（临床检验诊断学专业论文）白藜芦醇对体外培养肠球菌抗菌活性研究.pdf

目录 中文摘要一l 英文摘要3 英文缩写”5 研究论文白藜芦醇对体外培养肠球菌抗菌活性研究 前言6刖吾。6 材料与方法6 结果9 附图”1 1 附表1 4 讨 念15 结j 沧17 参考文献18 综述白藜芦醇抗病毒抗菌作用的研究现状2 0 致谢2 6 个人简历2 7 中文摘要 白藜芦醇对体外培养肠球菌抗菌活性研究 摘要 目的：肠球菌为院内感染的重要病原菌，不仅可引起尿路感染、皮肤 软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎， 由于其固有耐药性和第一株耐万古霉素肠球菌( c o m y c i n r e s i s t a n t e n t e r o c o c c i ，也) 出现，感染率逐年增加，引起临床的高度重视，因其 对多种抗生素耐药成为是治疗的一大难题。从2 0 世纪5 0 年代起我国医药 工作者开始了对中药抑菌作用的与抑茵成分的研究，由于中药抗菌的特殊 机理，不易产生耐药性，逐步成为研究的热点。白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ， r e s ) 为多酚类物质，是一种植物抗毒素，广泛存在于自然界的种子和植 物中，有许多是常见的药用和食用植物，如虎杖、花生、葡萄等。白藜芦 醇具有多种生物活性，包括抗氧化活性、抗炎症、雌激素样活性、生长抑 制活性、免疫调节、化学预防、抗肿瘤以及抗菌作用。但关于白藜芦醇抗 茵研究报道甚少，对多种细菌的作用效果和机制不明确。近年来的多项试 验研究表明，它作为一种几乎无毒副作用且来源广泛的天然植物提取物， 具有潜在的临床应用价值。本研究拟应用最低抑菌浓度( m i n i m a l i m l i b i t o 巧c o n c e n t r a t i o n s ，m i c ) 检测方法，观察白藜芦醇对肠球菌是否 具有抑制作用，进一步白藜芦醇的抑菌机理进行阐述，为中药抗菌在临床 防治细菌感染提供理论依据。 方法：根据美国临床实验室标准化委员会( c l i n i c a la n dl a b o r a t o r y s t a n d a r d s1 1 1 s t i t u t e ，c l s i ) 标准m 7 a 5 ，使用微量肉汤稀释法对白藜芦醇 进行定量抗菌实验，获得白藜芦醇对粪肠球菌和屎肠球菌的最低抑菌浓度 ( m i n i m a li n h i b i t o 科c o n c e n t i i a t i o n s ，m i c ) ，同时应用扫描电镜和透射电 镜观察白藜芦醇对肠球菌细胞作用后微观结构的变化。 结果：白藜芦醇对粪肠球菌m i c 5 0 和加c 9 0 分别为o 2 5 6 m 灿、 o 51 2 m 酌：1 1 l ，对屎肠球菌的m i c 5 0 和c 9 0 分别为o 2 5 6 m 眦、 o 51 2 m g i n l 。通过扫描电镜观察白藜芦醇对肠球菌形态超微结构的影响， 可以观察到正常肠球菌的扫描电镜结果显示菌体细胞外形是大小相对一 致。正常肠球菌的透射电镜显示菌体细胞结构清晰可见，细胞壁边缘光滑， 中文摘要 菌体的外膜、细胞壁、胞浆膜等均清晰可见。而经o 2 5 6m m l 白藜芦醇 作用后的肠球菌扫描电镜显示肠球菌形态出现不规则，大小很不一致，细 胞壁出现皱褶，周围多刺状突起，有部分菌体细胞成倍拉长或发生破裂； 通过透射电镜观察白藜芦醇作用后肠球菌的透射电镜超薄切片显示菌体 细胞结构明显被破坏，细胞与细胞间的界限变模糊，壁层次不清，细胞器 结构模糊，细胞质内含物大多消失，出现大量空泡。证实了白藜芦醇对肠 球菌的破坏作用，表明白藜芦醇对肠球菌具有很好的抗菌作用。 结论：白藜芦醇对屎肠球菌和粪肠球菌均有明显的抑制作用。通过实 验我们可以初步推断白藜芦醇对肠球菌的抑菌作用是通过干扰细胞壁的 合成，菌体细胞结构造成破坏，使菌体扭曲变形，致使细胞破裂，释放胞 内成分，直至成为空壳或分解。即与青霉素结合蛋白结合或者阻碍细胞壁 的肽糖聚合所需的糖肽基和转肽反应，使细胞壁合成受阻；或者同时干扰 细胞膜蛋白质的合成并改变膜结构的完整性，当药物通过破损的细胞膜进 入菌体后，继而干扰菌体内物质的合成，妨碍细菌d n a 复制、转录等， 影响菌体生长代谢，抑或这两种机制协同作用。白藜芦醇对肠球菌的体外 抑菌试验，结果表明白藜芦醇是一种具有极其广阔前景的抗感染中药。 