各要求测定，均符合规定) ，m t 购自贵阳花果园药材市场，乙腈、 甲醇( 色谱纯，江苏汉邦科技有限公司，9 2 7 0 6 ) ，乙酸铵( 分析纯，天津市科密 欧化学试剂开发中心，批号2 0 0 4 0 2 0 8 ) ，冰乙酸( 分析纯，天津致远化学试剂) ， 磷酸( 分析纯，重庆川江化学试剂，批号2 0 0 7 0 1 1 7 ) 。 j 2 方法与结果 2 1 提取液中绿原酸含量测定方法的建立 2 1 1 色谱条件 色谱柱：a g i l e n th c - c 。( 4 6 m m 2 5 0 m m ，5i jm ) ；柱温：3 0 。c ；流速：l m l m i n 一； 流动相：乙j 青- o 2 磷酸水溶液( 1 3 ：8 7 ) ；检测波长：2 5 0 n m ：进样量：1 0 “l 2 1 2 各种溶液的制备方法 2 1 2 1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品2 0 5 2 m g ，置5 0 r a l 。棕色量瓶中，加色谱甲西宁溶解并 贵m 中医学院倾l j 学化论之 稀释定容仝刻度，摇匀，【! 阶j 绿原酸对_ ! ( 乩贮备液( 浓度为0 4 1 0 ，l i n g m l 。) 。 精密吸取陔贮备液1 i i i l ，置l o m l 棕色破瓶中，色谱甲醇稀释定容至刎皮，巳得 绿肠i 酸刈 ! f l i ! i 溶液( 浓度为0 0 4 1 ( ) 4 r a g m l l ) 。 2 1 2 2 混合提取液供试品溶液的制备 取金银花5 4 9 ，甘草3 6 9 ，m t 3 6 9 ，水煎3 次，每次2 h ，于首次后半小时加 入银花。滤过，合并滤液，定容至一定体积，精密吸取1 5 m l 提取液，置2 5 m l 棕色量瓶中，5 0 色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，o 4 5pi l l 微孔滤膜滤过，取 续滤液测定绿原酸含量。 2 1 2 3 阴性样品溶液的制备 除黄褐毛忍冬外，其余各药按处方比例称取，照2 1 2 2 项下制备阴性样品 溶液。同法测定，考察有无干扰。 2 1 3 专属性考察 将对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按2 1 1 项下色谱条件进行测 定。结果陀f 、f 1 l l i 溶液的包晰hn ：+ j 刈+ j ! ( 。i l | l l 和f t f “i ，j 色黹罔中一绿原胺的峰位胃 上兀色谱峰，袋i p j 处力t tj 0 它成分刈绿肠i 峻测定无f 扰。 ab c 图2 - i 绿原酸对照品溶液( a ) 、混合提耿液供试品溶液( b ) 、 阴性样品溶液( c ) 2 1 4 线性范围考察 川a 1 | 1 i j 阪f l ! j ! 卜川? ，i f _ ：爻 精密i 吸取2 1 2 1 项下绿原酸对照品贮备液( 0 4 1 0 4 m g m l 叫) 各0 1 m l 、 0 4 m l 、0 7 m l 、1 o m l 、1 3 m l 、1 6 m l 置l o m l 棕色量瓶中，色谱甲醇稀释定容 至刻度，摇匀，即得一系列绿原酸对照品溶液，浓度分别为4 1 0 4pg m l 、 1 6 4 1 6ug m l 、2 8 7 2 8ug m l 、4 1 0 4i ag m l 、5 3 3 5 2l ag m l 、 6 5 6 6 4i ag m l 。按2 1 1 项下色谱条件进样分析，以峰面积为纵坐标y ，以进 样量为横坐标x ，绘制标准曲线，得回归方程y = 2 7 7 4 2 x + 1 4 3 7 1 ，r ：o 9 9 9 9 。结 果表明绿原酸在4 1 0 4 n g 6 5 6 6 4 n g 范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。 