（人体解剖与组织胚胎学专业论文）人星形胶质细胞增强小鼠海马齿状回突触的可塑性.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要6 二、英文缩略语1 0 三、论文 论文一人神经胶质祖细胞移植于小鼠脑内两侧侧脑室周区后发育成人星形胶质 细胞 前言“1 1 且u 舌“”i 上 材料与方法1 1 实验结果1 3 讨论”1 8 结论”1 9 论文二人星形胶质细胞增强了小鼠海马齿状回神经元的突触可塑性 前言0 0 1 00 0 0 0 0 000 2 0 刖舌 ” z u 材料与方法2 0 实验结果2 2 讨论8 0o qo0 do o0 2 8 结论”2 9 四、本研究创新性的自我评价3 0 五、参考文献3 1 六、附录 综述“3 5 在学期间科研成绩4 8 致谢”5 0 个人简介5 1 中文论著摘要 人星形胶质细胞增强小鼠海马齿状回突触的可塑性 刖舌 星形胶质细胞( a s t r o c y t e ) 是神经系统中数目众多的细胞之一，在神经系统中 不但起着支持、营养、保护的作用，而且还表现调节神经元生长，神经递质传递， 神经元突触电活动等诸多重要生物学功能。神经胶质细胞功能的异常可以直接导 致神经系统功能的异常，许多中枢神经系统退化性疾病和损伤性疾病如阿尔兹海 默病。帕金森综合征，脑缺血后神经功能损害程度等都与星形胶质细胞活化及功能 活动异常有关。 近年来，中枢神经系统损伤后的修复一直是科研人员和临床工作者关注的重 点。神经干细胞移植已成为神经退化性疾病及神经系统缺血损伤的一种尝试性试 验治疗手段。众多行为学试验表明移植神经干细胞后，损伤的神经系统功能有一 定程度的改善，形态学研究结果表明移植的部分神经干细胞可以在脑内发育成星 形胶质细胞，其对神经功能的改善可能发挥着一定的影响。但是由于神经干细胞 来源的复杂性，因此，对神经干细胞种类、移植时间的选择，对移植的细胞如何 进行有效诱导使其分化为目的细胞及其修复机制的探讨仍是此类研究的瓶颈。神 经胶质细胞来自于神经胶质祖细胞，神经胶质祖细胞又由神经干细胞分化而来。 目前关于神经胶质祖细胞对神经系统结构和功能重建作用的相关报道仍不充分 星形胶质细胞可以通过释放a t p d 丝氨酸，肿瘤坏死因子等生物活性物质来调节 突触的数量，突触的反应强度及突触间神经递质的传递。基于以上信息，我们感 兴趣的是：经细胞移植后分化存活的星形胶质细胞是否会影响突触的功能及其可 能的机制。 本课题利用将人神经胶质祖细胞移植到正常小鼠脑内两侧侧脑室周区的动物 模型，应用多种实验方法观察分化的人星形胶质细胞的形态特点，观察人星形胶 + 质细胞的生理学特性，观察人星形胶质细胞对小鼠海马齿状回突触活动的影响。 为探讨星形胶质细胞的结构发育与功能特点提供体内实验依据。 材料和方法 一、主要试剂 来自于1 7 2 2 周的流产人胚的前脑脑室下区的神经胶质祖细胞【7 ，3 】( a 2 8 5 细 胞) 和c m v - 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，e g f p ) 逆转录病毒由美国 罗切斯特大学的g o l d m a n 教授惠赠；小鼠抗人核单克隆抗体，小鼠抗人n g 2 单 克隆抗体，兔抗a 2 8 5 多克隆抗体( c h e m i c o n ，美国) ，小鼠抗人神经胶质酸性蛋 白h g f a p 单克隆抗体( s t e r n b e r g e r 公司，美国) ，小鼠抗人线粒体单克隆抗体( u s b i o l o g i c a l 公司，美国) ，兔抗d 丝氨酸多克隆抗体，鸡抗层粘连蛋白多克隆抗体 ( a b e a m 公司，美国) ，小鼠抗n m d a r i 单克隆抗体，( s t e r n b e r g e r 公司，美国) ， 羊抗人肿瘤坏死因子多克隆抗体( r & ds y s t e m s ，美国) ，羊抗丝氨酸消旋酶多克 隆抗体( s a n t ac r u z ，美国) ，d a p i 核d a p i 核染色剂和c y 3 或c y 5 荧光标记的二 抗( j a c k s o n 公司，美国) 二、主要仪器 细胞培养箱和超净台( e r l a b ，美国) ：共聚焦显微镜和f l u v i e w3 0 0 图像分析 系统( ( o l y m p u s ，日本) ；荧光倒置显微镜( o l y m p u s ，日本) ；恒温冷冻切片机 ( l e i c a ，德国) ；8 0 深低温冰箱( t o s h i b a ，日本) ；立体定位微注射仪( u s e q u i p m e n tc o ，美国) ；双光子激光显微镜( o l y m p u s ，日本) ；紫外线激光发生器 ( u se q u i p m e n tc o ，美国) ；电生理描记系统( u se q u i p m e n tc o ，美国) ；震荡 切片机( l e i c a , 德国) ；行为学实验记录箱( c o u l b o u mi n s t r u m e n t s ，美国) ； 三、实验方法 l 、实验动物 实验动物为新生2 4 h 以内的r a 醇小鼠6 0 只，雌雄不限，购自美国j a c k s o n 实 验室。随机分为两组：实验组和对照组。 2 、神经胶质祖细胞的培养和转染 a 2 8 5 细胞用d m e m f 1 2 n 1 无血清培养基培养，其内加入2 0 n g m lb f g f 。转 染按文献的方法进行，将细胞与c m v - e g f p 逆转录病毒孵育过夜，弃上清，用 d m e m f 1 2 n 1 培养液继续培养3 5 天。用荧光倒置显微镜观察，转染成功的a 2 8 5 细胞( 表达绿色荧光蛋白) 用于移植实验。 