（人体解剖与组织胚胎学专业论文）成人毛囊器官培养、干细胞分选及其增殖分化调控的研究.pdf

生里堡塑垦翌查兰堕主兰垡笙茎 ! 英文缩略词表 a m p b c i p b s a c d n a d d c s d e p c d m e m e b e c m e d l l a f c s h h e k c k d a l b l r c m l n m m p m r n a n b t 0 d p a g e p b s a m p i c i l l i n 5 - b r o m o - 4 一c h l o l o - 3 一i n d o y lp h o s p h a t e b o v i n es e r u ma i b u m i n c o m p l e m e n t a r y d n a d a y a v i d i nde e l ls o r t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d u l b e c c om o d i f i e de s s e n t i a lm e d i u m e t h i d i u mb r o m i d e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d f e t u sc a l fs e r u m h o u r h e m a t o x y l i n - e o s i n k e r a t i n o c y t e s k i l o d a l t o n l u r i ab e r t a n i l a b e l - r e t a i n i n gc e l l s m i n u t e m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e m e s s e n g e r r n a n i t r o t e t r a z o l i u mb l u ec h l o r i d e o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i n ee l e c t r o p h o r e s i sg e l p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 氨苄青霉素 5 溴4 氯3 吲哚磷酸 牛血清白蛋白 互补脱氧核糖核酸 天 抗生物素蛋白细胞分类剂 焦碳酸_ - 7 , n d m e m 培养基 溴化乙锭 细胞外基质 乙二胺四乙酸 胎牛血清 小时 苏木素一伊红 角质形成细胞 千道尔顿 l b 培养基 标记滞留细胞 分钟 基质金属蛋白酶 信使核糖核酸 氯化硝基四氮唑蓝 光密度 聚丙烯酰氨凝胶 磷酸盐缓冲液 中国协和睡科大学博士学位论文 4 p p d p v p r p m r n a s e s s d s s s e t a c s t b e t b s t b s 玎 t e 鹭 嚣 n i s p - p h e n y l e n e d i a m i n e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e r o u n d p e r m i n u t e 瓮谗o n u l e a s e s e c o n d s o d i u m d o d e e y l s u l f a t e s o d i u m c h l o r i d e , s o d i u mc i t r a t eb u f f e r t r a n s i e n ta m p l i f y i n gc e l l s 心i s c 1 ，b o r a t e ，e d t ab u f f e r 豫sb u f f e rs o l u t i o n n i sb u f f e rs o l u t i o n t w e e n2 0 n is c l 。e d t ab u f f e r t r i s t c l ，s o d i u mc h l o r i d e , e d t a b u f f e r t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 嚣辇二簸 聚乙烯吡咯烷酮 每分钟转数 菝骧族酸黪 秒 十二烷蒸磺酸钠 蕊纯镳柠壕酸镳 短暂增殖细胞 t r i s c 1 硼酸e d t a 缓冲液 t f i s 蕊缓淬液 含t w e e n 2 0 的t r i s 盐缓冲波 t r i s c 1e d t a 缓冲波 t r i s t c i 裁仡镳e d t a 缓淬液 三羧荦基氨基甲烷 中国协和医科大学博士学位论文 成人毛囊器官培养、 干细胞分选及其增殖分化调控的研究 磺究生： 导师： 仇文颖 许增禄 中文接要 皮肤是入体最大的器官，亳和发燕哺乳动物特脊的，生长予全身皮肤表面的角 化兹丝状续擒，为表皮愆生熬黔属器襄。