（人体解剖与组织胚胎学专业论文）大鼠骨髓间充质干细胞侧脑室植入对sah后cvs大鼠的影响.pdf

，-_ 目录 jjj|fjfijjfffjjjiiiiiffff|iiiiifjfifilll册iii y 18 0 7 8 5 1 。 中文摘要1 英文摘要8 英文缩写1 6 研究论文大鼠骨髓间充质干细胞侧脑室植入对s a h 后c v s 大鼠的影响 引言18引舌18 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及神经元条件培养 基对其定向诱导分化 前言2 0刚舌2 u 材料与方法2 0 结果2 6 附图2 8 附表3 9 讨论4 0 小结4 2 参考文献4 2 第二部分大鼠s a h 后c v s 模型制备及行为学、生物学指标测定 前言4 6月u 舌 材料与方法4 7 结果5 0 附图5 3 附表6 0 讨 仑6 3 小结6 5 参考文献6 6 第三部分b r d u 标记的b m s c s 侧脑室植入后对s a h 后c v s 大鼠行为学 影响的研究 前言7 0日u 舌 材料与方法7 l 结果7 3 附图7 5 附表8 0 讨论8 2 j 、结8 4 参考文献8 5 第四部分s a h 后c v s 大鼠移植b m s c s 后海马神经元凋亡的研究 前言8 8月l j 舌 材料与方法8 9 结果9 4 附图9 6 附表1 0 0 讨 仑1 0 1 小结1 0 2 参考文献1 0 2 第五部分s a h 后c v s 大鼠b m s c s 移植前后脑血管的超微结构观察与 血中n o s 、e t 1 含量变化 前言1 0 5日【j 舌 材料与方法1 0 5 结果1 0 6 附图1 0 8 附表1 1 1 讨论1 1 2 小结1 1 3 参考文献1 1 4 结论1 1 6 综述一脑血管痉挛发病原因的分子机制研究现状1 1 7 综述二动脉瘤性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的预防和治疗进展1 4 1 致 射1 6 2 个人简历1 6 3 方法：体质量( 1 2 5 士2 5 ) gs d 大鼠，取股骨、胫骨，骨髓腔用d m e m 培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液。接种于培养瓶中， 3 7 ，5 c 0 2 培养箱中培养。取p 5 细胞爬片多聚甲醛固定，加一抗( 兔 抗大鼠c d 4 4 、c d 3 4 ) ，生物素化二抗，3 7 孵育lh ，d a b 染色，酒精 脱水、二甲苯透明，中性树胶封片、显微镜下观察。取原代培养的海马神 经元培养液，作为海马神经元条件培养基。另外一组加入碱性成纤维细胞 生长因子( b a s i c f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ) 和1 0 二甲基亚枫 ( d i m e t h ls u l f o x i d e ，d m s o ) 无血清培养基，最后一组以神经元培养基 ( n e u r o b a s a l 加b 2 7 ) 作为神经元基础培养基阳性对照，阴性对照为原培 养基( d m e m 加l o f b s ) 继续培养。第5 代( p a s s a g e5 ，p 5 ) b m s c s 接种在放有盖玻片的6 孔培养板里，爬片后换为基础培养基，海马神经元 培养基和无血清培养基( 含b f g f 和1 0 d m s o 的无血清l d m e m 培养 基) 进行诱导，分别将诱导1 2h 和1d 的细胞用4 多聚甲醛固定。加入 小鼠抗大鼠微管相关蛋白( m i c r o t u b u l aa s s o c i a t i o np r o t e i n 2 ，m a p 2 ) ，兔 抗鼠神经元特异性烯醇化酶( n e u r o s p e c i f i ce n o l a s e ，n s e ) 及兔抗鼠胶质 纤维酸性蛋白( g l i af i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) 一抗。光镜下观察 m a p 2 、n s e 和g f a p 表达阳性细胞，计数阳性细胞百分率并进行显微 摄影。 结果：大鼠b m s c s 原代培养，半量换液，悬浮的杂质细胞被清除， 贴壁细胞的形态清晰可见并开始迅速增殖。7 - - 9d e 右细胞可长满培养瓶 底。大鼠b m s c s 传代培养生长较原代快，5 - 一7d 细胞达9 0 融合。h e 染 色b m s c s 表现为细胞核大，圆形，居中深染，嗜碱性；胞质着色浅，呈弱 中文摘要 嗜酸性，细胞平行排列。兔抗大鼠c d 3 4 ，c d 4 4 免疫细胞染色，b m s c s 为c d 3 4 染色阴性细胞，而c d 4 4 表达阳性，这些c d 4 4 1 j e i 性细胞胞核和胞 浆呈棕褐色。