2 3 、神经胶质祖细胞的移植 转染后的a 2 8 5 细胞用胰蛋白酶消化，吹打细胞悬浮于h b s s 中。将出生2 4 h 内的r a 9 2 小鼠冰上麻醉后， 固定于立体定位仪上，用玻璃微量加样器将l u l ( 1 x 1 0 5 u 1 ) 的细胞悬液平均注入两侧侧脑室周区。 4 、免疫组织化学染色观察细胞形态结构 5 、膜片钳方法记录胶质细胞电生理特性 将4 0 0 微米厚的脑片置于双光子激光显微镜下，用膜片钳方法记录人神经胶 质细胞的形态，膜电位，细胞阻抗等生理指标。用膜片钳方法向细胞内注入钙指 示剂( r h o d 2 ) 与钙蝥合剂( n p e g t a ) ，用紫外激光激发钙释放，双光子显微镜下 观察钙波传导，测量钙波传导速度【4 2 1 。 6 、电生理l t p 实验 选取含海马齿状回的脑片进行记录兴奋性突触后电位和长时程增强效应实 验。在海马齿状回的颗粒下区( 苔藓纤维) 放置记录电极和刺激电极。 7 、t n f a 抑制剂给药方法 小鼠在进行电生理实验前1 0 天起，每天给予t h a l i d o m i d e 腹腔注射( 5 0 0 m g k 舀i p ，0 2 5 0 3m 1 ) 。 8 、行为学实验 关于学习和记忆的行为学实验在两个记录箱中进行。第一个记录箱用于训练 动物，第二个记录箱用于检测和录像记录。小鼠在箱内适应3 分钟后，给予长达 3 0 秒4 2 0 h z 的声音刺激，在声音刺激结束后，给予2 秒钟0 3 m a 的电流刺激足 部。实验结果用f r e e z e v i e ws o f t w a r e 软件进行分析 9 、统计学处理 ，所有数据采用m e a n d ：s d 表示，用s i g m as t a t8 0 统计软件对数据进行方差分 析，差异显著性采用t 检验。p o 0 5 为差异有显著性。 实验结果 l 、细胞培养观察神经胶质祖细胞的转染 细胞成功表达绿色荧光蛋白。转染并培养5 天后，细胞分化为扁平梭形多突 起的细胞，a 2 8 5 免疫荧光染色为阳性。 3 2 、神经胶质祖细胞的分布 移植6 个月后，可见分化的神经胶质祖细胞主要分布于皮层，胼胝体，海马 和侧脑室周围，细胞表达绿色荧光蛋白。 3 、神经胶质祖细胞的分化和细胞结构特点 免疫荧光染色结果表明，移植后的细胞主要分化成星形胶质细胞，并体现人 星形胶质细胞的结构特点：细胞大，突起多，突起长，线立体沿细胞长突起排列， 突起末端与血管接触。海马中可见h n g 2 表达阳性的细胞。 4 、人星形胶质细胞的生理学特性 与鼠星形胶质细胞相比，人星形胶质细胞细胞阻抗略高，静息膜电位无统计 学差别。紫外激光激发实验显示钙波可沿人星形胶质细胞的长突起传递，人星形 胶质细胞钙波传导速度比鼠星形胶质细胞快。 5 、f e p s p 和l t p 实验 在不同的强度刺激下，实验组的危p s p 明显高于对照组。l t p 实验结果显示 h f s 后，实验组的f e p s p 反应可持续6 0 分钟，而对照组回到基线。两者的差别 有统计学意义。 6 、免疫染色分析t n f a 和g l u r l 的表达 实验组的t n f a 和g l u r l 的表达均高于对照组，而n r l 的表达在两者并无 明显区别。注射t h a l i d o m i d e 后，实验组t n f a 和g i u r i 的表达均低于对照组， n r l 的表达在两者并无明显区别。 7 、行为学实验分析学习记忆能力的差异 实验组的小鼠学习和记忆的能力明显高于对照组。 结论 l 、将人神经胶质祖细胞移植入正常小鼠脑内两侧侧脑室周区后，细胞在移 植部位存活、分化、增殖并体现人星形胶质细胞的形态结构特点。 2 、分化的人星形胶质细胞可能参与了宿主脑内血脑屏障的形成。 3 、分化的人星形胶质细胞表达人细胞的电生理学特性，钙波传导速度比鼠 星形胶质细胞快。 4 、人星形胶质细胞加强了小鼠海马齿状回神经元的突触活动，主要表现在兴 4 奋性突触后电位和长时程增强效应的加强。 5 、小鼠海马齿状回t n f a 表达的增加可能是促进长时程增强效应的主要的影 响因素。 关键词 神经胶质祖细胞；星形胶质细胞；长时程增强效应 5 英文论著摘要 h u m a n a s t r o c y t ea c c e n t u a t es y n a p t i cp l a s t i c i t yi n d e n t a t eg y r u si nm o u s e i n t r u d u c t i o n a s t r o e y t ei so n eo ft h em a i nc e l ls t y l ei nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m a s t r o c y t e si n r e c e n ty e a r sh a v eb e e ns h o w nt o p l a yv i t a lr o l e si np r o c e s s e sa t t r i b u t e dt on e u r o n s b e s i d e st h e i rt r a d i t i o n a ls u p p o r t i n ga n dn u t r i t i o n f o re x a m p l e , a s t r o c y t e sm o d u l a t e b o t he x c i t a t o r ya n di n h i b i t o r yt r a n s m i s s i o na n dt h e ya r er e q u i r e df o rs y n a p t o g e n e s i s a n dm a i n t e