毛囊结搀复杂，含有上皮成分( 毛母质和 外根鞘) 和其皮成分( 真皮乳头和结缔组织鞘) 的至少七种细胞。毛囊在机体的一 生中僳持周期性鸯长，簿一周期包括斑长期( a n a g e n ) 、邋亿翳( c a t a g e n ) 静止期 ( t e l o g e n ) 秘黢落焱( e x o g e n ) 。这裁鬟要毒戆生缨戆不叛饯蛰毵亡纲您。在缎织更 新过程中，需要予细胞( s t e mc e l l ) 的不断增殖和分化，维持干细胞群体的大小， 分化出子细胞，保持总的细胞群体的恒定和备种生理功能。研究琵囊干细胞如何增 蕴与分纯及其调控辊潮对于实凌毛发褥生及挺进羧伤疫默功戆与续梭瓣完全修复 意义重大。耄囊周期性生长以及干细胞的增殖分化的调节涉及了多条途径的交互作 用。对其分子机制的研究困难在于难以获得满意的模型。 鞫茂，零研究善先通过毛鬓俸舞嚣富鏊臻养载模型探讨了敏臻定袁笔囊瘸期中 的作用以及可能机制。将从正常人头皮皮下层拔出的毛囊置于光血清培养基中培 养，生长状况良好，并殿不可控制的因素较少，可保证实验的重复性。对照缀笔囊 在熬个涪养麓闻平均疆长o 。1 9 + 0 0 2 r a m ，瑟t o l _ t g m l 及1 9 9 m l 瓣敏聚定缀分裂增 长0 2 1 0 0 2 r a m 和0 3 1 0 0 3 r a m ，对毛囊艇长有烂著的促进作用( p 0 0 5 ) 。证实 了敏乐定对毛囊生长的促进作用。同时发现，对照组在后期出现笔乳头浓缩，与毛 球躐离延长等现象，挺示毛囊裔逶纯期发震，焉敏笨定缀遮纯期豹遴矮较缓浚。提 示敏乐定对毛囊生长的促进作用可能是通过延缓遇化期的出现丽实现的a 酱味酸天狼黛红染甑以及免疫细胞化学染色显示：随着毛囊培养时间的延长，i 中国协和医科走学博士学位论文6 壅胶鞭的表达减弱，敏乐定可戳部分季霉稍这种表这减少。胶嚣减少静嗣辩，毛囊中 m m p l 的表达增加，敏感定可抑制m m p 一1 的过度增加丽抑制胶原含最的减少。i 型胶原的减少正是与培养龟囊形态学上从生长期向退化期的转化相伴行的。敏乐定 对胶缀表达减少静筛翻髂瘸扶菇方磷说胬了它延缓毛囊逡久运纯期静作焉。t g f 1 免疫细激化学染色发现，培券前毫囊内只能见到外根鞘的最外层极弱的t g f l 3 1 阳性信号，培养7 天后，对照组毛囊外根鞘以及罨乳头处的t g f 1 31 表达明艇增 强，类似于斑长晚鞭和退亿麓。敬乐定缝矫裉鞘t g f l 表达增热程度较对照缀低， 毛乳头处t g f t 31 表达增热不明显。提示对照组培养后期毛囊中t g f8l 表达水平 增高，促使范囊发生退化期的形态改变。敏乐定组t g fb1 表达水平虽有增高，但 程度较低，毛囊的邋纯期改变也发生褥较晚，即毛瀵的生长期褶时延长，毛囊长度 熬增长与对照组相比毒爨萋差爨。困戴在毛囊体步 嚣害培棼鲍摸趟中，教乐定鼹终 用是通过抑制t g f 1 31 的过度表达，延缓毛巍进入退化期而延长了毛囊生长的时间 实现促进作用的。 零磁究中还发现经臻游7 天爱毛囊3 l 整合素窝k 1 9 袋运均降l 囊。说明奁培养 过程中干细胞的减少。敏乐定对1 3 1 整合素和k 1 9 的表达没有明驻的影响，因此它 对毛囊生长的促进作用可能与b l 整合索和k 1 9 的关系并不密切。 茭次，本疆究鹭次建立了抉速糕瓣法分逸乏囊予缨您戆方法，并诺致探讨t c a t e n i n 信号分予在毛囊干细胞的增魈分化调节中的作用以及可能的信号途径。利 用干细胞粘附能力强的特点，将毛囊细胞悬液接种于包被有人胶原的平板中，对不 蔺簿阗内精辫上豹缀琵遴往检测。结豢发瑰，遮羞糕辫惑闼载延长，糕辩绥鼹数量 逐渐增多，其中表达毛囊干细胞标志物k 1 9 的细胞数量增加而k 1 9 阳性细胞占所 有粘附细胞的比例逐渐减少。粘附2 0 r a i n ，快速粘附的细胞干细胞标志物k 1 9 的表 达鞍米分遗静绥魏增蕊1 6 穰，壳隆彩戏率臻窳3 5 倍，嚣且瑟形成酶缨蕤竞篷孛 大竟隆的e 例也增加。这些结果提示，本研究所采用的糙附分选方法对于富集毛囊 干细胞有明显的效果。 凳了躐察经嵇辩劳逸嚣毛囊缩庭- c a t e n i n 静交达情潺，本繇究稳用免疫缎耱诧 学期原位杂交的方法从爨自质謦hm r n a 水平进行了检测。结果湿示，快速粘附细 胞核中0 一c a t e n i n 强白水平有所增加，提示1 3 ，c a t e n i n 蛋白参与了于细胞增殖的调控。 中豳协和医科大学博士学位论文7 丽m r n a 则没镩显著改变的服因在于，细胞内b c a t e n i n 蛋白的分布与含量的调节 主黉是逶遘对c a t e n i n 蠢囱懿稳定馥避行调节瑟实凝静。为了遴步探讨 c a t e n i n 的作用及其机制，本研究利用含有氨基端突变的b 。c a t e n i n 的淡达质粒对未 经分选的毛囊细胞进行了8 c a t e n i n 基因转染。结果发现，转染后的琵囊细胞核内 叠c a t e n i n 表达增高。转染绸稔克隆形藏率嚼显增熬，其中大壳隆酌瀣加并不明嚣。 k 1 9 的表达虽肖增加但程度也较低。提示范囊细胞核内b c a t e n i n 的增加促进了细 胞的分裂增殖，但劳没有使予细胞增如，熙可能是键进了于细胞的分裂分化。