（临床医学专业论文）结缔组织病相关肺动脉高压的血清标记物研究.pdf

目录 目录。1 中文摘要2 a b s t r a c t 5 前言7日u 舌7 总技术路线图1 1 第一部分抗膜突蛋白抗体对p a h 的致病性研究。1 2 实验目的1 2 材料与方法1 2 结果2 0 小结2 9 小结3 0 讨论3 0 第二部分圳f 与p a h 的相关性研究。3 3 一m i f 血清浓度与c t d p a h 的相关性3 3 实验目的3 3 材料与方法3 3 结果3 8 。 爿、结4 5 讨论4 5 二m i f 在m c t p a h 大鼠肺组织中的表达4 7 实验目的：4 7 材料与方法4 7 结果4 9 讨 仑4 9 第三部分e n d o g l i n 血清浓度与c 1 d - p a h 的相关性研究。5 1 实验目的5 1 材料与方法5 1 结果5 4 小结6 1 讨论6 1 结论6 3 参考文献。6 4 综j l 蠡7 1 致谢7 9 结缔组织病相关肺动脉高压的血清标记物研究 背景： 中文摘要 肺动脉高压( p a h ) 是结缔组织病( c t d ) 的严重并发症，尽管病理改变与特发 性肺动脉高压( 1 p a h ) 类似，c t d p a h 的预后却差于后者。部分患者的病情经 激素免疫抑制剂治疗后得到缓解，提示c t d p a h 相对i p i a h 而言具有更为显著 的免疫损伤和炎症反应。提高c t d p a h 的诊治水平是当今风湿病学界医师的共 同目标，而寻找c t d p a h 的血清标记物，将对评价疾病发生风险，早期诊断并 及时给予治疗提供重要帮助。抗膜突蛋白抗体属于抗内皮细胞抗体( a e c a ) 中 的一种，我科前期研究提示它在c t d p a h 中有较高检出率，并可能介导血管内 皮细胞的损伤和凋亡；巨噬细胞移动抑制因子( m i f ) 位于炎症反应上游，在多 种自身免疫病( a i d ) 中发挥作用，而它与p a h 的关系目前尚无报道；e n d o g i i n ( e n g ) 是一种膜表面受体，介导的下游信号促进血管生成，近期报道显示其 编码基因e 、g 突变与s s c p a h 存在相关性，血清中可溶性e n g ( s e n g ) 水 平升高可能对s s c p a h 具有提示作用。抗膜突蛋白抗体，m i f ，s e n g 可能通 过不同机制参与c t d p a h 发生，并有望成为后者的血清标记物。 口i 气一 目口：j ： 1 利用人膜突蛋白免疫大鼠，诱导产生抗膜突蛋白抗体，进而验证抗膜突蛋白 抗体对p a h 的致病作用； 2 比较系统性红斑狼疮( s l e ) ，系统性硬化症( s s c ) 患者及健康对照( h c ) 外周血m i f 浓度，结合临床资料，分析m l f 水平与c t d p a h 及其他临床表 现的相关性； 3 比较野百合碱诱导肺动脉高压( m c t - p a h ) 大鼠及正常大鼠肺组织的m i f 含量，初步探寻m i f 与p a h 的关系； 4 比较s le ，s s c 患者及h c 外周血s e n g 浓度，结合临床资料，分析s e n g 水平与c t d p a h 及其他临床表现的相关性。 方法： 1 按照2 5 0 u g 只，5 0 0 u g ，只两种剂量对s d 大鼠进行人膜突蛋白的皮下注射， 第4 周时el | s a 法检测抗膜突蛋白抗体的生成情况；分别于第6 周和第8 2 周行血流动力学检测及肺部病理学检查，以验证抗膜突蛋白抗体对p a h 的 致病作用； 2 酶联免疫吸附法( el i s a ) 法测定s le ，s s c 患者外周血中m i f 浓度，结合 临床资料，分析m i f 水平与c t d p a h 及其他临床表现的相关性； 3 蛋白质印迹( w e s t e m 一引o t ) 法检测m c t p a h 大鼠和正常大鼠肺组织内m i f 的含量，初步探寻m l f 与p a h 的关系； 4 e u s a 法测定s l 已s s c 患者外周血中s e n g 浓度，结合临床资料，分析 s e n g 水平与c t d p a h 及其他临床表现的相关性。 结果： 1 两种剂量的人膜突蛋白皮下免疫2 次后，大鼠均产生抗膜突蛋白抗体；第6 周和第8 周时，免疫组大鼠平均肺动脉压力( m p a p ) 均高于正常，差异显 著( p o 0 5 ) ；活动期s l e 患者的m l f 浓度显著高于稳定期( p = o 0 0 1 ) ；有 指端溃疡的s s c 患者的m l f 浓度高于无指端溃疡患者( p = 0 0 3 3 ) ； 3 m c t - p a h 大鼠肺组织内m ! f 含量与正常大鼠无明显差异： 4 s l e ，s s c 患者s e n g 血清浓度均高于正常对照，差异极显著显著 ( p = 0 0 0 i o 0 4 6 ) ；s l e ，s s c - p a h 与s l e s s c n o np a h 患者的s e n g 浓 度之间不存在显著差异( p 0 0 5 ) ；尚未发现s l e 患者s e n g 升高的临床相 关性；有毛细血管扩张的s s c 患者的s e n g 浓度高于无毛细血管扩张者， 差异显著( p = 0 0 2 6 ) 。 