n a n c eo fs y n a p t i cd e n s i t y u n d e r s t a n d i n gt h e s ef u n c t i o n sh a sa l l o w e da r e f o c u s i n gw i t hr e g a r dt ot h er o l eo fa s t r o c y t e si nn e u r o d e g e n e r a t i v ea n di s c h e m i c d i s e a s e s ，s u c ha sa l z h e i m e r sd e s e a s e ，p a r k i n s o n sd i s e a s ea n db r a i ni s c h e m i cd a m a g e ， t h e ya r ec o n s i d e r e da s s o c i a t e dw i t ha b n o r m a lf u n c t i o no fa s t r o e y t e s t h em o d e s tc a p a c i t yo fe n d o g e n o u sr e p a i rp r o c e s s e si nt h ec e n t r a ln e r v o u s s y s t e mj u s t i f i e st h eb r o a di n t e r e s ti nt h ed e v e l o p m e n to fe f f e c t i v es t e mc e l lb a s e d t h e r a p i e sf o rn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s o r d e r sa n do t h e ra c u t eo rc h r o n i cl e s i o n s s e v e r a l s t u d i e sh a v ea l r e a d ye v i d e n c e dap o t e n t i a lb e n e f i to fs t e mc e l lg r a f t si na n i m a lm o d e l s o fh u m a nd i s o r d e r sb yb e h a v i o re x p e r i m e n t a lr e s u l t s h i s t o l o g i c a le v i d e n c eo fs o m e s t u d i e ss h o w e dt r a n s p l a n t e ds t e mc e l l sc o u l dd i f f e r e n t i a t e di n t oa s t r o c y t e sw h i c hm i g h t c o n t r i b u t et ot h ec e r t a i nf u n c t i o n a lr e c o v e r yi nc n s n e v e r t h e l e s s ，m o r en e u r a ls t e m c e l l sc o u l db eo b t a i n e df r o ma v a r i e t ys o u r c e s ，s ol o t so fp r o b l e ms u c ha st h ec h o o s eo f c e l lt y p e ，t i m eo ft r a n s p l a n t a t i o n ，e f f e c t i v ei n d u c t i o nt oa i mc e l l sa n dm e c h a n i s mo f i m p r o v e m e n ta r en o tf u l l yu n d e r s t o o d ，i n c l u d i n gt h eg l i ap r o g e n i t o rc e l l sw h i c hg o e st o a s t r o c y t e sa n do l i g o d e n d r o e y t e s t h ef u n c t i o no fa s t r o c y t e si nr e g u l a t i n gs y n a p t i c f u n c t i o nb yr e l e a s i n ga t p , d s e r i n ea n dt n f ai sb e c o m i n gi n c r e a s i n g l yr e c o g n i z e da s b e i n go fp a r a m o u n ti m p o r t a n ti nt h em a i n t e n a n c eo fn e u r o n a le n v i r o n m e n t b a s eo n t h ea b o v ei n f o r m a t i o n , w eh y p o t h e s i z e dt h a ts y n a p t i cf u n c t i o nm i g h tb ea f f e c t e db y 6 a s t r o c y t e sd e r i v e df r o mt r a n s p l a t e dn e u r a ls t e mc e l l s ， b yt h i ss t u d y , w eg r a f t e