（体育教育训练学专业论文）运动导致活性氧增加的nadph氧化酶途径研究.pdf

t h em e c h a n i s mo fe x e r c i s e - i n d u c e dr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sb yn a d p h a t h e s i o x i d a s ep a t h w a y 肼74洲6 50川9i 啪y 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：寻 日期：汐f 年歹月乃日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 去畏 c 司划 日期：刃i f 年 日期：如f 年 弓只 e l 歹月歹弓日 ，一 硕士学位论文 摘要 运动氧应激的研究至今已有大约3 0 年的历史，在运动导致的活性氧产生的研 究的前二十余年里，逐渐形成了多种关于运动诱导活性氧产生的机制的学说，其 中占据主导地位的是线粒体学说，但是，最近的一些研究发现开始对这一学说产 生质疑。n a d p h 氧化酶以前被认为是吞噬细胞专有的酶，但最近发现它在许多 别的细胞中也存在，并且经该酶途径产生的活性氧在细胞中起着信号传导和基因 表达的调控作用。逐渐增多的证据提示，n a d p h 氧化酶也参与了运动诱导的骨 骼肌活性氧的产生。基于最近的研究成果，本研究假设，n a d p h 氧化酶是运动 诱导的骨骼肌活性氧增加的主要途径。 研究方法： 6 0 只小鼠随机分为6 组，每组1 0 只：( 1 ) 对照组( c 组) ；( 2 ) 对照+ 药 物组( c a 组) ；( 3 ) 游泳训练组( t 组) ；( 4 ) 游泳+ 药物组( t a 组) ； ( 5 ) 负重游泳组( o t 组) ；( 6 ) 负重游泳组+ 药物组( o t a 组) 。负重游泳为3 体重。每天训练1 次，9 0 分钟，每周6 次，共4 周。在最后两次训练前尾部静脉 注射n a d p h 氧化酶的抑制剂a p o c y n i n ( 1 0 m g k g 体重) ，于末次训练结束2 4 小时后取样。 研究结果： ( 1 ) 经4 周训练，末次运动2 4 h 后，各训练组血清c k 活性升高( p 0 0 5 ) ， 且负重组高于非负重组；各训练组h b 浓度升高( p 0 0 5 ) ；各训练组骨骼肌g i n 含量无显著性差异。 ( 2 ) 末次运动2 4 h 后，t 组、o t 组骨骼肌r o s 明显增加( p o 0 1 ) ，且o t 组明显高于t 组( p o 0 5 ) ；t a 组与t 组相比，o t a 组与o t 相比，骨骼肌r o s 明显下降( p 0 0 5 ) 。 ( 3 ) 末次运动2 4 h 后，t 组、o t 组骨骼肌m d a 含量下降( p o 0 5 ) ，o t 组 明显上升( p 0 0 1 ) ，与o t 组相比，o t a 组明显下降( p 0 0 1 ) 。经4 周训练后， 骨骼肌s o d 活性，o t 组、o t a 组明显增强( p o 0 5 ) 。 研究结论： ( 1 ) 4 周不同负荷的游泳训练，末次运动2 4 h 后，骨骼肌r o s 明显增加，且 高负荷训练较低负荷更加明显；施加n a d p h 氧化酶抑制剂后，骨骼肌r o s 降低， 提示该两种负荷训练导致的骨骼肌r o s 增加是经n a d p h 氧化酶途径产生。 ( 2 ) 末次运动2 4 h 后，高负荷训练组骨骼肌m d a 增加，而低负荷运动组降低， 、 不同训练负荷导致活性氧增加的n a ) h 氧化酶途径研究 高负荷运动组骨骼肌s o d 活力增强，提示适量的低强度运动有助于r o s 的代谢 产物m d a 的清除。 ( 3 ) 4 周训练后，各组小鼠h b 增高，提示长期有氧训练有助于提高血液的 氧运输能力。 ( 4 ) 检测细胞内活性氧的d c f h - d a 荧光探针方法可有效地用于检测骨骼肌 匀浆液中的活性氧。 关键词：活性氧；n a d p h 氧化酶；丙二醛；超氧化物歧化酶；运动 i n 硕士学位论文 a b s t r a c t t h ee x e r c i s e i n d u c e do x i d a t i v es t r e s sh a sb e e nr e s e a r c h e df o ra l m o s t3 0y e a r s i nt h ef i r s t2 0y e a r so fr e s e a r c h i n gr e s u l t i n gf r o mr o sp r o d u c e db ye x e r c i s e ，av a r i e t y o ft h e o r i e st h a tm o v e m e n ti n d u c e sr o sm e c h a n i s mh a v eb e e nf o r m e dg r a d u a l l ya n d t h ed o m i n a n to n ei sm i t o c h o n d r i a ld o c t r i n e ，o nw h i c hs o m er e c e n ts t u d i e sb e g a nt o h a v ed o u b tt h o u g h n a d p ho x i d a s eu s e dt ob ec o n s i d e r e da sp r o p r i e t a r yp h a g o c y t i c c e l l se n z y m e s ，b