关键词：白藜芦醇；肠球菌；最低抑菌浓度；扫描电镜；透射电镜 英文摘要 r e s v e r a t r o li nv i t r oa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f e n t e r o c o c c u s a b s t r a c t o b j e c t i v e s ： a sa ni m p o i r t a n tn o s o c o m i a lp a m o g e n s ，e n t e r o c o c c ic a n c a u s eu r i n a 巧t r a c ti n f e c t i o n s ，s 妯na n ds o 丘t i s s u ei n f e c t i o n s ，l i f e m r e a t e n i n g a b d o m i n a l i n f e c t i o n ，s e p s i s ，e n d o c a r d i t i sa n dm e n i n g i t i s r e c e n ts t u d i e sh a v e d e m o n s t r a t e dt h ei 1 1 f e c t i o nw i t he m e r o c o c c ii n c r e a s e dw h i c hc 2 1 1 】s e da n i m p o 庀m tc l i n i c a l 眦e n t i o nb e c a u s eo fi t si i i h e r e n tr e s i s t a n c ea n dt h e v a l l c o m y c i n r e s i s t a j l ts t r a i n se n t e r o c o c c u s ( v 抽c o m y c i n - r e s i s t a n te n t e r o c o c c i ， v r e ) e m e 玛e d ，w h i c hi t sr e s i s t a l l c e t o m a n ya n t i b i o t i c sh a sb e e nt h ea d i 筋c u l tp r o b l e m a sb e e nr e p o r d e d ，s o m et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n eh a d s p e c i a lm e c h a n i s mo fa n t i b a c t e r i a la n dn o te a s yt op r o d u c ed m gr e s i s t a n c e r e s v e r a t r o l ( r e s v e ra _ t r o l ，r e s ) ，i san o n - n a v a n o i dp h e n o lc o m p o u n dp r o d u c e d n a t u r a l l yb ys o m es p e m a t o p 肌e s ，s u c ha sg i a n tk n o t w e e dr h i z o m e ，e a r t l l c h e s t n u ta n d鲫e s ，i n r e s p o n s e t o i n j u 巧 o r 如n g a l a t t a c ka sn a t u r a l p h ”o a l e x i n r e s v e r a t r o li sa c o m p o u n dw i t h d i v e r s e b i o l o g i c a l e f j 陀c t s i n c l u d i n ga n t i o x i d a n ta c t i v i 吼a n t i - i n f l 蝴a t o e s t r o g e n - 1 i k ea c t i v i 吼a n d 铲o 、t hi n h i b i t o 巧a c t i v i 劬 i m m u n e r e g u l a t i o n ， a n d c h e m o p r e v e m i o n ， a n t i t u m o ra 1 1 da n t i - b a c t e r i a le f f e c t i nr e c e n ty e 2 u r s ，an u m b e ro fe x p e r i m e n t a l s t u d i e sh a v es h o w nt 1 1 a ti ti sa l m o s tn o n t o x i ca n da sas o u r c eo faw i d er a n g e o fn a t l j r a lp l a n te x t r a c t s ，h a v ep o t e n t i a lc l i n i c a l 印p l i c a t i o n s d u et ot h e r ea r e o n l yp a r u mr e p o r t so nm er e s v e r a t r o la b o u tt h ea n t i m i c r o b i a le f j f e c ta n dt h e m e c h a n i s mi sn o ti d