结论： 1 抗膜突蛋白抗体可能对p a h 具有致病作用； 2 s l e 患者m i f 血清浓度升高提示病情活动，s s c 患者m i f 血清浓度升高与 指端溃疡有关，m i f 浓度对c t d p a h 不具提示作用； 3 初步研究显示m c t - p a h 大鼠肺组织中m i f 含量无明显异常，但m i f 是否 参与p a h 发生尚需进一步研究证实； 4 s l e 患者s e n g 血清浓度升高可能提示血管内皮细胞功能失调，s s c 患者 s e n g 血清浓度升高则与毛细血管扩张有关，s e n g 浓度对c t d p a h 不具 提示作用。 关键词： 结缔组织病肺动脉高压抗膜突蛋白抗体巨噬细胞移动抑制因子 4 b a c k g r o u n d a b s t r a c t p u i m o n a r ya r t e r a ih y p e r t e n s i o n ( f l a h ) i sad e v a s t a t l n gv a s c u i a rc o m p i i c a t i o n o fan u m b e ro fc o n n e c t j v et i s s u ed i s e a s e s ( c t d s ) i ns p i t eo ft h es i m i i j a r 耐t o i d i o p a t h i cp 乒h ( i p 望h ) i np a t h o i o g y ，d r u gr e s p o n s ea n dp r o g n o s i so fc t d p 乒婚一l i sm u c hp o o r e r s o m ep a t i e n t sg o tr e e fa 舱rs t e r o i d i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y i n d i c a t i n gam o r ep r o n o u n o e di m m u n i t ya n di n f i a m m a t i o np a t h w a yi n c t d p a h a sp 归hb e c o m i n go n eo ft h em a i nc a u s e so fm o r b i d m o r t a i i t yi n c t d ，ti si m p o r t a n tt of i n ds e r u mm a r k e r sf o rt h i sv a s c u l a rp r o b i e m o b j e c t i v ea n dm e t h o d s 。r ov e r i f yt h ep a t h o g e n i cr o i eo fa n t i m o e s i na n t i b o d yj np a hb yi m m u n i z l n g s dr a t sw i t hh u m a nm o e s i na n t i g e n 1 - od e f i n et h ep o t e n t i a ir o i eo fm a c r o p h a g em l g r a t i o ni n h i b i t o 吖f a c o r ( m i f ) a sas e r u mb i o m a r k e rf o rc t d p a hb yd e t e c t - n gj t ss e r u mi e v e it h r o u g h el | s aa n dc o m p a r i n g tb e t w e e nc 丁d f a ha n dc t d n o np a hp a t i e n t s 。