u tr e c e n t l yw a sf o u n de x i s t i n gi nm a n yo t h e rc e l l s b e s i d e s ，r o s p r o d u c e db yt h i sk i n do fe n z y m ep l a y sr e g u l a t i o nr o l eo fs i g n a lt r a n s m i s s i o na n dg e n e e x p r e s s i o ni nt h ec e l l i n c r e a s i n ge v i d e n c es h o w st h a tn a d p h o x i d a s eh a sb e e na l s o i n v o l v e di ng e n e r a t i n gt h es k e l e t a lm u s c l e sr osi n d u c e db ym o v e m e n t b a s e do nt h e r e s u l to fr e c e n ts t u d i e s ，t h i sr e s e a r c hs e tt h eh y p o t h e s e st h a tn a d p ho x i d a s ei st h e m a i nw a yt oi m p r o v er o si n d u c e db ye x e r c i s e m e t h o d s ： 6 0m i c ea r er a n d o m l yd i v i d e di n t os i xg r o u p so f1 0m i c e ：( 1 ) t h ec o n t r o lg r o u p ( g r o u pc ) ，1 0m i c e ；( 2 ) c o n t r o l + d r u gg r o u p ( g r o u pc a ) ；( 3 ) t r a i n i n gs w i m m i n g g r o u p ( g r o u pt ) ；( 4 ) t r a i n i n g + d r u gg r o u p ( g r o u pt a ) ；( 5 ) l o a d s w i m m i n g g r o u p ( g r o u po t ) ；( 6 ) l o a ds w i m m i n gt r a i n i n gg r o u p + d r u gg r o u p ( g r o u po t a ) l o a d s w i m m i n gf o r3 w e i g h t ，o n c ead a y , 9 0m i n u t e s ，6t i m e saw e e k ，4w e e k si n t o t a l b e f o r et h el a s tt w ot r a i n i n g ，i n j e c tt h en a d p ho x i d a s ei n h i b i t o r sa p o c y n i n ( 1 0 m g k g w e i g h t ) i nt h et a i li n t r a v e n o u sa n dg e tt h es a m p l eo v e r2 4h o u r s a f t e rt h ef i n a lt r a i n i n g r e s u l t s ： 1 a f t e rf o u rw e e k so ft r a i n i n g ，2 4 ha r e rt h el a s te x e r c i s e ，s e r u mc ka c t i v i t yi n e a c ht r a i n i n gg r o u pi n c r e a s e d 口 0 0 5 ) ，a n dt h el o a dg r o u pi sh i g h e rt h a nn o n - l o a d g r o u p f i bc o n c e n t r a t i o ni ne a c ht r a i n i n gg r o u pi n c r e a s e d ( p 0 o s ) t h ec o n t e n to f s k e l e t a lm u s c l eg i ni ne a c ht r a i n i n gg r o u ph a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s 2 o v e r2 4 ha f t e rt h el a s te x e r c i s e ，s k e l e t a lm u s c l er o si ng r o u pt a n dg r o u po t i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yp 0 0 1 ) ，a n dr o si ng r o u po t i n c r e a s e dm u c hh i g h e rt h a n t h eo n ei nt h eg r o u pt 口 0 0 5 ) 3 o v e r2 4 ha f t e rt h el a s te x e r c i s e ，m d ac o n t e n ti ns k e l e t a lm u s c l eo fg r o u pt a n dg r o u po td e