e n t m e d ，w ee v a l u a t et 1 1 e a p p l i c a t i o no ft h em i n i m u m i i 吐l i b i t o 巧c o n c e n t r a t i o n ( m i n i m a li n h i b i t o 拶c o n c e n t r a t i o n s ，c ) t oo b s e n ，e t h ei n h i b i t o 巧e 髓c to fr e s v e r a t r o lo ne n t e r o c o c c it om a k e 如r t h e r 印p r o a c ht o e l a b o n n et h em e c h a n i s mo fr e s v e r a t r 0 1 m e t h o d s ： a c c o r d i n gt oc l m c a la n dl a b o m t o 叫s t a l l d a r d s1 1 1 s t i t u t e ( c l s i ) m 7 - a 5 ，u s i n g 也eb r o t hm i c r o d i l u t i o nm e t l l o dt oo b t a i nm i co f r e s v e r a t r o lo ne n t e r o c o c c u sf a e c a l i sa n de n t e r o c o c c u sf e c e s w k l es c a n n i n g 3 e l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y a r eu s e dt oo b s e r v e t h eo 矗i e c to fr e s v e r a t r 0 1o nm i c r o s t m c t u r ec h a n g e s r e s u l t s ：t h em i c 5 0a n dm i c 9 0 o fr e s v e r a t r o lt oe n t e r o c o c c u st a e c a l l s 2 u r eo 2 5 6a n do 512 m m lr e s p e c t i v e l y t h em i c 5 0a n dm i c 9 0 o fr e s v e r a t r o l t oe n t e r o c o c c u sf a e c i u ma r eo 2 5 6a n d0 512 m g m lr e s p e c t i v e l y 。i h e r ew e r e n oo b v i o u ss t a t i s t i c s d i 彘r e n c e sb e t 、e e ne n t e r o c o c c u s f a e c a l l s a n d e n t e r o c o c c u sf a e c i 啪( p o 0 5 ) 0 b s e r v i n gt h r o u 曲 s 锄1 1 n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e( s e m ) ， w ec a nc l e 2 u f l y s e et h a tm en o r m a l e n t e r o c o c c u s a p p e 踟c er e g u l a t e d ，m es i z eb a s i c l yc o n f o r m i 吼c e l l u a r s t r u c t u r el sn o m a l a n dt h ec e l lw a ua n dp l a s m am e m b r a n eh a v eb e e ns e e nc l e a r l y a r e ra f f e c t b v0 2 5 6 m n l lr e s v e r a t l o l ，t h ee m e r o c o c c u si si 仃e g u l a r t h es 1 z e l su n e q u a i ， t h ec e l lw “la p p e a r sw r i n e d ，r e d u c t u e da n dw i t l laf e we c h i n 。