r oe x p i o r et h er o i eo fm i fi nt h ep a t h o g e n e s i so fp 乒hp r e i i m i n a r 1 yb y d e d e c t i n gi t si e v e ii ni u n gt i s s u e st h r o u g hw e s t e r nb l o ta n dc o m p ar i n gi t b e t w e e nm o n o c r o t a n ei n d u c e dp a hr a t sa n dn o r m a lr a t s 4 r od e f i n et h ep o t e n t i a ir o i eo fs o i u b l ee n d o g i i n ( s e n g ) a sas e r u m b i o m a r k e rf o rc t d f 怔hb yd e t e c t i n gi t ss e r u mi e v e it h r o u g he l l s aa n d c o m p ar i n gi tb e t w e e nc t d - p 归ha n dc t d n o np 望hp a t i e n t s r e s u i t s r a t si m m u n i z e db yh u m a nm o e s i na n “g e nh a das i g n i f c a n t i yh i g h e rl e v e i o fm e a np u l m o n a 吖a r t e r i a lp r e s s u r et h a nn o r m a i ( p 0 0 1 ) p a t h o i o g i c s t u d ys h o w e dt h e r ew a st h i c k e n i n go ft h ew a i l so fm e d l u ms i z e da r t er 0 l e s ( a b o u t10 0 u mi nd i a m e t e r ) a n di n f l a m m a t i o ni nt h ei u n g r a ti m m u n i z e d p u r e l yb yc o m p i e t e n c o m p i e t ef r e u n d sa d j u v a n th a v es l j g h t i ye i e v a t e d m f ap ，a n dt h e r ew e r ea l s os o m ei n f l a m m a t i o nc e ss c a t t e r e di nt h ei u n g s e r u mi e v e io fmifw a ss i g n i f i c a n t i yi n c r e a s e di ns l ea n ds s cp a t e n t s 5 4 ( p = 0 0 1 2 ，0 0 2 2r e s p e c t i v e i y ) ，b u tt h e r ew e r en od i f f e r e n o e sb e t w e e n s l e ，s s c f z ha n ds l e s s c n o nf 0 、hp a t j e n t s p a t i e n t si na na c t i v es t a t e o fs l eh a das i g n i f c a n t i yh i g h e ri e v e io fm l ft h a nt h o s ei nq u i e n s c e n t s t a t e ( p = 0 0 0 1 ) s s cp a t i e n t sw h oh a dd i g i t a lu i c e r sh a da ne i e v a t e dl e v e l o fm i ft h a nt h o s ew h oh a dn o t ( p = 0 0 3 3 ) t h e r ew a sn od i f l _ e r e n c eo fm l fi e v e il nt h ei u n gt i s s u e sb e t 、 ，e e n m c t - 尸i a hr a t sa n dn o r m a ir a t s s e r u mi e v e io fs e n gw a ss i g n i f i c a n t i yi n c r e a s e di ns l ea n ds s cp a t e n t s ( p = 0 0 0 1 ，0 0 4 6r e s p e c t i v e l y ) ，b u tt h e r ew e r en od i f r e r e n c e sb e t w e e n s l e s s c p 归ha n ds l e ，s s c n o np l a hp a t i e n t s w eh a v e n tf l n d a n y c n i c a ir