与溉 往的实验研究缩祭相符，避一步说明了零，c a t e n i n 对予缁胞的增殖与分化静促进 乍 用。 为了了解8 。c a t e n i n 促避缨照增殖分化作用的分予机制，本研究利用w e s t e r n b l o t 以及原位杂交的方法稔溯了1 3 c a t e n i n 作为转录爵予所调节酶鹜的基函e m y c 裁因的表达情况。结果显示，转染突变的d c a t e n i n 后嘏囊细胞c m y c 蛋白表达凝 明驻增搬，m r n a 承平也同搀增翔，提示8 c a t e n i n 鲍增翘程进了c - m y c 基因表达 的转录与龋译，从而推论出。c a t e n i n 对魄囊细胞增藏分化的促进作用是通过促进 c - m y c 基因的袭达实现的。 总之，本磅究利用毛囊嚣害培养躲模型涯实了敏乐定怼毛囊生长豹捉进终用， 蓠次观察到了它在此模型中对胶原代谢的影响，它的俸粥机制可能怒通过抑制t g f 01 的过度表达而延缓毛囊i 羼化期的出现，从而相对惩长了毛的生妖期。本研究还 罄次建立了恢逮旗隧法分选豫囊于细魏豹方法，说明了1 3 - c a t e n h l 瓣远囊予缨貔增 麓分化的促进作用是通过上调c - m y c 基因袭达实现的。这种细胞分遗方法的建立将 为能全面理解干细胞在毛囊形态发生及周期性生长，髅歪表皮、皮脂腺持续自我鼹 毅中静分予事 警打下蟊蟹熬爨础，最终壤缝织工程学瘦建予疫获疾瘸潼疗及损谯修 鬣成为可能。 中国协和医科大学博士学位论文8 s t u d y o nt h e w h o l e - o r g a n c u l t u r eo fa d u l th a i rf o l l i c l ea n d r e g u l a t i o no f s e l e c t e ds t e mc e l l sp r o l i f e r a t i o na n d d i f 亿r e n t i a t i o n p h d c a n d i d a t e ：q i uw e n y i n g s u p e r v i s o r ：z e n g l u x u a b s t r a c t s k i ni st h e l a r g e s to r g a ni nh u m a nb o d yh a i ri s t h ek e r a t i c f i b e r l i k e ，m a m m a l s p e c i f i co r g a nd e r i v e df r o me p i d e r m i s ，w h i c hg r o w so nt h es u r f a c eo fw h o l es k i n s t r u c t u r eo fh a i rf o l l i c l ei s c o m p l e x ，c o n t a i n i n ga tl e a s ts e v e nt y p e so fc e l l si n c l u d i n g e p i t h e l i a lc o m p o n e n t s ( h a i rm a t r i x c e l la n do u t e rr o o t s h e a t h ) a n dm e s e n c h y m a l c o m p o n e n t s ( f o l l i c u l a rp a p i l l aa n dc o n n e c t i v et i s s u es h e a t h ) h a i rf o l l i c l ek e e p sc y c l i n g g r o w t ht h r o u g h o u tl i f e e a c hc y c l ei n c l u d e sa n a g e n ，c a t a g e n ，t e l o g e na n de x o g e nw h i c h r e q u i r e st h er e p l a c e m e n to f d i e dc e l l sw i t hn e wc e l l s d u r i n gt h es e l f - r e n e w i n go f t i s s u e s ， s t e mc e l lm u s t k e e pp r o l i f e r a t i n ga n dd i f f e r e n t i a t i n gt om a i n t a i n t h ea m o u n to fs t e mc e l l s a n dt og e n e r a t ed i f f e r e n t i a t e dc e l l si no r d e rt om a i n t a i nt h et h en u m b e ra n dt h ef u n c t i o n s o ft h ec e l l s i t so f g r e a ts i g n i f i c a n c et oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s m so fp r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no fh a i rf o l l i c l es t e mc e l l sa n dt h e i rr e g u l a t i o nf o rh a i rr e g e n e r a t i o na n d r e p a i ro fs k i ns t r u c t u r e sa n df u n c t i o n sa f t e ri n j u r y t h er e g u l a t i o no f h a i rf o l l i c l ec y c l e a n ds t e mc e l l s p r o l i f e r a t i o n a n dd i f f e r e n t i a t i o ni n v o l v ei nt h ei n t e r a c t i o no fm a n y p a t h w a y s am a j o rc h a l l e n g ef o rt h er e v e a l m e n to f m o l e c u l a rm e c h a n i s mi st oe s t a b l i s ha s a t i s f i e dm o d e l f i r s t ，t h ee f f e c t so fm i n o x i d i lo nh a i rf o l l i c l ec y c l ea n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s m s w e r ei n v e s t i g a t e di nh a i rf o l l i c l ew h o l e o r g a nc u l t u r em o d e l h a i rf o l l i c l e sw e r e p l u c k e d f r o mn o r m a lh u m a n s c a l pa n dp l a c ef r e e f l o a t i n gi ns e r u i t lf r e ec u l t u r em e d i a t h el e n g t h o fh a i rf o l l i c l e si n c r e a s e do na v e r a g eo f0 1 9 o 0 2 r a mi nc o n t r o lg r o u p h a i rf o l l i c l e s 中国协和医科大学博士学位论文9 c u l t u r e dw i t h l 0 l g l m lo r1 娑g m lm i n o x i d i li n c r e a s e do na v e r a g eo fe 。2 1 0 0 2 n m ：a n d 0 , 31 o ，0 3 m ms e p e r a t e l y , m o r er a p i d l yt h a nc o n t r o l ( p 露囊虽巍1 9 ( k e r a t i n1 9 ，k 1 9 ) 1 9 , 2 翻。1 9 9 8 年又钠又发现c 8 1 4 4 b 中圜协和医科大学博士学位论文1 4 单克隆抗体识别的角蛋白1 5 ( k e r a t i n1 5 ，k t 5 ) 也是其特异性的标志，而且很可能 是受原始懿予缎藏标志，箕密凝魄k 1 9 逐黉翠瑟1 1 。 白1 9 6 7 年b r i g g a m a n 建立了皮肤角质形成细胞体外培养方法后，随着体外培漭 技术及条件的不断改善，角艨形成细胞培荐由单纯的液体浸没培养，发展出空气一 液体交界西培养 2 2 1 。这释方法也逐渐盛丽弼毛囊焦凌形成绥魔及予缁胞的墙养方 磷，为人们研究氇囊干细胞提供了方便。目前，大量体外研究致力予堆囊角质形成 细胞与毛乳头绒胞的相互作用，及俸外患囊重建。体外培养可产生类似毛囊的结构 傻凭毛发产生f 2 弧。成年人的怒囊干细胞属于成年于缀簸，数量小，缑难分离和缝化。 根据毛囊干细胞的形态特点和表面标志，肖这样几种分离方法：如密度梯度离心， 纲脆离心淘洗技术( c e n t r i f u g a le l u t r i a t i o n ) ，流式细腿术( f l o w c y t o m e t r y ) 等 2 4 1 。密 度梯度离心静方法己使雳多年，分离效率中等，而盈掰需设备篱革，僵最大的闻禳 娥获得的细胞纯度低。尤其肖需要长期培养时效果差，因为其中污染的间质细胞， 如成纤维细魏，在有血清的椽准培养条传下生长明显抉予角质形成绷腿，j 嚣于纲臌 的培养周期又鞠对较长。因此很少有入通过这种方法分离毛囊于缨臆。 细胞离心洵洗的基本原理是细胞的大小、密度及形状决定其在一定介质中的浮 力( 内力) 。