s c a b r o s 时 f o 肌e d ，s o m eh a v ep r o l o n g e di nd u p l i c a t i o n o b s e i n g 缸o u 曲t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) ，w ec a nc l e 砌ys e em a tt h en o n l l a le n t e r o c o c c u s c e l l u l a u rs t m c t u r ei si n t e g r i t ya n dc l e c e l lw a l lb o r d e r l i n ei sr e g u l a r i t y a n d t h ee n v e l o p e ，c e l lw a l l ，p l a s m am e m b r a n e ，c h r o m a t o s o m ea r ea l is e e nc i e a r l y a r e ra f f e c tb yo 2 56 m m 1r e s v e r a t r o l ，s o m el a y e ro fc e l l w a l li si n d i s t i n c t ， t h es t r u c t u r eo fc e l lo r g 锄i sb l u 玎e d ，m o s tc ”o p l a s m l cl n c l u s l o nd l s 印p e a r e d ， a n dg e n e r o u sv a c u 0 1 ee m e 唱e d c o n c l u s i o n s ： r e s v e r a t r o lh a sav e 巧g o o d 咖i m i c r o b i a l e 仃e c to n e n t e r o c o c c u sf - a e c a l i sa 1 1 de n t e r o c o c c u s f a e c i u m 。w em a yc o n c l u d et h a t r e s v e r a t r o l i m e r f e r ec e l lw a us y n t l l e s i sb yi n t e r f e r i n gw i 也m ec e us t n 】c t u r et 0 c a u s ed i s t o r e d ，r e s u l t i n gi nr u p t u r e da 1 1 dr e l e a s eo fi n t r a c e l l u l a rc o m p o n e n t st o c a u s et h es h e l ld e c o m p o s i t i o n t h es t u d yr e v e a l e dm a tr e s v e r a t r o lm a y i n t e r f e r et h ep e n i c i l l i n - b i n d i n gp r o t e i nb i n d i l l gw i 也c e l l w a l lp e p t i d e s ，o r h i l l d e r 百y c o p e p t i d e sp o l y m 耐z a t i o n a n dp e p t i d et r a n s f e rr e a c t i o n m e 锄w h i l e d 锄a g ec e l l u l a rm e m b r a n e ， i n n u e n c et h en o 加1 a lc e uc y c l e a n dm h i b i t r e p l i c a t i o no fm a t e r i a li n t 1 1 ec e l l o ri so n er e s u l to ft 1 1 es y n e 唱1 s t l c m e c h a n i s m sw h a tw ei 1 1 v e s t i g a t e da b o v e i n h i b i t o 巧e 日e c to fr e s v e r a t r o lo n e n t e r o c o c c ii nv i t r o ，w h i c hs h o w s 也a tr e s v e r a t r o li sa ne x t r e m e l yp r o m l s m g a n t i m ic r o b ia 1m e d i c 证e 4 英文摘要 k e yw o r d s ：r e s v e r a t r o l ；e m e r o c o c c u s ；m i c ；s e m ；t e m 5 英文缩写 i 迮s m i c c l s i t e m s e m v r e t r m g r e s v e r a t r 0 1 英文缩写 白藜芦醇 m i n i m a l i r d l i b i t o 巧c o n c e n r 最低抑菌浓度 a t i o n s c l i n i c a la n dl a b o r a t o 巧s t a临床实验室标准化 n d a r d si n s t i t u t e协会 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o透射电子显微镜 - s c o p e s c 锄i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e扫描电子显微镜 v a n c o m y c i n r e s i s t a n te n t e r o c o 耐万古霉素肠球 t r i c h o p h y t o nr u b r u m 红色毛癣菌 m i c r o s p o l l 蛐g y p s e u m 石膏样小孢子菌 菌 6 研究论文 白藜芦醇对肠球菌体外抗菌活性研究 ! 