e i e v a n c eo ft h ee i e v a t e ds e r u mi e v e io fs e n gl ns l ev e t s s c p a t i e n t sw h oh a dt e i a n g i e c t a s i sh a da ne i e v a t e dl e v e io fm l ft h a nt h o s e w h oh a dn o t ( p = 0 0 2 6 ) c o n c i u s i o n s a n t i m o e s i na n t i b o d ym i g h tp i a yap a t h o g e n i cr o l ei nf a h ，b u ts t i n e e dt o b ev er i f i e db yf u r t h e rs t u d y h i g h e rl e v e io fs e r u mm i fm i g h ti n d i c a t ea na c t i v es t a t eo fs l ew h i i ei t m a yb er e i a t e dt od i g i t a lu i c e r si ns s c w ef a i l e dt op r o v em i fh a v ea p r e d i c t i v ep o t i e n t i a if b rf a hi nc t d i ts e e m s k em i fd i d n tp a r t i c i p a t ei nt h ep a t h o g e n e s i so fp 乒ha st h e r e w a sn od f f l e r e n c eo fm | f ：i e v e ii ni u n gt i s s u e sb e t w e e nm c l p a ha n d n o r m a ir a t s b u tf u r t h e ri n v e s t - g a t i o nj sn e e d e d h i g e ri e v e io fs e n gi ns l em i g h tb er e i a t e dt oe n d o t h e i a ic e d y s f u n c t i o n i ns s ch o w e v er ，e i e v a t e ds e n gl n d i c a t et e i a n g i e c t a s i s w ef a i l e dt 0 i m p r o v es e n gh a v eap r e d i c t - v ep o “e n t i a if o rp a hi nc t d k e y w o r d s c o n n e c t i v et i s s u ed i s e a s e ， p u i r n o n a 吖a r t e r a lh y p e r t e n s i o n ， a n t - m o e s j na n t b o d y ，m a c r o p h a g em i g r a t i o nj n h b - t o 吖f a c t or e n d o g i i n 6 1 2 3 4 1 厶j _ 刖舌 肺动脉高压( p u i m o n a 吖a r i a ih y p e n e n s i o n ，p a h ) 是一种主要累及肺部 小动脉的疾病。具体定义为静息状态下平均肺动脉压力( m e a np u l m o n a r y a r t e r i a ip r e s s u r e ，m p a p ) 2 5 m m h g ，同时肺毛细血管嵌压( p u l m o n a r yc ap | i a r y w e d g ep r e s s u r e ，p c w p ) 1 5 m m h g 。持续升高的p a p 将使肺循环阻力 ( p u i m o n a r yv a s c u i a rr e s i s t a n c e ，p v r ) 增加，最终导致右心衰竭和死亡。 p a h 能发生于多种结缔组织病( c o n n e c l v et i s s u ed i s e a s e ，c t d ) 。系统 性硬化症( s y s t e m i cs c i e r o s i s ，s s c ) ，混合性结缔组织病( m i x e dc t d ) ，系统 性红斑狼疮( s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s ，s l e ) ，类风湿关节炎( r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ，r a ) 是其中常见的四种。