海马神经元条件培养液、b f g f 的无血清培养基和含b 2 7 的 n e u r o b a s a l 培养基对p 5 的b m s c s 诱导1 2h 和1d 后，诱导后细胞体逐渐变成 圆形和锥形，细胞向外伸出突起。随着时间延长，突起也逐渐延长，1d 后可见有些连接形成网状。诱导后的b m s c s 免疫细胞化学染色，神经类 标记物m a p 2 ，n s e 和g f a p 进行标记，计数细胞阳性率，以1 2h 后海马 神经元条件培养基的诱导阳性率最高。 结论：l 应用全骨髓结合贴壁分离法成功建立了一种体外简单、快速 的大鼠b m s c s 原代及传代培养方法，在体外能够进行迅速增殖，且性状 稳定。2 体外培养的b m s c s 经免疫细胞化学染色，表达间充质干细胞表 面标记，证明非造血干细胞。3 应用含b f g f 的d m e m 培养基、海马神 经元条件培养基、无血清培养基诱导b m s c s1 2h 与1d ，b m s c s 均可分 化成为神经元样细胞和神经胶质样细胞，经免疫细胞化学染色均表达 n s e 、m a p 2 和g f a p 。4 三种培养基诱导b m s c s ，以1 2h 的诱导率最 高，可达到4 4 7 8 ，其中海马神经元条件培养基的诱导效率高于其它两 组，差异有显著性。 关键词：骨髓间充质干细胞；条件培养基；神经元特异性烯醇化酶； 微管相关蛋白2 ；胶质纤维酸性蛋白 二、大鼠s a h 后c v s 模型制备及行为学、生物学指标测定 目的：大鼠自体血枕大池二次注血法制造蛛网膜下隙出血 ( s u b a r a c h n o i dh e m o r r h a g e ，s a h ) 后脑血管痉挛( c e r e b r ov a s c u l a rs p a s m ， c v s ) 的动物模型，测定血和脑组织中一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h e s i s ， n o s ) 及内皮素1 ( e n d o t h e l i a m 1 ，e t - 1 ) 含量的变化，测量脑血管痉挛 后的血管直径，结合行为学改变对脑血管痉挛动物模型进行评定。 方法：枕大池二次注血法建立蛛网膜下隙出血模型，尾动脉取血，脑 立体定位仪下环枕膜处自体动脉血约5m i n 注完，于2d 后再次同样的方 法二次注血。手术后大鼠参照神经功能等级评分表评定，在1d 、2d 、3d 、 5d 、7d 对s a h 和对照组大鼠分别评分。1 0 印度墨水血管灌注，4 5 倍 体视显微镜下，应用n i k o nn i s e l e m e n t sb r3 0 和i m a g ej 图像分析系统， 中文摘要 测量基底动脉、颈内动脉和大脑中动脉直径。另外应用同样灌注技术，海 马组织切片于前囱后4m m 处切开，体视显微镜放大评价微血管充盈状态。 于s a h 成功后1d 、2d 、3d 、5d 及7d 时间取血，分离海马及皮层组织， 取组织上清液测定血清及脑组织匀浆中n o s 、e t - 1 含量。注射血液结束 后1 4d ，进行m o r r i s 水迷宫测试。所有数据均用? - i - s 表示，应用s p s s l 4 0 软件包进行分析，对照组和实验组间比较用d u n n e t t t 检验，组间比较用 s n k q 检验，神经生物功能评分和脑血管直径，n o s 和e t - 1 含量进行多 元线性回归，m o r r i s 水迷宫中的平均潜伏时间和n o s 、e t - 1 含量及脑血 管直径的关系也进行多元线性回归。 结果：大鼠s a h 后警觉性低，毛发杂乱，饮水摄食行为差，白洁性 差，于次日后稍好转，但二次注血后加重，少数可出现偏瘫。术后脑内有 血凝块，主要位于小脑延髓池内，1d 可见有陈旧性血液。在海马( 前囟 后4m m ) 切片处可见大脑皮层血管在s a h 组血管较少，血管变细。测量 大脑中动脉，基底动脉和颈内动脉直径，在s a h 组2d 和3d 组血管直径 与生理盐水和对照组相比有明显差异( 户 o 0 5 ) 。s a h 大鼠在1d 、2d 、3 d 、5d 、7d 可见神经功能评分明显增高，与对照组、生理盐水组相比有 明显的统计学差异( 尸 o 0 1 ) 。s a h 后ld 、2 d 、3d 、5d 、7d 组脑组织 和血液中e t - 1 均高于对照组和生理盐水组( 尸 o 0 5 ) 。s a h 组m o r r i s 水迷宫游泳距离明显 增长，逃避潜伏期时间较长。在随后的几天实验中各组逃避潜伏期时间逐 渐缩短，s a h 组成绩虽有提高，但其逃避潜伏期始终维持在较高水平， 平均潜伏期与血中e t 1 含量呈正相关。s a h 组大鼠跨越平台次数明显少 于对照组。 