c r e a s e d 0 0 5 ) g r o u po ti n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 口 0 0 1 ) g r o u p 不同训练负荷导致活性氧增加的n a ，h 氧化酶途径研究 o t ad e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) c o m p a r e dw i t hg r o u po t a f t e rf o u rw e e k so f t r a i n i n g ，s o da c t i v i t yi ns k e l e t a lm u s c l eo fg r o u po ta n dg r o u po t a i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ： 1 4w e e k s s w i m m i n gt r a i n i n gw i t hd i f f e r e n tl o a d s ，o v e r2 4 ha f t e rt h el a s t e x e r c i s e ，s k e l e t a lm u s c l er o s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y , a n dt h ec h a n g ei sm o r eo b v i o u s i nl o w e rl o o a d i n gt r a i n i n g a f t e ri m p o s e db yt h en a d p ho x i d a s ei n h i b i t o r , t h er e a s u l t i sr e v e s e d i ti si n d i c a t e dt h a ti n c r e a s i n go fs k e l e t a lm u s c l er o si n d u c e db yt w ok i n d s o fl o a dt r a i n i n gi sg e n e r a t e dt h r o u g hn a d p ho x i d a s e 2 o v e r2 4 ha f t e rt h el a s te x e r c i s e ，m d ai ns k e l e t a lm u s c l ei nt h eh i g h - l o a d t r a i n i n gg r o u pi n c r e a s e d ，w h i l et h eo n ei nl o w - l o a dg r o u pd e c r e a s e d s o da c t i v i t yi n s k e l e t a lm u s c l ei n h i g h l o a de x e r c i s e i n c r e a s e d ，s u g g e s t i n g t h a t a p p r o p r i a t e l o w i n t e n s i t ye x e r c i s ep r o m o t e st oc l e a rm d a m e t a b o l i z e df r o mr o s 3 a f t e r4w e e k s t r a i n i n g ，h bl e v e l i nt h em i c eo fe a c hg r o u pi n c r e a s e d ， s u g g e s t i n gt h a tl o n g - t e r ma e r o b i ct r a i n i n gp r o m o t e st oi m p r o v et h et r a n s p o r to x y g e n c a p a c i t y 4 t h em e t h o do fd e t e c t i o no fd c f h d af l u o r e s c e n c ep r o b ei ni n t r a c e l l u l a rr o s c a nb ee f f e c t i v e l yu s e dt od e t e c tt h eh o m o g e n a t er o so fs k e l e t a lm u s c l e k e y w o r d s ：r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) ；n a d p h ( n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e ) o x i d a s e ；m d a ( m a l o n i cd i a l d e h y d e ) ；s o d ( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ) ；e x e r c i s e ； v 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书i 摘要 a b s t r a c t i v 插图索引i 附表索引i x 缩略词一x 前言l 第一部分文献综述2 1 1r o s 的相关生物学特性2 1 1 1r o s 的定义2 1 1 2r o s 的种类2 1 1 3 生物体内r o s 的产生2 1 1 4 