尽管c t d p a h 在病理改变上与l p a h 有很 大程度的相似性，但它对血管活性药物的反应以及预后都较后者为差，故已成为 c t d 的重要死亡原因。因此，预测疾病发生风险，早期发现并给予治疗，对提 高c t d p a h 的诊治水平十分重要。而寻找到c t d p a h 的血清标记物，则有助 于风湿病医师接近这一目的。 根据n i h 生物标记物工作组( n i hb i o m a r k e r sd e f n i t i o n sw o r k n gg r o u p ) 的定义，生物标记物是通过客观检测和评价，能够提示正常，病理生理过程或治 疗反应的物质。一个良好的生物标记物应具备如下特征：有助于理解病理机制； 在易感人群中预测发生相关事件的机率；反应治疗效果z 。因此，从疾病的发生 机制出发，将有利于我们寻找到c t d p a h 的血清标记物。 。 尽管机制尚未完全明确，根据现有研究结果，p a h 的发生过程已可大致勾 勒如下：各种因素，如基因缺陷、免疫损伤、或剪切应力等，损伤肺动脉内皮细 胞( e n d o t h e l i a ic e ，e c ) ，这是p a h 发生的初始事件。此时，若再受到免疫耐 受紊乱及炎症反应的“二次打击”，己受损的e c 开始凋亡，释放各种介质促使 残余e c 抗凋亡化，并诱导肺动脉平滑肌( p u l m o n a 吖a r t e r l a ls m o o t hm u s c i e c e ，p a s m c ) 增生移行，进而出现新生内膜及丛样病变等p a h 的特征病理改 变3 。 p a h 的病因是多元化的，而部分c t d p i a h 患者的心肺症状在接受激素及免 疫抑制剂治疗后得到缓解，提示免疫机制及炎症反应在c t d p a h 发生中的地位 可能较在其他种类p a h 中更为重要。另外，近年来，有研究者报道e h d d 咖基 因突变与s s c p a h 存在相关性4 ，且有散在报道提示该基因的表达产物e n d o g i n 的血清水平升高有可能提示s s c p a h w 。因此，本研究将从免疫损伤，炎症反 应及e r ，d o g 仃基因编码蛋白e n d o g i n 这三方面探寻c t d p a h 的血清标记物。 7 一、自身抗体与c t d p a h 自身抗体( a u t o a n t b o d y ) 是c t d 的重要特征，致病性自身抗体不仅成为 相关疾病的诊断标记，还能预测靶器官损害的发生风险。而e c 在p a h 发生中 的关键地位，使能够诱导e c 凋亡7 和促进粘附因子产生8 的抗内皮细胞抗体 ( a n t i e n d o t h e i i a ic e a n t b o d y ，a e c a ) 一度成为研究热点。a e c a 是一组能 识别e c 表面多种抗原的抗体总称，高度异质性限制了a e c a 的特异性，多种 自身免疫病、感染性疾病、血管病患者体内都存在a e c a ，甚至健康人群中也能 检测到a e c a 的存在9 。尽管如此，a e c a 识别的抗原，却有可能具有疾病特异 性。有研究者报道a e c a 在i p a h 和s s c p a h 中识别不同抗原1 0 。我科既往研 究则发现a e c a 识别的7 8 k d 抗原条带对c t d p a h 患者具有较高特异性，经分 离纯化鉴定，该抗原为膜突蛋白”。 膜突蛋白( m e m b r a n e o r g a n i z i n ge 娥e n s i o ns p i k ep r o t e i n ，m o e s i n ) 是19 8 8 年在牛的子宫平滑肌细胞中被首次发现的，理论分子量为6 8 k d ，实际分子量为 7 8 k d ，等电点6 0 8 ，由5 7 7 个氨基酸残基组成，在细胞中以休眠和激活两种状 态存在，第5 5 8 位苏氨酸残基( t ) 磷酸化被认为是其激活的方式。m o e s i n 是 e r m 蛋白家族( e z r i n ，r a d i x i n m o e s i n ，埃兹蛋白，根蛋白膜突蛋白) 中的成员， 该家族蛋是连接细胞皮质层肌动蛋白细胞骨架与质膜上整合膜蛋白的桥梁分子。 三者常联合表达于许多细胞膜突出部位，如伪足，微绒毛等，对于维持细胞骨架 及运动都起到重要作用1 z 。 我科缅胞水平的研究提示抗膜突蛋白抗体可自邑通过诱导肺微血管内皮细胞 早期凋亡和改变细胞骨架结构而引起细胞损伤1 1 。通过建立抗膜突蛋白抗体的检 测方法，我们进一步发现抗膜突蛋白抗体与c t d 肺部损伤( p a h l l d ) 只有显 著相关性佰。 