表2 - 1 绿原酸线性关系考察 0l o o2 0 03 0 0 4 0 05 0 06 0 0，u u 进样量( n g ) 图2 - 2 绿原酸含量测定标准曲线 2 1 5 精密度实验 取浓度为0 0 4 1 0 4 m g m l 。1 的绿原酸对照品溶液，按2 1 1 项下色谱条件， 连续进样6 次，测得峰面积，其r s d 值为0 1 2 ，表明精密度良好。结果见表2 2 表2 - 2 绿原酸精密度实验结果( n = 6 ) 0 o 0 o 0 0 0 0 o 0 0 0 o 0 o o o 0 o o 0 0 0 0 0 0 0 o o 0 o o o 0 0 o 0 0 o o o o 0 o 0 o o 0 o o o o 8 6 4 2 0 8 6 4 2 2 1 l 1 l 1 峰面积 贵阳中仄学院帧i j 学位论艾 2 1 6 稳定性实验 精密吸取同一份供试品溶液分别于0 h ，2 h ，4 h ，6 h ，8 h ，1 2 h 进样测定6 次，记录峰面积，其r s d 值为0 1 3 ，结果表明，样品溶液在1 2 h 内有较好的稳 定性，结果见表2 - 3 表2 - 3 绿原酸稳定性实验结果( n = 6 ) 2 1 7 重复性实验 取| i d 一批号的提取液9 份，三份1 2 m l ( 8 0 ) ，三份1 5 m l ( 1 0 0 ) ，三份 1 8 m l ( 1 2 0 ) ，其余按2 1 2 2 项下制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积， 计算提取液中绿原酸含量，其r s d 值为1 1 4 。结果表明，此方法重复性良好。 表2 - 4 绿原酸重复性实验结果( n = 6 ) 2 1 8 加样回收率 精密吸取同一批号提取液9 份，每份0 7 5 m 1 。，分别加入0 7 m l ( 8 0 ) 、 0 9 m l ( 1 0 0 ) 、1 0 6 m l ( 1 2 0 ) 绿原酸对照品溶液( 浓度为0 4 1 0 4 m g m l l ) ，其余 按2 1 2 2 项下制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，并汁贸：收率，j r s d 值为2 3 5 ，结果表明该测定方法准确。 表2 - 5 绿原酸加样同收率实验结果 1 4 同收 r s d ( ) ( ) 5 6 7 8 9 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 3 6 2 3 2 53 6 9 3 6 07 ： 1 9 7 41 0 0 0 8 9 7 0 52 3 5 ：3 6 2 ： 2 5： 6 9 ： 6 ( )7 3 2 2 7 6l0 0 16 3 6 2 3 2 54 ：3 5 0 2 47 7 9 3 4 7 9 5 8 6 3 6 2 3 2 54 3 5 0 2 47 7 7 1 1 79 5 3 5 3 6 2 3 2 54 3 5 0 2 47 7 8 儿59 5 5 9 2 1 9 样t i f - 的含碴测定 精密吸取i 司批提取液三份，每份1 5 m l 。，其余按2 1 2 2 项下方法制备，分 别进样测定0 # 1 f l i 积，计算提取液r t i 绿原眩的含砖。结果见表2 - 6 表2 - 6 提取液中绿原酸含量测定实验结果( n = 3 ) 2 2 提取液中甘草酸含量测定方法的建立 2 2 1 色谱条件 色谱柱：k r o m a s i1 - c i 。( 4 6 m mx2 5 0 m m ，5t jm ) ；柱温：3 0 。c ；流速：0 8m l m i n 一： 流动相：甲醇一0 2 t o o l l 。乙酸铵一冰乙酸( 6 7 ：3 3 ：1 ) ；检测波长：3 2 7 n m ；进样 量：1 0ul 。 2 2 2 各种溶液的制备方法 2 2 2 1 对照品溶液的制备 精密称定甘草酸对照品1 9 6 0 m