结论：l 大鼠自体尾动脉取血枕大池二次注血后，可见各脑池脑沟内 有明显的陈旧血凝块聚积，说明蛛网膜下隙出血模型成功。2 大鼠脑血管 管径测量显示s a h 血管变细，血管灌注显示有脑血管灌注不足，证明s a h 后有脑血管痉挛的缺血表现。3s a h 组血和脑内n o s 含量低于对照组， 中文摘要 e t - 1 含量升高，表明s a h 后有脑血管痉挛。4s a h 组神经生物学功能评 分均明显高于其它组，证明脑血管痉挛后有行为学表现功能下降。5m o m s 水迷宫测试表明s a h 后大鼠的空间学习记忆能力有一定下降。 关键词：蛛网膜下隙出血；神经功能评分；大脑中动脉；颈内动脉； 基底动脉 三、b r d u 标记的b m s c s 侧脑室植入后对s a h 后c v s 大鼠行为学影响的 研究 目的：通过b m s c s 侧脑室植入s a h 后c v s 大鼠，观察标记的b m s c s 在大鼠脑内生长情况，结合行为学检测评价b m s c s 植入后效果。 方法：第5 代b m s c s ，用5 溴脱氧尿核苷( b r o m o d e o x y u r i d i n e ，b r d u ) 标记2d 。将标记后的细胞爬片进行免疫细胞化学染色，一抗为b r d u 抗 体。标记好的细胞以5 1 0 6 的细胞悬液侧脑室注入s a h 后的大鼠。s a h 大鼠以其神经功能评分为参照，随机分为三组：s a h 组、s a h 后植入 d m e m 组和s a h 后b m s c s 植入组。s a h 组不植入干细胞，而d m e m 组于第二次注血2d 后立体定向仪下用微量注射器注入3 0g l d m e m 培养 基。b m s c s 组在第二次注血后2d 立体定位仪下注入3 0 9 l 的b m s c s 悬 液。b m s c s 组中5 只大鼠于1 4d 后进行m o m s 水迷宫检测，另外5 只取 脑进行免疫组化染色。脑立体定位仪下大鼠侧脑室穿刺取前囟定位，前囟 后1 2m m ，中线旁2m m 处进针，接上已事先抽好b m s c s 悬液或是d m e m 的微量注射器，深度为4 5m m ，将3 0 9 lb m s c s 悬液或d m e m 培养基缓 慢注入侧脑室。各组大鼠在注射后1 4d 麻醉，固定取脑，切片，进行免 疫组化染色，h 2 0 2 灭活内源性酶，加入抗原修复液，生物微波炉加热抗 原修复，滴加5 b s a 封闭液，一抗( 小鼠抗b r d ui g g ) ，3 7 1h ，生物 素化二抗，3 7 2 0m i n ，d a b 染色，脱水透明，中性树胶封片。s a h 组 及d m e m 组、b m s c s 组1d 、2d 、3d 、5d 、7d 后行神经生物学功能评 分，于1 4d 后进行水迷宫检测。 结果：b r d u 标记后b m s c s ，经免疫细胞化学染色为胞核着色，以胞 核呈棕黄色者为阳性。脑立体定位仪下行侧脑室穿刺，以前囟定位，能准 确注入侧脑室。s a h 大鼠侧脑室穿刺注入干细胞悬液后无不良反应。脑 石蜡切片d a b 染色后，可见经b r d u 标记的阳性细胞胞核呈棕褐色，阳 中文摘要 性细胞在切片内无明显规律，散在分布于阴性细胞之间。d m e m 组可见 阴性细胞核仍呈蓝色。将s a h 组、d m e m 组及b m s c s 组大鼠于注射后 1d 、2d 、3d 、5d 、7d 进行神经生物功能评分，无论是s a h 组还是d m e m 、 b m s c s 组可见，在各组里以1d 神经生物学功能评分普遍高于其它组 ( 尸 o 0 5 ) ，以后评分逐渐下降，b m s c s 组大鼠在7d 时与d m e m 和s a h 组相比，神经生物功能评分明显减低，感觉运动功能恢复( p o 0 5 ) 。m o r r i s 水迷宫检测b m s c s 组大鼠平均逃避潜伏期时间比s a h 组和d m e m 组要 短，有统计学差异，探索实验显示b m s c s 组跨越平台的次数多于其它两 组，差异有明显统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。 结论：1b r d u 可以用来标记b m s c s ，标记后的细胞可用相应的抗体 检测。2 脑立体定位仪下以前囟后1 2m m ，中线旁2m m 处进针，深度 为4 5m m 的位置能准确注入侧脑室，注射后大鼠未见明显不良反应。3 注 入b r d u 标记过的b m s c s 后，取前囟后4m m 的海马组织切片免疫组化 染色显示有b r d u 阳性细胞存在。4 生物学功能评分可见b m s c s 组在7d 时评分下降，表明感觉和运动功能有一定程度的恢复。5m o r r i s 水迷宫显 示b m s c s 组在学习记忆能力方面也有一定的改善。 