至此，抗膜突蛋白抗体已经展现了其作为c t d p a h 血清标记物的潜力。如 果进一步研究能证实其对p a h 致病性，该抗体无疑将成为预测c t d p a h 发生 风险的重要标记。本研究的第一部分则计划利用人膜突蛋白免疫大鼠诱导抗膜突 蛋白抗体产生，通过血流动力学检测和病理学检查以明确抗膜突蛋白抗体是否具 有导致p a h 发生的作用。 二、炎症因子与c t d p a h c t d 的另一重要特征是全身炎症反应。近年来，人们越来越清楚的意识到 处于炎症瀑布反应上游的炎症因子对疾病发生起关键作用，并能提供较为理想的 治疗靶点。抗肿瘤坏死因子吨( t u m o rn e c r o s i sf a c t o 卜a ，t n f a ) 单抗应用于 r a 的治疗正是这样的成功案例。p a h 病变处存在单核，巨噬细胞，t 、b 淋巴细 8 胞浸润，提示固有免疫及获得性免疫均参与其中。已有研究证实重度i p a h 患者 外周血中多种炎症因子，如m i p 1a ，l l 一1p ，及i l 6 等的水平升高。另外，趋化 因子( 如c x 3 c l l ，c c l 2 等) 也被证实能募集单核，巨噬细胞至病变血管周围， 并促进p a s m c 增生移行1 4 。既然炎症反应在p a h 发生中发挥举足轻重的作用， 那么，在炎症反应剧烈的c t d 中，是否也存在一种炎症因子，在p a h 的发生中 起关键作用，并有望提供治疗靶点? 巨噬细胞移动抑制因子( m a c r o p h a g em i g r a t l o ni n h b i t o 哼f a c l o r ，m l f ) ， 一种最初认为由活化t 细胞产生并能抑制巨噬细胞移动的因子，因其可能参与 多种自身免疫病( a u t o i m m u n ed i s e a s e ，a i d ) 的发生而越来越受到重视。经研 究发现，m i f 主要来源于单核，巨噬细胞，另外也能由淋巴细胞，中性粒细胞等 多种细胞生成。一般情况下，m l f 储存于细胞胞浆中，一经外界刺激，无需合成 直接快速释放，并通过旁分泌和自分泌形式促进多种炎症因子，如t n f a ，i l 一1 b ， i l 一8 或l l 一1 2 等的产生。m i f 的这些特性使它成为处于炎症级联反应上游的重要 因子，在固有免疫及获得性免疫中均发挥作用1 5 。m i f 水平在包括r a ，s l e ， s s c ，血管炎等在内的多种a i d 中升高。在r a 中，m l f 通过抑制促凋亡基因 p 5 3 的表达，扩大炎症反应，以及活化t 细胞等机制促进滑膜细胞增生。动物实 验已证实以m i f 为靶向的治疗可能对r a 和s l e 有效1 5 。 m i f 是否在p a h 的发生中发挥作用，目前尚无相关报道。仅有研究者通过 体外实验证实m i f 具有减少大鼠p a s m c 产生前列环素( p r o s t a c y c i i n ，p g l 2 ) ， 导致血管收缩的作用17 ，提示m l f 可能参与p a h 的发，。既然p a h 病蛮血管 周围存在大量单核，巨嗜细胞，t 、b 细胞浸润，而后者都是m ；f 的主要来源细胞； 另外，p a h 的发生需要多种炎症凶子参与，而m l f 又位于炎症反应的上游；最 后，目前m i f 己成为具有潜力的治疗靶点。这些事实让探索m i f 与p a h 的关系 显得十分有必要。因此，本研究第二部分计划从临床和基础两方面初步探索m i f 与p a h 的关系。 三、e n d o g n 与c t d p a h e n d o g i i n ( e n g ，又称c d l 0 5 ) ，是一种跨膜二聚体糖蛋白，属于转化生长 因子一b ( t r a n s f o r m i n gg r o v v t hf a c t o 卜p ，t g f p ) 受体超家族中的成员。除细 胞膜表面受体形式外，e n g 还能以可溶性形式( s o i u b i ee n d o g i n ，s e n g ) 存 在于血循环中。e n g 是一种辅助受体，辅助骨形态发生蛋白( b o n e m o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ，b m p ) 与其型受体( b m p r i i ) 及a l k l 受体结合， 三者共同启动下游信号，发挥促进血管生成( a n g i o g e n e s i s ) 作用。而s e n g 通 过竞争性抑制作用干扰这一信号通路1 8 。 9 e n d o g i n 的编码基因是e 仃d 0 们( e g ) 基因。