当越内力与离心转动豹离心力( 努力) 取缮乎据对，纲懋在淘洗室中 根据其物理性能列队：小缀腮、低比重者在淘洗室近出黼处；大细脆、高吃重者在 淘洗室的底部。此时，如改变离心转速或增加入液量则可使不同的细胞成分先小腊 大姣次滚出，达到分离豹嚣鹣。巍予于绥戆蕊棼耪暖最小予分化嚣豹绸腿，掰以鬻 粥于干细胞的分离，尤其是赢液系统。t s e n g 等1 2 5 l 曾用此方法分离袭皮中具有增簸 能力的细胞，在其分离出的激小体积细胞中一定含有千细胞，但该蜜验不能提供其 缝发魏数据。覆这秘条件下，离心海洗技术分裹予绥熬戆裁力有限，毽疆小渡这掇 商的范围有可能使干细胞分离纯度增加。 流式细胞术分离细胞主要依赖对细胞激面标志进行荧光标记后分选，同时可结 会缓魏大小等特搓参数。鬟魏烫盘，太们还没发现一静表嚣标志能专逮标记乏囊 干细胞。b l 憋合素曾作为一个侯选标志。将f i t c 标记的抗p l 整合豢抗体与全部罄 底层细胞共孵肖后用流式细胞仪分选，结果发现荧光强度的对数值与克隆形成能力 蠢线往关系。巍就是滋缨脆袭嚣l 整合豢戆密度与其趱楚戆力其鸯瓣数线性关系。 中国协和医科大学博士学位论文1 5 而体内研究证实，表皮干细胞占基底层细胞的1 - 1 0 ，而大约4 0 的基底层细胞表 达b l 整合素，即干细胞和短暂增殖细胞均表达p 1 整合素，只是表达水平有所差异。 因此，不能单纯应用b 1 整合素标记分选干细胞，更多的是应用两种或两种以上的分 子标志。角质形成细胞在表达b 1 整合素的同时还表达c c 6 m 整合素。l i 等 2 6 】选用了 抗a 6 整合素抗体和1 0 g 7 单克隆抗体对表皮角质形成细胞进行双标分选，获得满意 的效果。 流式细胞术分离效率最高，但获得的细胞数量相对较少：而离心淘洗的分离效 率较高，获得的细胞数量最多，但只有在所需细胞与混杂细胞体积有明显差异时才 能有效分离。但这两种方法均需要昂贵的设备，技术复杂。最近，人们开始利用干 细胞粘附性强的特点进行分离纯化。无论是表皮还是毛囊的干细胞都牢固地定位在 基底膜上，分裂产生的子代细胞将逐步脱离基底层。因此，细胞悬液中，干细胞与 基底膜成分的结合能力最强，粘附也就最快。j o n e 及w a t t 将表皮角质形成细胞悬 液接种于包被有i v 型胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等的培养皿上。结果发现， 在型胶原上粘附2 0 m i n 后收获的细胞占全部基底层细胞的1 0 ，克隆形成能力 增加5 5 倍，而且在移植到裸鼠皮下后可以形成具有四层细胞( 基底层，棘层，颗 粒层和角化层) 的表皮 2 7 , 2 8 1 。通过粘附特性分离出来的细胞符合干细胞的特征，即 使纯度还有待提高，但至少能对干细胞起到富集的作用。目前，还没有利用这种方 法对毛囊干细胞进行分选的报道。 本文首先利用毛囊器官培养的模型，对敏乐定这种药物的作用效果进行- r 步l j 定， 首次观察了它对胶原代谢的影响，同时利用组织化学、免疫细胞化学以及分子生物 学的方法对它的可能机理进行了探讨。其次，本文首次利用粘附法从成人头皮毛囊 的多种细胞中分离、富集了毛囊干细胞，利用免疫细胞化学方法对其表达的干细胞 标志物进行了检测，并进行了体外克隆形成能力的鉴定。试图建立一种成人毛囊干 细胞分离及鉴定的方法，以期为未来使用成年毛囊干细胞重建病损的毛囊，恢复健 康的毛发，解决自体毛来源缺乏的难题打下基础。 中图协和医科大学博士学位论文 1 6 实验材料 1 ，实验标本 本实验聚羯的正霉天额灏部头皮器零采蠡劲稔蹶院、中霞友好医院及黄寺整 形医院行面部除皱手术患者，共计3 1 例，均为女性，年龄3 5 6 5 岁。所有标 本均于取材爝4 h 内处理。 2 + 试裁盒 用于免疫细胞化学的a b c 试剂盒为美国v e c t o r 公司产品。用于原位杂交的 地高辛d n a 撂记和检测试剂盒( d i gd n a l a b e l i n g a n dd e t e c t i o nk i t ) 为r o c h e 公司产箍，褥于质粒提取瀚试热盒为簿大泰克生物技术有限公司产菇，胡于d n a 电泳凝胶回收纯化的试剂盒为天为时代公司产品。 3 ，抗体 一抗 山羊抗人t g f 一 3 1 多克隆抗体i g g 美国s a n t ac r u z 生物技术公司 由羊抗人c o l l a g e n 瑾l ( i ) 多克建抗钵i g g 美国s a n t ac r u z 生物技术公司 山羊抗人小m y c 多克隆抗体i g g美国s a n t ac r u z 警糍技术公司 山羊抗人i n t e g r i nd l 多克隆抗体i g g 美国s a n t ac r u z 嫩物技术公司 小鼠抗入k e r a t i n1 9 多纛隆抗体i g g旖兰m o n o s a n 公司 兔抗入 3 - c a t e n i n 多克隆抗体i g gn e o m a r k e r s 生物技术公司 二抗 生物素化氮抗山羊多克鼹撬体i g g 美国s a n t ac r u z 生物技零公司 生物素忧马抗小鼠多竞隧抗体i g g 美国s a n t ac r u z 生物技术公司 生物素化山荜抗兔多克隆抗体i g g 