关键词：侧脑室植入；5 溴脱氧尿核苷；神经功能评分；m o r r i s 水迷 古 亡了 四、s a h 后c v s 大鼠移植b m s c s 后海马神经元凋亡的研究 目的：大鼠s a h 后c v s 模型基础上植入b m s c s ，大鼠感觉、运动 功能有一定程度的恢复，进一步观察b m s c s 植入后对大鼠脑内海马神经 元凋亡相关蛋白b c l 2 和b a x 表达的影响。 方法：在第三部分大鼠脑组织切片基础之上，取s a h 组、d m e m 组 和b m s c s 组1 4d 前囟后4m m 处大脑皮层及海马组织石蜡切片，以兔抗 鼠b c l 2 和b a x 为一抗，进行免疫组织化学染色。图像分析软件分析阳性 细胞数目比率。无菌条件下取s a h 及b m s c s l 4d 组大脑，剥出海马，按 每1 0 0m g 脑组织加入1m l 裂解液，超声裂解后低温离心，取上清，考 马斯亮兰测定蛋白含量，蛋白变性后上样，电泳、转硝酸纤维素膜( n c 膜) ，脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗大鼠b c l 2 、b a x 一抗，4 静置过夜。 滴加辣根过氧化物酶标记二抗，免疫化学发光，x 光片显影定影。使用 中文摘要 h e m a 成像分析系统对显色条带进行半定量分析，测定各组蛋白相对表达 水平。 结果：与s a h 组相比，b m s c s 组海马可见b c l 2 阳性细胞数目增加， 细胞呈黄褐色，深染；b a x 阳性细胞数目减少，着色较浅。s a h 组大鼠 海马可见b c l 2 阳性细胞数目较少，着色浅；相反b a x 阳性细胞数目增加， 细胞呈棕褐色较深。d m e m 组可见b a x 阳性细胞数目增加，而b c l 一2 阳 性细胞数目相对减低。w e s t e r nb l o t 显示，d m e m 组、s a h 组和b m s c s 组大鼠海马g a p d h 表达三组基本相似，b c l 2 在b m s c s 组比d m e m 组 和s a h 组表达高( 尸 o 0 5 ) 。b a x 的表达在s a h 组与d m e m 组高于b m s c s 组，相比有明显统计学差异( 尸 o 0 5 ) 。 结论：1s a h 后c v s 模型大鼠侧脑室植入b m s c s 后，大脑皮层和 海马内可见神经元抑制凋亡相关基因表达增加，而促凋亡相关基因表达下 降。2s a h 组1 4d 大鼠脑内促凋亡相关基因表达升高，抑制凋亡相关基 因表达下降。3d m e m 组大鼠脑内仅有少量的抑制凋亡相关基因表达， 促凋亡相关基因表达较高。 关键词：凋亡基因；b c l 2 ；b a x ；w e s t e r nb l o t ；免疫组化 五、s a h 后c v s 大鼠侧脑室植入b m s c s 脑血管超微结构观察与血中 n o s 、e t - 1 含量变化 目的：观察s a h 后c v s 大鼠侧脑室植入b m s c s 后血中一氧化氮合 酶、内皮素1 含量变化，同时透射电镜观察大鼠脑内血管和神经元超微结 构改变，为细胞移植治疗提供理论和实验依据。 方法：实验动物分组、s a h 模型制备及b m s c s 移植同前面几部分， 分为正常对照组、s a h 组及b m s c s 组。于移植b m s c s 后1d 、3d 、7d 进行取血，测定大鼠血中n o s 和e t 1 含量，具体方法同前面第二部分。 同时取前囟后4m m 大脑皮层脑组织约1m m x lm m x 2m m 大小，用2 5 戊二醛磷酸盐缓冲液中后固定ld ，备透射电镜检查。将标本用o 1m 磷 酸缓冲液洗3 次，质量分数为1 锇酸固定，逐级梯度乙醇、丙酮脱水， 环氧树脂81 2 包埋，聚合，用超薄切片机作o 5g m 厚度切片，经l 甲 苯胺蓝天青染色，光镜下定位后制作超薄切片，片厚约5 01 1 1 3 3 ，铜网 捞片，醋酸铀、柠檬酸铅液染色。日立h 7 5 0 0 型透射电镜观察各组大鼠 中文摘要 大脑皮层神经元及微血管的超微结构，照相，记录。组间比较采用单因素 方差分析，各组间两两比较采用s n k q 检验，p 0 0 5 表示差异有统计学 意义。 结果：与对照组相比，s a h 组后ld 、3d 、7d 血中n o s 含量明显下 降，而血中e t - 1 含量则明显上升，其中以s a i l3d 组血中e t - 1 升高最为 明显，差异有统计学意义。与s a h 组相比，b m s c s 组可见血液中e t - 1 含量逐渐下降，而n o s 含量上升，差异有统计学意义。与正常组相比， b m s c s 组e t - 1 含量仍然较高，差异有明显统计学意义( 尸 o 1 ) 。透射电 镜显示，对照组神经元细胞核大而圆，染色质密度均匀，核仁明显，核膜 完整。