dh u m a ng i i a lp r o g e n i t o rc e l l si n t op e r i a r e ao fl a t e r a l v e n t r i c l e si nm o u s e ，w es t u d i e dt h e h i s t o l o g i c a lf e a t u r e s o fh u m a na s t r o c y t e s d i f f e r e n t i a t e df r o mg i i ap r o g e n i t o rc e l l s ，s t u d i e dt h ee l e c t r o p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r so f t h eh u m a na s t r o c y t e s ，s t u d i e dt h es y n a p t i cr e g u l a t i o ni nd e n t a t eg y r u so fh i p p o c a m p u s t h e s er e s u l t sm a yp a v et h ew a yf o ru n d e r s t a n d i n gt h ed e v e l o p m e n ta n di n f l u e n c eo f g l i ac a l l si nv i v o m e t h o d s l 、a n i m a l s s i x t yn e w b o r nr a 9 2m i c ew e r eo b t a i n e df r o mj a c k s o nl a bi na m e r i c a t h e yw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t ot w og r o u p s ：c o n t r o lg r o u pa n dc h i m e r i cg r o u p 2 、c l u t u r ea n dt r a n s f e c t i o n a 2 8 5 + c e l l sw e r et r a n s f e c t e dt oe x p r e s se n h a n c e de g f pb yv s v g - p s e u d o t y p e d l e n t i v i r a l - c m v - e g f pi n f e c t i o n t h ec e l l sw e r em i x e dw i t hl e n t i v i r u so v e r n i g h t f o l l o w e db y3 - 5d a yr e c o v e r y t h ei n f e c t e dc e l l sw i t he g f pe x p r e s s i o nw e r ef o r i m p l a n t a t i o n 3 、t r a n s p l a n t a t i o n c u l t u r e dl e n t i e g f ph u m a na 2 8 5 + c e l l sw e r ed i s s o c i a t e du s i n g0 0 5 t r y p s i na n d r e s u s p e n d e di nt h eh b s s n e w b o r np u p so fr a 9 2m i c ew e r et r a n s p l a n t e dw i t h i nad a y o fb i r t h ( p o s t n a t a ld a y1 ) t h ep u p sw e r ef i r s tc r y o a n e s t h e t i z e da n d1x10 5d o n o rc e l l s w e r ei n j e c t e di n e q u a la m o u n ti n t ot h ep e r i a r e ao fl a t e r a lv e n t r i c l ew i t hg l a s s m i c r o p i p e t t e s 4 、i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n a l y s i s 5 、e l e c t r o p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a ng l i a l c e l l si n c h i m e r i cm i c e w h o l e c e l lr e c o r d i n gi su s e d c a 2 + i m a g i n ga n dp h o t o l y s i so fc a g e dc a 2i s c a p t u r e db y2 - p h o t o nm i c r o s c o p e 7 6 、l o n gt e r mp o t e n t i a t i o n e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l s ( f e p s p s ) a n dl t p i sr e c o r d e d l t pi si n d u c e d b yh f s ( 2t r a i nc o n t a i n i n g10 0p u