与e g 基因突变有关的 更为人所熟知的疾病是1 型出血性毛细血管扩张症( h e r e d i t a 吖h e m o r r h a g i c t e l a n g i e c t a s i a ，h h t - 1 ) ，而w i p f f 等人最近却发现e w g 基因多态性( 位于第7 号内显子的6 个碱基的插入突变) 与s s c p a h 存在相关性4 。根据最新的p h 分型( d a n ap o i n t2 0 0 8 ) 1 9 ，目前与p a h 相关的突变基因有三个：b m p 帛， a l k l 和副g 。有趣的是，这三个基因编码的蛋白正是t g f p 信号通路传递中 缺一不可的三个受体，显现了该信号通路在p a h 发生中的重要地位。b m p 帛， 似上a l k 7 似) 通过单倍剂量不足减少相应受体表达，削弱下游信号传导 从而导致尸a h 发生。尽管e g 突变的功能目前尚不清楚，我们可以推测 s s c - p a h 中e n g 的表达或状态发生了改变。而作为抑制e n g 传导信号的 s e n g ，它的血清浓度有无改变，这种改变能否提示p a h 的存在是值得探寻的 问题。 事实上，已有散在的报道，提示s e n g 水平升高可能与s s c - p a h 有关，但 结果不完全统一嘶。因此，本实验的第三部分计划探寻s e n g 与s s c p a h 的相 关性，同时将s l e 患者也作为研究对象，探寻s e n g 是否也对s l e p a h 具有 提示意义。 综上，本实验研究将分别从免疫机制，炎症反应和关键信号通路成员这三方 面探寻c t d p a h 的血清标记物。 l o 总技术路线图 c t d p a h 血清标记物研究 一、 免疫机制炎症因子信号通路成员 抗m o e s i n 抗体 m l f e n d o a l i n v 动物实验组织学水平血清水平血清水平 i 1r w e s t e mb i o t 测 e l i s a 钡0 定s l e ， e l i s a 澳0 定s l e ， 定m c t p a h 大 s s c ，h c 外周血s s c ，h c 外周血 m o e s j n 免疫大鼠 鼠及止常人鼠肺 m i f 浓度 s e n g 浓度 上 。 组织m f 含量， 比较两者的筹异 上0 血流动力学检测 结合临床资料，分析m i f ， 病理h e 染色 s e n g 东平与c t dp a h 及 免疫组化 其他临床表现的相关性 1r 1，土 验证抗m o e s i n 抗体 探寻m i f 与p a h 的验证s e n g 与 对p a h 的致病作用关系 c t d p a h 的关系 第一部分抗膜突蛋白抗体对p a h 的致病性研究 实验目的 通过人膜突蛋白免疫大鼠，诱导产生抗膜突蛋白抗体，进而探寻抗膜突蛋白抗体 对p a h 的致病作用。 材料与方法 一、实验材料 1 实验动物 雄性s p r a g u e d a w i e y 大鼠由维通利华公司提供。大鼠专用饲料由北京大学 医学部动物中心提供。大鼠饲养于s p f 级动物房，清洁饮水，除说明的情 况外自由取食。环境采用十二小时明暗循环，早七点到晚七点照明，晚七点 。到次日早七点无照明。所有动物实验都按照北京市动物实验管理条例进 行。 2 实验主要试剂 1 人膜突蛋白( m o e s i n ) 原溶液 由上海富纯中南生物技术有限公司提供，浓度和2 6 6 m g m i ( 第一批) 和0 6 1 8 m g ，m i ( 第二批) ，共约8 0 m g ，- 2 0 保存。 2 野百合碱( m o n o c r o t a i n e ，m c t ) 购自美国s i g m a - a i d r i c h 公司，纯度9 9 ，规格1 0 9 ，4 避光干燥保 存。 3 福氏完全佐剂( c o m p i e t ef r e u n d sa d j u v a n t ，c f a ) 、福氏不完全 佐剂( i n c o m p i e t ef r e u n d sa d j u v a n t ， i f a ) 购自美国s i g m a - a i d r i c h 公司 4 辣根过氧化物酶标山羊抗大鼠i g g 购自北京中衫会桥生物技术有限公司，4 保存 5 兔超敏二步法免疫组化检测试剂 1 2 购自北京中衫金桥生物技术有限公司，4 保存 6 抗平滑肌抗体( a n t i - s m aa n t b o d v ) 购自a b c a m 公司 7 抗膜突抗体e l l s a 试剂盒 由上海富纯中南生物技术有限公司提供，试剂盒组成及保存如下： 样品稀释缓冲液1 瓶4 浓缩洗涤缓冲液( 1 0 )1 瓶4 显色剂a1 瓶 4 显色剂b1 瓶4 终止液1 瓶4 抗原包被板( 可卸)9 6 孔，板 4 3 实验主要仪器 动物机能实验压力传感器成都泰盟科技有限公司 b l 4 2 0 生物机能实验系统 倒置相差显微镜n i k o n ，j a p a n 1 4 2 动物模型的建立 2 1 阳性对照组：m c t 诱导大鼠p a h 模型的建立 1 m c t 溶液配制：称取一定质量的m c t ，溶解于一定体积0 5 n 的盐酸 中，待溶解完全后，用1 mn a o h 调节p h 至7 2 7 4 。