釜 刖吾 肠球菌属( e n t e r o c o c c i ) 在自然界广泛分布，为革兰阳性( g + ) 球菌， 是人类及动物肠道中的正常菌群。肠球菌为条件致病菌，近二十年来，肠 球菌的感染率不断增加，并逐渐成为医院感染的常见致病菌【l 】，可引起人 类各种感染性疾病，以粪肠球菌所致感染最为常见，大约9 0 ，而屎肠球 菌，则为1 0 2 0 。常见的有尿路感染、腹腔、盆腔感染、败血症、心内 膜炎、脑膜炎、褥疮、糖尿病人足部感染、外科伤口和烧伤创面的感染等。 自1 9 8 6 年英国报告了第一株耐万古霉素肠球菌( v 觚c o m y c i n r e s i s t 觚t e n t e r o c o c c i ，v i 也) 后，v i 迮欧洲和美国广泛传播，感染率逐年增加，引 起临床的高度重视。由于肠球菌对多种抗生素耐药，因此，肠球菌感染的 预防、治疗成为临床上的一大难题。由于中药抗菌的特殊机理，不易产生 耐药性。白藜芦醇( r e s v e r a 仃o l ，i 迮s ) 由于可以自然产生这抗菌物质以 抵御细菌和真菌而被称为植物抗毒素。广泛存在于自然界的种子和植物 中，其中有许多是常见的药用和食用植物，如虎杖、花生、葡萄等。随着 对白藜芦醇研究深入，人们发现它具有多种生物活性，包括抗氧化活性、 抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎症、雌激素样活性、生长抑制活性、 免疫调节、化学预防、抗肿瘤以及抗菌作用【2 4 1 。本实验采用定量抗菌试 验方法，进行了体外抗菌活性研究，观察白藜芦醇对肠球菌是否具有抑制 作用，以及不同浓度下的抑制效果，进一步探讨白藜芦醇的体外抑菌作用 机制，为临床用药提供理论依据。现报告如下。 材料与方法 1 材料 1 1 药品与试剂 白藜芦醇 二甲基亚砜( d m s o ) m u e l l e r - h i n t o n ( m h ) 肉汤培养基 s i g m a 公司 p r o m e g a 公司 杭州天和生物公司 研究论文 m u e l l e r - h i n t o n ( m h ) 琼脂培养基 1 2 仪器 高速离心机 生物安全柜 微量移液器 9 6 孔微量培养板 h i a c h is 5 2 0 扫描电镜 h i a c h ih 7 5 0 0 透射电镜 生化培养箱 1 3 菌株来源 杭州天和生物公司 t h e m o 公司 江苏净化设备厂 t h e n i l o 公司 c o s 吖浓公司 h i a c h i 公司 h i a c h i 公司 江苏中大仪器厂 各菌株均分离自河北医科大学第二医院门诊及住院患者的血液、尿 液、脓液、痰液等临床标本。将肠球菌的新鲜培养物( 菌落) 制成菌液， 浓度相当于o 5 麦氏浊度。其中粪肠球菌1 6 株，屎肠球菌1 6 株。所有菌 株均经过肠球菌属生化管鉴定系统鉴定。参考菌株：a t c c 2 9 2 1 2 。 2 方法 依据美国临床实验室标准化委员会( c l s i ) 标准提出的，为空气条 件下可生长的细菌设计的抗微生物药物敏感试验稀释法第五版m 7 a 5 【5 】， 采用微量肉汤稀释法，用m h 肉汤对白藜芦醇进行定量抗菌实验。 2 1 最低抑菌浓度( m i n i m a l i n h i b i t o 珂c o n c e n t r a t i o n ，m i c ) 的测定 2 1 1 药液稀释 将白藜芦醇溶于1 0 0 d m s 0 ，制成浓度为1 0 0 m m l 的原液，用m h 肉汤将其稀释成2 0 4 8 m 咖l 溶液。排列无菌试管十支，于第2 1 0 支试管 中各加入m h 肉汤1 0 m l ，取2 0 4 8 m 咖l 白藜芦醇溶液2 0 m l ，于第一管 中加入1 0 m l ，于第二管中加入1 0 m l 。第二管混匀后取出1 0 m l 加入第三 管，如此连续稀释至第九管取出1 0 m 1 弃掉。第十支试管只有m h 肉汤作 对照，这样1 9 管含有o 0 0 8 2 0 4 8 m 咖l 不同浓度药液各l o m l 。 2 1 2 菌液的制备 从孵育了18 2 4 小时的血琼脂平板上挑取单个菌落，用无菌生理盐水 制成悬液，在光线充足的地方，背对着有白色背景与黑色背景对比线条的 卡片，将接种管与o 5 号麦氏浊度标准管进行目测比较，将菌悬液调至o 5 麦氏浊度，此时菌悬液内培养物大约含1 2 1 0 8 c 列m l 。