l s e sa t10 0h z ，3 0sb e t w e e nb u r s t s ) 7 、t n f ai n h i b i t o ri n j e c t i o n as u b s e to fm i c ew e r et r e a t e dw i t ht h a l i d o m i d e10d a y sp r i o rt op r e p a r a t i o no f a c u t eh i p p o c a m p a ls l i c e s 5 0 0m g k g ，i p ，v o l u m e - - 4 ) 2 5 - 0 3m la d m i n i s t e r e dd a i l yf o r 1 0d a y s 3 8 、l e a r n i n gb e h a v i o r t w oc o o m e r c i a lc o n d i t i o n i n gc h a m b e r sw e r ea d a p t e df o rc u e dc o n d i t i o n i n g t h e l a s t3 0s c co fa c c l i m a t i o na n dt h ef i r s t3 0s e c o n d so fs o u n ds t i m u l a t i o nw e r eu s e df o r s c o r i n go fm o u s ea c t i v i t yu s i n gf r e e z e v i e ws o f t w a r e 9 、s t a t i s t i c s a l lv a l u e sa r ee x p r e s s e da st h em e a n + s d s i g m as t a t8 0s o f t w a r ei su s e df o r a n a l y s i so fv a r i a n c e r e s u l t s 1 、h u m a ng l i ap r o g e n i t o rc e l l sb e f o r et r a n s p l a n t a t i o n e g f p e x p r e s s i o n3 6 ha f t e rt r a n s f e c t i o n 2 、d i s t r i b u t i o no fg l i ap r o g e n i t o rc e l l s 6m o n t h sa f t e rt r a n s p l a n t a t i o n ，e g f pp o s i t i v eh u m a ng i i ac e l l sw e r ed i s t r i b u t e d w i l d l yi nm o u s e b r a i n 3 、d i f f e r e n t i a t i o no fg l i ap r o g e n i t o rc e l l s g l i ap r o g e n i t o rc e l l sd i f f e r e n t i a t e di n t oa s t r o c y t e sa n dk e p tt h eh i s t o l o g i c a l f e a t u r e so fh u m a na s t r o c y t e s ：l a r g es i z e ，m o r ep r o c e s s e s ，l o n g e rp r o c e s s e sa l o n gw i t h m i t t h ee n do fp r o c e s s e sw e r et e r m i n a t e do i lv a s c u l a t u r e h n g 2p o s i t i v ec e l l sw e r e f o u n di nh i p p o c a m p u s 。 4 、e l e c t r o p h y s i l o g i c a lf e a t u r e so fh u m a na s t r o c y t e s c o m p a r et om o t l s ea s t r o c y t e s ，h u m a na s t r o c y t e sh a sh i g h e ri n p u t r e s i s t e n c e 8 t h e r ei sn o ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea b o u tt h er e s tm e m b r a n ep o t e n t i a l c a l c i u mw a v e p r o p a g a t i o ni nh u m a na s t r o c y t e si sf a s t e rt h a nt h a to f m o u s e 5 、f e p s pa n dl t p f e p s pa n dl t pw e r ei n c r e a s e di nc h i m e r i cm i c e 6 、i m m u n o s t a i n i n ga n a l y s i sr e v e a l e dt n f aa n d g l u r1e x p r e s s i o n t n f aa n dg l u r lw e r ee x p r e s s e da th i 曲l e v e l