大脑皮层毛细血管可见其内皮细胞内膜光滑，细胞核、细胞器、紧 密连接清晰可见，内皮细胞的基质和基膜完整，层次清楚，管腔无狭窄。 s a i l 组可见大脑皮层神经元和微血管内皮细胞的水肿程度达到高峰，神 经元高度水肿，线粒体肿胀，可见部分凋亡、坏死神经元。b m s c s 组大 脑皮层神经元和微血管内皮细胞可见轻度水肿，血管内皮细胞的吞饮小泡 略减少。微血管内皮细胞核固缩，管腔内微绒毛减少，管腔狭窄有一定缓 解。 结论：1s a h 后c v s 大鼠侧脑室移植b m s c s 后e t - 1 下降，n o s 含 量升高。说明脑血管痉挛有一定程度的缓解。2 脑组织及血管超微结构观 察，s a h 组大脑皮层神经元坏死加重，部分微血管闭塞。b m s c s 移植后 神经元的凋亡与死亡减少，微血管闭塞有一定的缓解。 关键词：细胞移植；e t - 1 ；n o s ；超微结构；脑血管痉挛 英文摘要 t h ei n f l u e n c eo fr a tb o n em a r r o w m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s t r a n s p l a n t a t i o nt oc e r e b r o v a s c u l a rs p a s mr a tf o l l o w i n g bhdh e m o r r h a g e s na r a cn o idnd a b s t r a c t 1 r a tb o n em a r r o wm e s e n c h y m a is t e mc e l l s i s o l a t i o n ，c u l t i v a t i o n ， i d e n t i f i c a t i o na n dn e u r o n a lc o n d i t i o n e dm e d i u m i n d u c ei t s d i f f e r e n t i a t i o n o b j e c t i v e ：t om a s t e rt h em e t h o do fr a tb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e m c e l l s p r i m a r yc u l t i v a t i o n ，p a s s a g e ，a n di d e n t i f i c a t i o n ，t oi n v e s t i g a t eu s e h i p p o c a m p a ln e u r o n sc o n d i t i o n e dm e d i u mt oi n d u c ei td i f f e r e n t i a t i o n m e t h o d s ：u s ew e i g h ta b o u t ( 10 0 - 15 0 ) gs dr a t ，g e tt h et i b i aa n df e m u r w i t hg e r mf r e e c o n d i t i o n ，e x p o s et h eb o n ec a v i t y , f l u s ht h ec a v i t yw i t h a n t i b i o t i c ( p e n i c i l l i o n 10 0u m l ，s t r e p t o m y c i n10 0 u m l ) d m e mm e d i u m ， c o l l e c ti ti n c e n t r i f u g et u b e ，s u s u p e n s i o ni t a n dc u l t u r e dw i t h1o f b s m e d i u mi n t ot h ec u l t u r e db o t t l e i n c u b a t ei n3 7 、5 c 0 2i n c u b a t o r 3 d c h a n g et h eh a l fm e d i u m ，5dc h a n g et h em e d i u mc o m p l e t e l y , t h e nc h a n g et h e m e d i u me v e r y3d u s ec d 3 4a n dc d 4 4a st h ep r i m a r ya n t i b o d yt od ot h e i m m u n o c y t o c h e m i s t r ys t a i n i n g ，p b sa st h en e g a t i v ec o n t r o l ，a d dt h eb i o t i n i z