将菌悬液用无菌生 研究论文 理盐水1 ：l o 稀释获得1 2 1 0 7 c m m l 的菌液。 2 1 3 指标测定 使用微量移液器将不同浓度的含药培养基分配到9 6 孔板上，每孔 o 1 m l 。将稀释后的菌液接种到盘孔内，每孔o 0 0 5 m l ，每个菌株对应九个 不同浓度的含药培养基。这样细菌的最终测试浓度为5 1 0 4 c 列孔，分别 设立生长对照孔和阴性( 未种菌) 孔。 2 1 4 对照设置 按照美国临床实验室标准化委员会( c l s i ) 标准方案，对粪肠球菌 a t c c 2 9 2 1 2 进行反复测定，其苯唑西林的m i c 值o 1 2 o 5 u 咖l ，头孢哌 酮的m i c 值1 4 u g m l 。每次实验以此菌株作为对照，只有当其m i c 值介 于质控范围之内时方可认为实验操作准确可靠，并且只有当生长对照孔生 长良好，并且其他孔有随药物浓度升高则菌生长梯度受抑制时方可证明实 验成功。 2 2 电镜标本的留取方法 2 2 1 含药平板制备 取2 2 5 m l 无菌操作已溶化的m h 琼脂培养基，温度接近体温时，加 入2 5 m l 已稀释为2 5 6 m 咖l 的白藜芦醇药液。混合后倾注一个平板，每 个平板白藜芦醇浓度为o 2 5 6 m g m l ，每个平板含2 5 m l 含药培养基，凝固 后备用。 2 2 2 从孵育了18 2 4 小时的血琼脂平板上挑取单个菌落，用盐水制成悬 液，并将其调制o 5 麦氏浊度。 2 2 3 菌株的处理 用微量移液器取5 u l 菌液分别接种于含药与不含药培养基上，于3 7 培养箱中孵育2 4 小时后取出。， 2 2 4 电镜标本制作过程 扫描电镜制作过程 取材取大小适中的玻璃平皿，其内放好冰块，在冰上放好软塑料 板或牙料蜡板，而后在板上滴预冷戊二醛固定液备用。取新鲜纯培养的直 径约1 m m 菌落迅速置入上述固定液内，然后用刮匙将样品取出并割成小 块，进行固定。 清洗及固定将上述含细菌的固定液在冰浴或4 0 c 的温度下放置 研究论文 5 1 0 m i n ，再用刮板将细菌刮下，倒入离心管中，经4 0 0 0 r m i n 离心 1 0 1 5 m i n ，使细菌沉淀为团块，轻轻吸去上清液，沿管壁缓缓加入预冷的 戊二醛固定液，1 5 3 0 m i n ，再吸去上清液，经磷酸盐缓冲液配制的2 0 n a c l 缓冲盐溶液l o m l ，轻轻摇匀后，4 0 0 0 r m i n 3 5 m i n ，弃去上清液，再注入 上述缓冲液反复清洗3 5 遍后，继用1 锇酸对菌样品做后固定3 0 分钟。 脱水用不同浓度的乙醇按“梯度脱水法”逐步取代样品中的水分。 其程序为：彻底清洗样品3 0 m i n 以上，5 0 乙醇1 0 1 5 m i n 一7 0 乙醇1 0 1 5 m i n _ 8 0 乙醇1 0 1 5 m i n _ 9 0 乙醇1 0 1 5 m i n _ 1 0 0 乙醇2 次，每 次3 0 m i n 。 干燥用醋酸异戊酯置换样品中的脱水剂及残留水份，然后进行常 规二氧化碳临界点干燥。 镀膜将样品放于立体显微镜下确认观察面，而后用导电胶将样品 贴于样品托上，在离子镀膜机内进行金属喷镀。最后，在扫描电镜下观察、 照相【6 】。 透射电镜标本制备过程 取新鲜纯培养的直径约1 m m 菌落，用2 5 戊二醛固定l 小时，p b s 漂洗，每次1 0 m i n ，共三次，饿酸固定l 小时，p b s 漂洗，每次l o m i n ， 共三次，然后用不浓度的丙酮梯度脱水，每个浓度分别脱水1 0 m i n ，环氧 树脂包埋、切片，铅铀电子染色，透射电镜观察。 结果 l 白藜芦醇对肠球菌的m i c 测定 白藜芦醇对肠球菌属的粪肠球菌和屎肠球菌的m i c 5 0 、m i c 9 0 均为 o 2 5 6 m 咖l 、o 5 1 2 m r i d 见( t a b l e1 ) 。对各种肠球菌的浓度累计抑菌率 如( t a b l e2 ) 。白藜芦醇对粪肠球菌和屎肠球菌的抑菌效果比较见( f i g 1 ) 。 2 电镜观察白藜芦醇对肠球菌形态超微结构的影响 2 1 扫描电镜观察白藜芦醇对肠球菌形态超微结构的影响 对肠球菌形态超微结构的影响，可以清楚地看到正常肠球菌的菌体细 胞外形是大小相对一致，菌体细胞结构清晰可见，细胞壁边缘光滑，菌体 的外膜、细胞壁、胞浆膜等均清晰可见。( f i g 2 ) 。经过o 2 5 6 m m l 白藜 研究论文 芦醇2 4 小时作用后的肠球菌大小很不一致，形态变得不规则，细胞壁出 现皱褶，周围多棘状突起有部分菌体细胞成倍拉长或发生破裂。( f 嘻3 ) 。 2 2 透射电镜观察白藜芦醇对肠球菌形态超微结构的影响 通过透射电镜观察白藜芦醇对肠球菌形态超微结构的影响，可以观察 到正常肠球菌的透射电镜超薄切片显示菌体细胞结构完整清晰，细胞壁边 缘整齐，菌体的外膜、细胞壁、胞浆膜等均清晰可见( f i g 4 ) 。