美国s a n t ac r u z 生物技术公司 t r i t c 标记兔抗出羊多巍廷抗转i g g 怒容中由生物授零有限公司 4 内切酶及蔹白质、d n a 分予量标准 限制性内切酶b a m h i ( 2 0 u u 1 )日本t a k a r a 生物技术公司 限裁牲内韬鹣x h o i ( 1 5 u u 1 )辏粒医秘大学医学秘学技零开发公司 中国协嗣：l 医科大学博士学位论文1 7 x i i i h i n di i i 酶勰片段分子量标准 中分子量蛋白桥准 5 探针 太c - m y c ( 1 5 p g l m l ) 6 主要药品试剂 敏乐定( m i n o x i d i l ) 天狼星缝 o c t 藏常兔斑清 菠拳由羊盘渡 正常马瓶清 d e p c 黢蛋鑫繇 酵母提取物 硫酸葡聚糖钠赫 f i c o l l 一4 0 0 鲢鱼精子d n a 酵母t r n a t f i s 8 s a f c s 转铁蛋蠢 胰岛素 两性霉索b 蹩缰入袭皮生长因子 d m e m 培养基 h a m f l 2 培养基 目旨质体l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 捺帮医裁大学聪学辩学技术开发公弱 北京欣经料生物技术公司 l 哀中凼叟物菝术有限公司 美国p a u lm i t c h e l l 公司 美国m o b a y c h e m i c a lc o 。 美国m i l e si n c 北京中山生物技术有限公司 i 素中由生物技术毒疆公司 北京中山生物技术有限公司 荧国s i g m a 公司 荚重o x i o d 公司 英国o x i o d 公司 瑞典p h a r m a c i a 公司 璃鼗p h a r m a c i a 公司 北京华美生物工程公司 北京华美生物工程公司 德嚣r o c h e 公雹 德国r o c h e 公司 杭州四季青公司 美莺s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 黄秉仁教授憝赠 美国g i b c o 公司 美国g i b c o 公司 i n v i t r o g e n 公司 中国协和医科太学博士学位论文 其它试荆均为分板纯及以上级产黯 7 菌株 大肠秆菌d h 5g ，基因羹：s u o e 4 4 a t a c u l 6 9 f 8 0 1 a c z m 1 5 ) h s d r l 7f e c a l e n c k a l g y r a 9 6 壤i r e l a l 8 oc a t e n i n 表达质粒 p c a np - c a t e n i n n 9 0 ( 7 6 k b ) 由加拿大多伦多儿童鼷院b e n j a m i na l m a n 教授 裹赠。 9 主要仪器设备 恒冷箨切片援英国s l e e 医用设蛋公司 a o 石蜡切片机美国光学公间 相差显微镜 目本o l y m p u s 光学工业株式会社 镳振光显皴镜 基本o l y m p u s 光学工业拣式会专 荧光显微镜、普通璧微镜及照相系统日本o l y m p u s 光学工业株式会社 s t o r m 8 6 0 激光扫描戚像仪m d 公葡 紫矮分毙竞度诗美黧b e c k m a n 公嗣 低温高速离心机美圜b e c k m a n 公司 台式高速离心机上海光学仪器厂 台式多薄燕滋壤荡器江苏太仓痣溺艇纯仪器铡遥厂 紫外透射反射分析仪上海康华生化仪器制造厂 凝胶成像分析系统英国u v i 公司 建净王 乍宣l 京枣疆城区半导髂没备一厂 c 0 2 培养箱圈本t a b a ie s p e c 株式会社 s d s p a g e 及电转仪b i o ，r a d 公镯 1 0 囊要试粼帮溶液配方 1 ) 10 m m o l lp b s b u f f e r ( p h 7 5 1 称取n a c l8 , 0 9 ，k c io 2 9 ，k h 2 p 0 40 2 4 9 ，n a 2 礤qia 4 9 ，溶于9 0 0 m l 蒸 中国协和医科大学博十学位论义 1 9 键水中，调p h 德至7 。5 ，热水至1 0 0 0 m l 。 2 ) d ，h a n k s 液 称取k c l0 4 9 ，k i d 2 p 0 4o 0 6 9 ，n a c l8 0 9 ，n a h c o ，o 3 5 9 ，n a h p 0 4 , 7 h 2 0 0 0 6 9 ，酸红0 0 2 9 ，滚于1 0 0 0 m l 去枣子承中，8 磅1 0 r a i n 裹压蒸汽灭萤， 4 。c 冰箱内保存备用。 3 ) d m e m 液 将1 0 9d m e m 耱寒溶予9 0 0 m l 去嵩- 孑7 k o o ，鸯疆入n a h c 0 33 。7g ，调 d h 至7 2 ，补水至1 0 0 0 m l ，超净台中o 2 2 “m 过滤陈菌，4 4 c 冰箱内保存 锯用。 ) f 1 2 培养滚 ：得1 0 9h a m sf 1 2 粉末溶于9 0 0 m l 去离子水中，加入n a h c 0 3 1 1 7 6g ， 调p h 至72 ，补水至1 0 0 0 m l ，超净台中0 , 2 2um 过滤除菌，4 。