e s e c o n d a r ya n t i b o d y , 3 7 ，lh ，p b sw a s h3t i m e s ，a d dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ， s t a i n i n gw i t hd a b ，s t o pw i t hw a t e r , e t h a n o ld e h y d r a t i o n ，x y l e n et r a n s p a r e n t ， f i xi tw i t hg u m , o b s e r v eu n d e rm i c r o s c o p e u s e p r i m a r yc u l t u r e dh i p p o c a m p a l n e u r o n sm e d i u ma sc o n d i t i o n e dm e d i u m ，b - f g fg r o u pa d d10 d m s o ， b - f g fa n dl - d m e m ，t h el a s tg r o u pu s en e u r o b a s a lp l u sb 2 7a ss e r u mf r e e m e d i u m ，n e g a t i v ec o n t r o li s d m e mm e d i u m ( w i t h10 f b s ) p 5b m s c s p l a n t e do nt h ec o v e rs l i pw i hc o v e n n go 1 p l l ( p o l y - l - l y s i n e ) i n6 w e l l sp l a t e ，w h e nt h eb m s c sg r o w t ho nt h ec o v e rs l i pa n dc h a n g ew i t h n e u r o b a s a l m e d i u m ，h i p p o c a m p a l c o n d i t i o n e dm e d i u ma n ds e r u m f r e e m e d i u m , i n d u c e dt h e e e l lf o r12ha n dl d a f t e rt h a tf i x e dw i t h p a r a f o r m a l d e h y d e b m s c sf o l l o w i n gi n d u c ew i t hd i f f e r e n tm e d i u m , u s e 8 r a b b i ta n t ir a tc d 3 4s h o wn e g a t i v ea n dc o l o r l e s s ，c d 4 4e e l l a d h e r e m o l e c u l a rp o s i t i v e ，n u c l e ia n dc y t o p l a s m as h o wb r o w n h i p p o c a m p a ln e u r o n , n d i t i o n e dm e d i u m bf g fm e d n db 2 7f l u sr o b a s a l ( s e r u mfree)conditionedm e d m mo - f k im e c l l u ma n t i1 5 p l u sn e u r o o a s a l ( s e r u mt r e e ) ， m e d i u mi n d u c e dt h eb m s c sf o r12ha n d1d ，a f t e ri n d u c i n gt h ee e l lb o d y c h a n g e d i n t or o u n da n dp y r a m i dg r a d u a l l y , p r o c e s se l o n g a t e ，1ds o m eo ft h e m c a nc o n n e c te a c ho t h e r w i t hi m m u n o c y t o c h e m i s t r ys t a i n i n ，12ha n dl d 1 a b e l e dw i mm a p 2 。