sw h i l ea tl o wl e v e l sa f t e r t h a l i d o m i d ei n j e c t i o n 7 、l e a r n i n gb e h a v i o r c h i m e r i cm i c ea r eb e t t e rl e a r n e rt h a nc o n t r o lm i c e u0 n c i u s l o n s 1 、h u m a ng l i ap r o g e n t o rc e l l sd i f f e r e n t i a t e di n t oh u m a na s t r o c y t e sa f t e r t r a n s p l a n t e di n t op e r i a r e ao f l a t e r a lv e n t r i c l ei nm o u s e 2 、h u m a na s t r o c y t e sm i g h tw e r ei n v o l v e di n t of o r m a t i o no fb b bi nm o u s eb r a i n 3 、c a l c i u mw a v ep r o p a g a t i o nw a sf a s t e ri nh u m a na s t r o c y t e st h a nm o u s e a s t r o c y t e s 4 、h u m a na s t r o c y t e sa c c e n t u a t e ds y n a p t i cp l a s t i c i t y 5 、h i g ht n f ae x p r e s s i o nm i g h ti n c r e a s e dm k e y w o r d s g l i ap r o g e n i t o rc e l l ；a s t r o c y t e ；l o n gt i m ep o t e n t i a l 9 英文缩略语 英文缩写英文全称中文全称 d p c p x 8 - c y c l o p e n t y l 一1 ，3 - d i p r o p y l x a n t h i n e 8 - 环戊烷基- 1 ，3 - 二丙基嘌呤 c n q x6 - c y a n o 7 n i t r o q u i n o x a l i n e 一2 ，3 一d i o n e 6 一氰基一7 一硝基喹喔林一2 ，3 - 二酮 d a p 5 2 r a m i n o 5 p h o s p h o n o v a l e r i ea c i d 4 一吡啶胺 t r xt e t r o d o t o x i n河豚毒素 n m d a n - m e t h y l d a s p a r t a t e n 甲基d 天冬氨酸 a m p a a a m i n o 3 h y d r o x y - 5 m e t h y l - 4 a - 氨基一3 - 羟基- 5 一甲基异恶唑 - i s o x a z o l e p r o p i o n i ea c i d - 4 一丙酸 t n ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子 l t p l o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n 长时程增强效应 e p s p e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l 兴奋性突触后电位 g f a p g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n 神经胶质酸性蛋白 n g 2c h o n d r o i t i ns u l p h a t ep r o t e o g l y c a n硫酸软骨蛋白多糖 g l u r g l u t a m a t er e e e p t e r 谷氨酸受体 n rn m d a r e c e p t e r n 甲基d 天冬氨酸受体 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t 酶联免疫吸附实验 a s s a y d a p i 4 ，6 d i a m i d i n o 2 p h e n y l i n d o l e 4 ，6 一联脒一2 - 苯基吲哚 n p e g t a o n i t r o p h e n y le t h y l e n eg l y e o lb i s 焦磷酸钾盐 t e t r a p o t a s s i u m 1 0 论文一 人神经胶质祖细胞移植于小鼠脑内两侧侧脑室周区后 发育成人星形胶质细胞 o - _ - _ _ - 一 刖 吾 中枢神经系统中神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞，少突胶质细胞和小胶 质细胞。在神经系统中不但起着支持、营养、保护的作用，而且还表现调节神经 元生长，神经递质传递，神经元突触电活动等诸多生物学功能【l 】。神经胶质细胞 功能的异常可以直接导致神经系统功能的异常，如脱髓鞘症状，癫痫等【2 别。 神经胶质细胞来自于神经胶质祖细胞，神经胶质祖细胞又由神经干细胞分化 而来【4 1 。近年来，对某些神经系统退化性或损伤性疾病进行神经细胞移植治疗的 探索性研究日益增多，虽然一些研究显示在一定程度上可恢复受损的神经系统的 功划5 6 1 ，然而，对移植神经细胞的种类、移植时间的选择，对移植的细胞如何进 行有效诱导使其分化为目的细胞及其修复机制的探讨仍是此类研究的瓶颈。