c 冰箱内保 露冬蘑。 5 ) 无衄清毛囊生长培养液 d m e m 培养液中加入过滤除菌的胰岛素( 终浓度5 t t g m 1 ) 、转铁蛋 鑫( 终滚凄5pg m 1 ) 、氢化霹静捡( 终浓凄0 4 pg m t ) 、嚣注霉豢b ( 终 浓度2 5ug m 1 ) 、青一链霉索( 终浓度1 0 0 u - 1 0 0 pg m 1 ) 。 6 ) 毛囊细胞生长培养液 d m e m ：f 1 2 = 3 ：l 戆壤养滚孛热入遗滤陵菌懿获蘸素( 终浓褒5 婪 g m l ；、转铁蛋囱( 终浓度5l l m 1 ) 、氢化可的松( 终浓度0 , 4 ug m 1 ) 、e g f ( 终浓度2 0 n g m 1 ) 、两性艨素b ( 终浓度2 5 pg m 1 ) 、青一链霉索( 终 浓发1 0 0 u 一1 0 0 拉g m 1 ) 及2 0 f c s 。 7 ) 0 2 5 胰蛋白酶 称取胰蛋白酶0 2 5 9 ，溶予1 0 0 m ld h a n k s 液中，超净台中过滤除菌， 4 冰麓蠹保存器焉。 8 ) l m g m l 胶原酶 称取胶原酶1 0 0 m g ，溶予1 0 0 m ld h a n k s 液中，怒净台中过滤除菌， 44 c 球箱内傈释餐孺。 中国协和医科大学博士学位论文 2 0 9 ) 4 中性多聚甲醛固定液 称联4 0 9 多聚举疆，溶予8 0 m l 瓣p b s 中( p h 7 + 5 ) ，麴热搅拌至竞垒滚 解，调p h 至7 5 ，再用p b s 定容楚1 0 0 m l 。 1 0 )b o u i n 固定液 取篷和游睬酸7 5 m l ，攀醛5 m l ，踉醚鼗l m l ，港匀。先弱褒聚。 11 ) d e l a f i e l d 苏木索染液 称取苏木素4 9 溶予无水乙醇2 5 m l 中，溶解后加入1 0 铵矾水溶液 4 0 0 m l ，摇匀盂过滤，菇热营涟及擎醇各1 0 0 m l ，教鬻光照瓣憝3 4 令月， 待成熟厢即可使用。 1 2 )伊红y 染液 伊红y l g ，9 5 l 醇1 0 0 m l ，充分混匀溶解爱帮可使鬟。 1 3 )甘油封片剂 2 m g p p d ，溶予0 , 2 m t p b s 中，再加入1 s m l 甘油 1 4 )落昧酸一天猿鐾红染滚 天狼星红o + l g ，饱和苦味酸1 0 0 m l 。 1 5 ) d a b 显色液 d a b6 m g ，p b st o m l ，3 0 h 2 0 2 强p l 1 6 ) l b 培养基 b a c t o - t r y p t o n e5 9 ，b a c t o y e a s t e x t r a c t 2 。5 9 ，n a c l2 。5 9 麴蒸馏水楚 5 0 0 m l 。 1 7 ) 1 8 ) l b 平板 每1 0 0 m ll b 蜷券基中加入a g a r1 5 9 。 s t e 1 0 0 m m o l ln a c i ，1 0 m m o l lt r i s 。c l ( p h8 o ) ，l m m o l le d t a ( p h 8 0 ) 1 9 )s o l u t i o ni 5 m m o t lg l u c o s e ，1 0 m m o l lt r i s e 1 0 h s o ) 2 0 )s o l u t i o n1 1 0 2 m o i ln a o 壬王。1 s d s 中国协和医科大学博士学位论文2 1 2 1 ) 2 2 ) 2 3 ) 2 4 ) 2 5 ) 2 6 ) 2 7 ) 2 8 ) s o l u t i o ni i i 5 m o l ln a a c ：6 0 m l ，冰醋酸：11 5 m l ，h 2 0 ：2 8 5 m l t e b u f f e r ( p h8 0 ) 1 0 m m o l lt r i s c 1 ( p h8 o ) ，l m m o l le d t a ( p h 8 0 ) 马来酸缓冲液 马来酸5 8 0 9 ，n a c l4 3 8 9 ，用n a o h 颗粒调p h 至7 5 ，加水至5 0 0 m l 。 1 0 b l o c k i n g 液 封阻试剂1 0 9 ，1 0 0 m l 溶于马来酸缓冲液中。 w a s h i n g b u f f e r t w e e n2 03 m l 溶于马来酸缓冲液中，最终体积1 0 0 m i 。 d e t e c t i o nb u f f e r 1 0 0 m m o l lt r i s 。c 1 ，l o o m m o l ln a c l ，5 0 m m o l lm g c l 2 ，p h9 5 o 1 m 乙酸酐b u f f e r 三乙醇胺1 3 3 m l ，加无菌蒸馏水至l o o m l ，临用前加乙酸酐o 2 5 m l 。 5 0 d e n h a r d t f i c o l l4 0 0 5 9 ，p v p5 9 ，b s a5 9 ，加蒸馏水至5 0 0 m l 。 