n s ea n dg f a p , c o u n tt h ep o s i t i v es h o w e dc o n d i t i o n e d m e d i u mi n d u c e db m s c sp o s i t i v er a t i oi st h eh i 曲e s t ，e x p r e s sn s e ，m a p 一2 ， g f a ph i g h e rt h a no t h e r s ，h a v et h es i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：1 f u l lb o n em a r r o wc u l t u r em e t h o da n da d h e r ew a y i sa s u c c e s s f u lm e t h o dt oi s o l a t i o n ，p u r i f yt h eb m s c si nv i t r o ，a n di tc a np r o l i f e r a p i d l ya n ds t a b l e 2 b m s c si nv i t r ow i t hi m m u n o c y t o c h e m i s t r ys t a i n i n g ，i t s e x p r e s sm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sc h a r a c t e r i s t i c ，n o tt h eh e m o t o p o i t i cs t e m c e l l s 3 w i t hb f g fd m e mm e d i u m ，h i p p o c a m p a lc o n d i t i o n e dm e d i u m ， s e r u mf r e em e d i u mi n d u c e db m s c sl2ha n d1d ，b m s c sc a nd i f f e r e n t i a t e i n t on e u r o n a ll i k ee e l la n dg l i a l l i k e c e l l ，w i t hi m m u n o c y t o c h e m i s t r y i d e n t i f i c a t i o ni t se x p r e s sn s e ，m a p 一2a n dg f a pp o s i t i v ec h a r a c t e r i s t i c 3 晰t hb f g fd m e mm e d i u m ，h i p p o c a m p a lm e d i u m ，s e r u mf r e em e d i u m 9 英文摘要 i n d u c eb m s c s ，12hi st h eh i g h e s tr a t i o ，i t sa b o u t4 4 7 8 ，c o n d i t i o n e d m e d i u mc o m p a r ew i t ho t h e r s ，t h e r ea r es t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c e s k e yw o r d s ：b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ；n e u r o ns p e c i f i c e n o l a s e ；c o n d i t i o n e dm e d i u m ；m i c r o t u b u l ea s s o c a i t o np r o t e i n 一2 ；g l i a l f i b r o a c i dp r o t e i n 2 c v sm o d e lf o l l o w i n gs a ha n d e t h o l o g i c a l ，b i o l o g i c a ld e t e c t i o n o b j e c t i v e ：o b s e r v er a ta u t o l o g o u sb l o o dc i s t e r n am a g n ai n j e c t i o nt o p r o d u c ec v sm o d e lf o l l o w i n gs a h ，d e t e c tb l o o da n db r a i nn o sa n de t - 1 c o n t e n tv a r a t i o n ，t h ed i a m e t e ro fc e r e b r ov e s s e l ，v a l u et h em o d e lo fc v sf r o m e t h o l o g i c a lp e r f o r m a n c e m e t h o d s ：u s