目前 关于神经胶质祖细胞对神经系统结构和功能重建作用的相关报道仍不充分，对移 植细胞的电生理方面的研究更少有报道。有实验显示在脱髓鞘疾病的小鼠模型脑 内移植人神经胶质祖细胞后，有大量少突胶质细胞生成并产生髓鞘f 7 1 。神经胶质 祖细胞的分化是否受移植环境影响? 本实验关注于神经胶质祖细胞移植后，在正 常脑环境中的分化和形态结构特点，以及其在移植体内生理功能的发挥，旨在为 神经胶质祖细胞的移植分化理论提供实验依据。 。 材料和方法 一、主要试剂 1 、d m e m f 1 2 n 1 ，h b s s ，碱性成纤维生长因子( b f g f ) ( g - i b c o 公司，美 国) ； 2 、来自于1 7 2 2 周的流产人胚的前脑脑室下区的神经胶质祖细膨7 ，8 】+ ( a 2 8 5 细胞) 和c m v - 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，e g f p ) 逆转录病毒 由美国罗切斯特大学的g o l d m a n 教授惠赠； 1 1 3 、小鼠抗人核( h u m a nn u c l e i ，h n ) 单克隆抗体，小鼠抗人n g 2 ( c h o n d r o i t i n s u l p h a t ep r o t e o g l y c a n ) 单克隆抗体，兔抗a 2 8 5 多克隆抗体( c h e m i c o n ，美 国) ，小鼠抗人神经胶质酸性蛋白( h u m a ng l i a l f i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ， h g f a p ) 单克隆抗体( s t e m b e r g e r 公司，美国) ，小鼠抗人线粒体( h u m a n m i t o c h o n d r i a h m i t ) 单克隆抗体( u sb i o l o g i c a l 公司，美国) ，鸡抗层粘连蛋 白( l a m i n i n ) 多克隆抗体( a b c a m 公司，美国) ，d a p i 核染色剂和c y 3 或 c y 5 荧光标记的二抗( j a c k s o n 公司，美国) 。 4 、钙离子指示剂( a l e x a5 9 4 ，r h o d 2 ，o - n i t r o p h 饥y le t h y l e n e g l y c o l b i s t e t r a p o t a s s i u m ( n p - e g t a ) ，i n v e n t r o g e n 公司，美国) 二、主要仪器设备 1 、细胞培养箱和超净台( e d a b 美国) ； 2 、共聚焦显微镜和f l u v i e w3 0 0 图像分析系统( ( o l y m p u s ，日本) ； 3 、 荧光倒置显微镜( o l y m p u s ，日本) ； 4 、 恒温冷冻切片机( l e i c a , 德国) ； 5 、 8 0 深低温冰箱( t o s h i b a ，日本) ； 6 、立体定位微注射仪( u se q u i p m e n tc o ，美国) 。 7 、 双光子激光显微镜( o l y m p u s ，日本) 8 、紫外线激光发生器( u se q u i p m e n tc o ，美国) 9 、电生理描记系统( u se q u i p m e n tc o ，美国) 三、实验方法 1 、实验动物 实验动物为新生2 4 h 以内的r a 醇小鼠6 0 只，雌雄不限，购自美国j a c k s o n 实验室。随机分为两组：实验组和对照组。实验动物的使用和管理均符合美国实 验动物相关规定。 2 、神经胶质祖细胞的培养和转染 a 2 8 5 细胞用d m e m f 1 2 n i 无血清培养基培养，其内加入2 0 n g m lb f g f 。 转染按文献【7 1 的方法进行，将细胞与c m v - e g f p 逆转录病毒孵育过夜，弃上清， 用d m e m f 1 2 n 1 培养液继续培养3 5 天。用荧光倒置显微镜观察，转染成功的 1 2 a 2 8 5 细胞( 表达绿色荧光蛋白) 用于移植实验。 3 、神经胶质祖细胞的移植 转染后的a 2 8 5 细胞用胰蛋白酶消化，离心，弃上清，吹打细胞悬浮于h b s s 中。将出生2 4 h 内的r a 啦小鼠冰上麻醉后【8 】，固定于立体定位仪上，用玻璃微 量加样器将l u l ( 1 x 1 0 5 u 1 ) 的细胞悬液平均注入两侧侧脑室周区( b r e g m a 点后 1 0 m m ，中线旁1 0 m m ，深度1 2 1 5 r a m ) 。对照组小鼠注射同剂量的h b s s 。 4 、免疫组织化学染色 移植6 个月后，将小鼠经4 戊巴比妥腹腔注射麻醉，左心室插管，4 多聚 甲醛灌流固定，取脑，后固定过夜，梯度蔗糖脱水后，制作2 0 u r n 冰冻切片。 切片经驴血清封闭，室温孵育4 0 m i n l 分别加入一抗( h u m a nn u d c i ，i - i nl ： 5 0 0 ；h u m a ng f a p , h g f a p , 1 ：5 0 0 1h u m a nm i t o c h o n d r i a h m i tl ：2 0 0 1l a m i n i n , l ：4 0 0 ；h u m a nn g 2 ，h n g 2 ，1 ：5 0 0 ：a 2 8 5 ，l ：2 5 0 ) ，4 孵育过夜；荧光标记的 二抗( 1 ：2 5 0 ) 室温孵育1 5 小时。d a p i 核染色后，荧光染