2 9 )2 0 s s c n a c i1 7 5 3 9 ，n a 3 c 6 h s 0 2 h 2 08 8 2 9 ，用1 0 m o l ln a o h 调p h 至7 0 ，加 水至1 0 0 0 m l 。 3 0 )预杂交液 4 s s c ，1 d e n h a r d t ，5 0 去离子甲酰胺，5 硫酸葡聚糖，5 0 0 ug m l 鲑鱼d n a ，2 5 0 i ag m l 酵母t r n a 。 3 1 ) t n e 1 m o l lt r i s c 1 ( p h7 6 ) ：2 m l ，o 5 m o l ln a c i ：2 0 m l ，0 2 m o l l e d t a ：l m l ， d e p c 水定容至2 0 0 m l 。 3 2 )细胞裂解液 2 0 m o l lt r i s 。c 1 ( p h8 6 ) ，1 s d s ，2 0 甘油 3 3 )3 0 聚丙稀酰胺 中国协和医科大学博士学位论文 覆耩酝藏2 9 ( w v ) ，n 嚣一二季叉震爨袋弦1 ( 吲v ) 3 4 )5 聚丙稀酰胺电泳缓冲液 1 0 s d s ( w v ) 5 0 m l ，t r i s1 5 1 9 ，甘氨酸9 4 9 ，加去离子水至1 0 0 0 m l 。 3 5 )1 0 分离羧 3 0 聚丙稀觥胺：6 7 m l ，1 5 m o l lt r i s ( p h 8 8 ) ：5 0 m l ，1 0 s d s ：0 2 m l 1 0 过硫酸胺：o 1 m l ，t e m e d ：o 0 1 m l ，加水至2 0 m l 。 3 6 )5 瑷爱羧 3 0 聚丙稀酰胺：1 7 m l ，1 0 m o l lt r i s ( p h 6 8 ) ：1 2 5 m l ，1 0 s d s ：o ，l m l ， 1 0 过硫酸胺：o i m l ，t e m e d ：o 0 1 m l ，加水至1 0 m l 。 3 7 )转移缓洚滚 3 8 ) 3 9 ) 甘氨酸3 9 m m o l l ，t r i s4 8m m o l l ，s d s0 0 3 7 ，甲醇2 0 。 加样缓冲液 t r i s ( p z 6 。8 ) 5 0 m m o i l ，s d s2 ，溪鹣兰0 。l ，嚣濑1 0 考马斯亮麟o 一2 5 0 染液 t 0 0 m g 考马斯亮蓝g - - 2 5 0 溶于5 0 r a l9 5 乙醇，加入1 0 0 m l8 5 h 3 p 0 4 ，魏承定褰至1 0 0 0 m l 。 4 0 )t b s 4 1 ) 4 2 ) t r i s ( p h 7 5 ) 1 0 0 r e t o o l l , n a c lo 9 ( w v ) t b s t o 1 m l t w e e n2 0 溶于1 0 0 m l t b s 中。 氨基黑染波 o 。5 氨基黧1 0 b ，3 0 辩泽醇，1 0 乙黢 中国协和鞋料大学博士学位论文 2 3 第一部分：毛囊器官培养中敏乐定的作用及其机理 一、方法 1 。毛囊敬孝芎及器富珞势1 2 9 1 患者术中取下的额颞部头皮立即置于过滤除菌的d m e m 中，4 保存。4 h 内于越净工作台内取燃头皮，7 5 酒精擦拭，用含5 0 0 u 双抗的d h a n k s 液冲 洗，势成豹5 m m 宽，1 5 m m 长匏发条，孬班含5 0 0 u 双撬戆d h a n k s 液渖洗。 沿真皮、皮下脂肪交界处剪开，将皮下层置于无双抗的d 。h a n k s 中，洗约3 m i n 。 在体视晟微镜下，用钟表镊顺毛囊生长方向轻轻拔出完整的露囊。倒爨鼹微镶 下蕊祭，去豫毛乳头不完整翡蕞囊。 2 毛囊生长监测 2 4 孔板中加入l m l 孑 , 无血清壤囊生长培养液，分别加入敏乐定( m i n o x i d i l ) 至终浓发分瓢为1 0 0 # g m l ，1 0 塾g m l ，1 驻g m l ，0 1 拉g m l 。对照组不麓药物。每 孔放入2 根完整毛囊，置3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱中培养，每3 4 d 更换培养液。 在侄6 嚣履微镜下用强镜测微尺每天测量每根蕺囊的长度( 以媛长端为准) ，记录 l o d 。备组毛囊平均长度以s t u d e n t st - t e s t 进行统计学检验。 3 毛囊嘲定包埋及h e 染色【3 0 】 培养前及培养藤7 d 的各缝壤囊取出后以p b s 清洗，嚣4 中性多聚甲醛固 定液中固定2 4 h 。梯发酒精麓水，二甲苯透稿，浸蜡，包蠼。石蜡切片辊切片( 6 um ) ，裱贴于载玻片上，烤干。 h e 染色：切片经二甲苯脱蝼，梯度酒精水化蘑，子苏本索染液中染色1 0 m i n ， 鸯来水漂洗，1 擒酸滔精快速分色，饱和氯能键中反蓝，蒸馏永洗2 次，l 伊红染液染色1 0 s ，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。 4 。苦眯酸天猿星红一镳振光法f 3 1 1 蔷昧酸天狼星缎一偏振光