最后用灭菌后 的蒸馏水稀释至终浓度为1 。避光保存于4 。 2 模型建立：选取体重2 2 0 2 5 0 9 的s p 阳g u e d a w i e y 大鼠10 只，根据 体重计算每只动物的给药量。按照6 0 m g k g 的剂量背部皮下注射m c t 一次( 第0 天) 。第2 1 天取大鼠进行血流动力学检测并采集组织标本。 2 2 实验组：人膜突蛋白免疫大鼠 1 人膜突蛋白溶液配制：吸取蛋白原液，与一定体积的生理盐水混合，配 制成1 m g m i 的蛋白溶液，再与福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂按照1 ：1 等体积混合。混合时用三通管连接两个注射器反复推注，直到成为乳白 色均匀油包水混合液。此时膜突蛋白溶液浓度为5 0 0 u g ，m l ，用于5 0 0 u g ， 只的剂量组注射；吸取一定体积1 m g ，m l 的膜突蛋白溶液，与生理盐水 等体积混合，配制成5 0 0 u g ，m i 的蛋白溶液，以同样方法与福氏完全佐 剂，福氏不完全佐剂按照1 ：1 等体积混合，所得浓度为2 5 0 u g ，m i 的溶液 用于2 5 0 u g 只的剂量组注射。 2 免疫动物：吸取配制好的相应浓度的蛋白溶液1 m i ，于大鼠背部，两侧 腋下及腹股沟处进行多点皮下注射。首次免疫记为第o 周，分别于第2 周和第4 周进行2 次加强免疫。首次免疫使用与福氏完全佐剂混合的蛋 白溶液，加强免疫使用与福氏不完全佐剂混合的蛋白溶液。分别于第6 周和第8 周取大鼠进行血流动力学检测并采集组织标本。 2 3 佐剂对照组： 将福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂按照2 1 2 中的步骤与生理盐水1 ：1 等体积 混合。给药方法同前。 3 大鼠血清的留取 分别于给药前，处死时采集所有大鼠血清。另外，第1 次加强免疫后2 周 ( 第4 周) 采集实验组动物血清以检测抗体产生情况。除处死时采用颈内动脉放 血法外，其余时间点的血清采集均使用内眦取血法：固定大鼠，用内径为o 5 m m 的毛细玻璃管扎入大鼠内眦，留取约1 m i 全血至e p 管，4 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟， 分装血清，一2 0 冻存。 4 大鼠血流动力学检测 1 动物麻醉：用体重仪称取大鼠体重，以1 2 5 0 m g ，k g 的剂量计算所需2 5 乌拉坦，用5 m l 注射器吸取后腹腔注射。 2 颈动脉插管测血压：在右颈外静脉内侧靠近正中线旁更深处分离出右颈 内动脉，小心分离与其伴行的右迷走神经，双线绕过动脉，远端结扎， 近端活结准备。在近端活结的近心端用动脉夹夹闭动脉，小剪刀4 5 。 剪开动脉壁，将另一根微导管插入动脉，导管越过活结后系紧活结，然 后打开动脉夹，再将导管深入动脉一定长度，观察显示屏上出现血压波 形，稳定一段时间后，拔出至活结处，然后用动脉夹再次夹住动脉后， 完全拔出导管。上述压力波形经b l 4 2 0 e 系统记录并保存。 、 3 右心导管测肺动脉压：将微导管连接到换能器上再连接于b l 4 2 0 e 系 统，调零，肝素盐水润管。将麻醉好的大鼠固定在鼠板上，剪开右侧颈 部皮肤，分离皮下组织直至分离出右颈外静脉，双线绕过静脉，远端结 扎，近端活结准备。小剪刀4 5 。剪开静脉壁，将微导管插入静脉中( 弯 曲的导管头向上) ，将近端活结系紧以固定微导管。向近心端深入导管 的同时，观察显示屏，当出现典型心房压力波形时则进入右心房( 插入 深度约2 5 c m ) 。向左旋转导管，使导管头向左，再往里深入，直至显 示屏上出现典型的心室压力波形，说明进入右心室。然后控制好导管， 让其随着血流逐渐往前进入肺动脉，直至出现典型的肺动脉压力波形， 稳定一段时间后，拔出导管。 4 测压结束后，立即进行组织标本采集。 5 组织器官的采集和保存 将大鼠腹面朝上固定四肢，剪开腹腔和胸腔，将两侧肋骨连同胸骨除去， 充分暴露心脏。将右心房剪破，用挂在两米高处与输液瓶相连的输液针 头刺入右心室，先用高压灭菌过的p b s 冲洗循环中残留的血液。m c t 组大鼠留右肺上叶和中叶，液氮速冻，8 0 保存，用于提取总蛋白备实 验第二部分所用。 p b s 冲洗后，换成4 多聚甲醛灌流对全身组织器官进行原位固定，时 间约为3 5 m i n 。固定充分后取左上肺，4 保存于4 多聚甲醛中，2 4 小时内用石蜡包埋。 1 6 6