ed o u b l eh e m o r r h a g ec i s t e r nm a g n ai n je c t i o nm e t h o dt o p r o d u c es a hm o d e l ，s e p a r a t et h ea t l a n t o - o c c i p i t a lm e m b r a n ea n dc u ta n t e r i o t h ee n do ft a i la b o u t5 - 6c m ，g e tt h ea r t e r i a lb l o o d0 2 0 3m lf r o mt a i la r t e r y , w i t hs t e r e o t a x i c ac o o r d i n a t ei n je c tt h ea r t e r i a lb l o o df r o ma t l a n t o o c c i p i t a l m e m b r a n ea b o u t5m i n ，a n d2dl a t e ri n j e c tt h eb l o o da g a i nt h es a m ew a y r a t w a sv a l u e dw i t hn e u r o l o g i c a lf u n c t i o n a ls c o r e ，i n1d ，2 d ，3d ，5d ，7d c o m p a r es a h a n dc o n t r o lg r o u p a f t e rv e s s e lp e r f u s i o nw i t h10 o fi n d i ai n k d e t e c tt h ed i a m e t e ro fc e r e b r a la r t e r yw i t hm a g n i f i c a t i o no f4 5 ，w i t hn i k o n n i sb r3 0a n di m a g eja n a l y s i ss y s t e m ，d e t e c tt h eb a s a la r t e r y , i n t r o c a r o t i d a r t e r y , a n dm i d d l ec e r e b r a la r t e r yd i a m e t e r w i t ht h es a m ep e r f u s i o nw a y , f i l l i n gt h em i c r o v e s s e l ，1m mt h i c ks l i c ea r o u n dt h eh i p p o c a m p u s4m i d p o s t e r i o rb r e g m a , v a l u r et h ev e s s e lf i l l i n gu n d e r 4 5m a g n i f i c a t i o n s a h1d ，2 d ，3d ，5d ，7de x t r a c tt h ee y e b a l l ，g e t2m lb l o o d ，g e tt h eh i p p o c a m p u sa n d c o r t e xo fb r a i n ，u s es e r u ma n dd e t e c tt h ee t - 1a n dn o sa c c o r d i n gt oi t s m a n u a l ，a f t e ri n j e c t i o n 14d ，d om o r r i sm a z e rt e s t a l ld a t ap r o c e s s 、析t l l s p s s14 0s o f tw a r ea n du s eo n e w a ya n n o v a ，c o m p a r e c o n t r o la n d e x p e r i m e n t a lg r o u p 谢t hd u n n e t t - tm e t h o d ，a m o n gg r o u p sw i t hs n k qt e s t ， w i t hn e u r o l o g i c a lf u n c t i o n a ls c o r ea n dc e r e b r a ld i a m e t e r , n o sa n de t - 1u s e m u l t i p l el i n e a rr e g r e s s i o n ，m o r r i sm a z e r m e a ne s c a p et i m ea n dn o s ，e t - 1 ， c e r e b