经o 2 5 6 m m l 白藜芦醇2 4 小时作用后肠球菌的透射电镜超薄切片显示菌体细胞结构明 显被破坏，细胞与细胞间的界限变模糊，壁层次不清，细胞器结构模糊， 细胞质内含物大多消失，出现大量空泡。( f 逸5 ) 。 研究论文 1 0 0 8 0 、 葛 6 0 暑 4 0 2 0 0 附图 。”+ “7 。一，”一。1 。9 一夕7 j l |j j 。黝乩也一j 。j lj ? 。j 一一! o 0 1 6 0 0 3 20 0 6 4 0 1 2 80 2 5 6 0 5 1 2 1 0 2 4 c o n c e n t r a tio no fr e s ( m g m 1 ) _ 一e n t e r o c o c c u sf a e c a l 哆一e n t e r o c o c c u sf e c e s f i g 1f e c e so f r e s v e r a t r o lo ne n t e r o c o c c u sf a e c a l i sa n dc o i n p a r e di nt h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y f i g 2n o m l a ls c 2 l r m i n ge l e c t m nm i c r o s c o p yo f e n t e r o c o c c u sf a e c a l i s 1 2 ohpo【cc一_【p1_e暑300 研究论文 f i g 3o 2 5 6 m g m lr e s v e r a t r 0 1b ys c a r m i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p yo f e n t e r o c o c c u sf a e c a l i s f i g 4t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yo fe n t e r o c o c c u sf a e c a l i sn o m l a l 1 3 研究论文 f i g 5o 2 5 6 m m lr e s v e r a t r 0 1b yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yo f e n t e r o c o c c u sf a e c a l i s 1 4 研究论文 附表 t a b1e f f e c t so fr e s v e r a t r o lo nav 撕e t ) ，o fe n t e r o c o c c im i c ( m m 1 ) t 兆2v 打i o u sc o n c e n t r a t i o n so f t o t a l i n h i b i t o 巧r a t eo f e m e r o c o c c u s 1 5 研究论文 讨论 肠球菌属细菌为革兰阳性球菌，多数菌种成双或呈短链状排列；一般 无芽胞，无荚膜，少数菌种有鞭毛。在自然界广泛分布，是人类及动物肠 道中的正常菌群，其数量仅次于大肠杆菌。一般不引起疾病，然而近年来， 由于抗生素的滥用，尤其是第三代头孢菌素的广泛应用，肠球菌已成为院 内感染的主要致病菌。可引起人类各种感染性疾病，常见有尿路感染、腹 腔、盆腔感染、败血症、心内膜炎、脑膜炎、褥疮、糖尿病人足部感染、 外科伤口和烧伤创面的感染等。引起人类感染性疾病最常见的种别是粪肠 球菌，大约9 0 ，屎肠球菌1 0 2 0 。所占比例较小使得与肠球菌的感染 发生率和死亡率不断增加，己成为医院感染的重要病原菌，其中最常见的 是尿路感染，其次为腹部和盆腔等部位的创伤和外科术后感染【7 j 。自1 9 8 6 年英国报告了第一株耐万古霉素肠球菌( v 觚c o m y c i n - r e s i s t a n te n t e r o c o c c i ， v i 迮) 后，v r e 在欧洲和美国广泛传播，感染率逐年增加，引起临床的 高度重视，因其对多种抗生素耐药成为是治疗的一大难题。 然而，肠球菌所引起的感染率在不断增加外，其对多种抗生素的耐药 性也呈不断上升趋势。有报道指出在3 6 2 株肠球菌属中，检测到粪肠球菌 对氨苄西林、环丙沙星、青霉素g 的耐药率分别为6 1 8 、4 8 1 7 、3 6 8 ， 低于屎肠球菌的9 0 5 、7 6 7 、8 2 3 ；粪肠球菌、屎肠球菌对红霉素的 耐药率分别达到8 6 3 和9 1 2 i 剐。 抗菌药物对于肠球菌的作用机制不尽相同，糖肽类抗生素包括万古霉 素、替考拉宁、多枯菌素、杆菌肽等，系高分子量疏水化合物，其可与肠 球菌细胞壁上的五肽糖前体的羧基末端d 一丙氨酸d 一丙氨酸( d a d a ) 结合形成复合体，从而抑制了肽糖聚合所需的糖肽基和转肽反应，使肠球 菌不再能合成细胞壁而死亡。万古霉素耐药的肠球菌( v i 迎) 是由于基因改 变，使细胞壁的肽糖前体末端改变为d 一丙氨酸d 一孚l 酸盐，万古霉 素即失去与之结合能力，肠球菌可照常合成细胞壁而存活。抗生素选择性 压力等因素导致耐万古肠球菌( v 】陋) 的出现以及感染率的不断增加，给临 床治疗带来了极大的困难【9 】。 氨基糖苷类抗生素的作用机制主要是通过抑制细菌细胞膜蛋白质的 合成并改变膜结构的完整性而发挥强有力的杀菌作用。肠球菌对氨基糖苷 研究论文 类的耐药机制体现在染色体突变引起的药物作用靶位置的改变和干扰抗 生素的转移，但主要是细菌产生质粒介导的氨基糖苷类钝化酶所致【l 们。 喹诺酮类药物的主要作用靶位是d n a 促旋酶和拓扑异构酶i v ，阻止 细菌d n a 拓扑异构变化，妨碍细菌d n a 复制、转录，达到杀菌目的。 而目前肠球菌对于喹诺酮类抗生素类药物耐药性的不断增加，涉及到两个 方面：药物靶位异构酶的改变和药物的主动外排】。 p 内酰胺类抗生素的作用机制主要是阻碍细菌细胞壁的合成。细菌合 成细胞壁需要特定的合成酶即青霉素结合蛋白，当p 一内酰胺类抗生素与 青霉素结合蛋白结合后，使青霉素结合蛋白失去酶的活性，使细胞壁的合 成受到阻碍，最终造成细胞溶解，细菌死亡。而肠球菌对青霉素类的耐药 机制，目前认为有两个原因：一是产生低亲和力的青霉素结合蛋白( p b p s ) ： 其次是产生质粒介导b 一内酰胺酶( e s b l s ) ，青霉素对肠球菌的抗菌作用 是抑菌作用，而不是杀菌作用：肠球菌由于其细胞壁坚厚，对许多抗菌药 敏表现为固有耐药，对头孢菌素类天然耐药【1 2 1 。 由于肠球菌属耐药特征复杂，不仅对多种抗菌药物天然耐药，而且易 产生获得性耐药及药物耐受等【1 3 1 。所以在肠球菌感染时的抗生素应用以加 强宏观控制的同时，有必要寻找安全、有效的新型消毒剂，抑制或杀灭粪 肠球菌，也有利用中草药制剂来防治肠球菌的感染的报道【1 4 1 。中国的中草 药具有种类繁多、来源广泛、不易产生耐药性、毒副作用小等优点，从中 探寻一些具有较强抗菌活性的中草药或其提取物作为临床抗菌治疗的新 契机。 关于白藜芦醇抗菌作用国内外报道很少，为进一步研究自藜芦醇的抗 菌活性，观察白藜芦醇对肠球菌的抑菌情况。实验按照美国临床实验室标 准化委员会( c l s i ) 标准，对临床分离的3 2 株肠球菌进行了m i c 测定， 结果证明白藜芦醇对肠球菌有抗茵活性，其m i c 5 0 为o 2 5 6 m m l ，m c 9 0 为o 51 2 m m l 。通过s p s s1 3 o 统计软件分析，认为白藜芦醇对粪肠球菌， 屎肠球菌的抑菌作用没有差别( 尸 o 0 5 ) 。实验结果显示两种肠球菌在不 同浓度白藜芦醇的累积抑菌率可以得出，粪肠球菌对于白藜芦醇的敏感性 略低于屎肠球菌，这与其他文献所报道的屎肠球菌耐药性高于粪肠球菌的 结论不符，可能与所选用的样本量偏小有关或者可能与病人情况、生活习 惯、标本来源及医院的科室结构、床位配置不同有关。 研究论文 观察白藜芦醇对肠球菌超微结构的影响，我们将经白藜芦醇作用的肠 球菌参考菌株a t c c 2 9 2 1 2 ，通过扫描电镜观察白藜芦醇对肠球菌形态超 微结构的影响，可以观察到正常肠球菌的扫描电镜结果显示菌体细胞外形 是大小相对一致。正常肠球菌的透射电镜显示菌体细胞结构清晰可见，细 胞壁边缘光滑，菌体的外膜、细胞壁、胞浆膜等均清晰可见。而经o 2 5 6 m m l 白藜芦醇2 4 小时作用后的肠球菌扫描电镜显示肠球菌形态出现不 规则，明显大小不一致，细胞壁出现皱褶，周围多及棘状突起，有部分菌 体细胞成倍拉长或发生破裂；通过透射电镜观察经o 2 5 6m g m l 白藜芦醇 2 4 小时作用后肠球菌的透射电镜超薄切片显示菌体细胞结构明显被破 坏，细胞与细胞间的界限变模糊，壁层次不清，细胞器结构模糊，细胞质 内含物大多消失，出现大量空泡。从微观结构上证实了白藜芦醇对肠球菌 的破坏作用。 白藜芦醇作为一种从植物中提取出来的活性单体，为中药虎杖的有效 成分之一，其抑菌机制尚未十分清楚。通过上述抗生素对于肠球菌的抑菌 机制，我们可以初步推断通过干扰细胞壁的合成，菌体细胞结构造成破坏， 使菌体扭曲变形，致使细胞破裂，释放胞内成分，直至成为空壳或分解。 即与青霉素结合蛋白结合或者阻碍细胞壁的肽糖聚合所需的糖肽基和转 肽反应，使细胞壁合成受阻；或者同时干扰细胞膜蛋白质的合成并改变膜 结构的完整性，当药物通过破损的细胞膜进入菌体后，继而干扰菌体内物 质的合成，妨碍细菌d n a 复制、转录等，影响菌体生长代谢，抑或这两 种机制协同作用。 结论 目前，肠球菌己成为院内感染的主要致病菌之一，由于其固有耐药 性，且对多种抗生素耐药，以及耐万古霉素肠球菌的出现，给临床治疗肠 球菌性感染带来很多困难。我们采用对白藜芦醇进行体外抑菌试验研究， 用扫描电镜和透射电镜观察肠球菌用药前和用药后的超微结构，结果表明 白藜芦醇对肠球菌有较好的抑菌效果。所以白藜芦醇是一种极具有开发前 景的抗感染中药。 研究论文 参考文献 lj o n e sr n ，l o wd e ，p f a l l e rm a e p i d e m i o