自由基的清除与防护机制3 1 1 5r o s 的检测方法5 1 2 运动诱导的骨骼肌r o s 的研究进展6 1 2 1 运动中r o s 产生的部位6 1 2 2 骨骼肌中r o s 产生的途径7 1 3 运动诱导r o s 增加的n a d p h 氧化酶途径研究进展1 0 1 3 1n a d p h 氧化酶概述1 0 1 3 2 运动诱导r o s 增加的n a d p h 氧化酶途径研究进展1 1 1 4 本文构想1 2 第二部分实验研究1 3 2 1 材料与方法1 3 2 1 1 实验动物1 3 2 1 2 动物分组、药物方案、运动方案1 3 2 1 3 样本的采集与处理1 4 2 1 4 指标测定15 2 1 5 数据分析2 0 2 2 结果2 0 2 2 1 训练负荷相关指标2 0 2 2 2 骨骼肌r o s 的产生2 3 v i 硕士学位论文 插图索引 图1 1 骨骼肌纤维中能够产生活性氧的部位9 图2 1 末次训练2 4 h 后各组小鼠血清c k 的比较( 1 ) 2 1 图2 2 末次训练2 4 h 后各组小鼠血清c k 的比较( 2 ) 2 1 图2 3 末次训练2 4 h 后各组小鼠h b 的比较2 2 图2 4 末次训练2 4 h 后各组小鼠骨骼肌g l n 含量的比较2 3 图2 5 末次训练2 4 h 后各组小鼠骨骼肌r o s 的比较2 4 图2 6 末次训练2 4 h 后各组小鼠骨骼肌丙二醛含量的比较2 5 不同训练负荷导致活性氧增加的n a d p h 氧化酶途径研究 鼍i i i 皇皇量鼍昌窖皇鼍毫置皇鲁曼曼皇詈兽詈葛鼍篁詈鼍詈詈詈音量曼曼暑! ! 鼍鼍暑暑暑! 曼晕皇置鼍墨詈鲁喜詈! 詈皇詈鼍 附表索引 表2 1 动物分组及药物、运动方案1 4 表2 2 训练负荷相关指标的变化2 l 表2 3 各组骨骼肌过氧化产物2 3 表2 4 各组小鼠骨骼肌m d a 含量与s o d 活性的变化2 4 i x 硕士学位论文 缩略词 r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) n a d p h ( n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u e l e o t ip h o s p h a t e ) s o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) m d a ( m a l o n i ed i a l d e h y d e ) g s h ( g l u t a t h i o n e ) g p x ( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ) g r ( g l u t a t h i o n er e d u c t a s e ) c a t ( e a t a l a s e ) p o d ( p e r o x i d a s e ) c k ( c r e a t i n ek i n a s e ) g i n ( g l u t a m i n e ) h b ( h e m o g l o b i n ) p l a 2 ( p h o s p h o l i p a s ea 2 ) l d h ( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) d c f h ( d i e h l o r o f l u o r e s c e i n ) e s r ( e l e c t r o np a r a m a g e n e t i er e s o n a n c e ) d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) r n a ( r i b o n u c l e i ca c i d ) a t p ( a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ) f n 跗( f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e ) f a d ( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ) x 活性氧 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 超氧化物歧化酶 丙二醛 谷胱甘肽 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽还原酶 过氧化氢酶 过氧化物酶 肌酸激酶 谷氨酰胺 血红蛋白 磷脂酶a 2 乳酸脱氢酶 二氯荧光素 电子顺磁共振 脱氧核糖核酸 核糖核酸 三磷酸腺苷 黄素单核苷酸 黄素腺嘌呤二核苷酸 学位论文硕士 i 上j l 月i j 舌 生物体代谢过程中产生的活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，化学性质 比较活泼，对机体有利害两面性，即在生物体内正常的生理浓度下，r o s 有更好 的对机体进行杀菌、调节、基因表达等作用，但是过多r o s 的产生就会改变体内 氧化平衡，引起生物体的一系列病变反应。大强度的运动训练时，引起r o s 产生 增多，机体内清除氧自由基的能力不足以平衡过多的r o s ，造成运动氧应激，导 致脂质，核酸和蛋白质等多种损伤。因此，r o s 的产生，引起了生物、医学及运 动医学领域的广泛关注；有关运动过程中r o s 产生途径机制的研究、也成为研究 的热点问题。自从三十年前运动促进氧化应激的首次报道以来，人们开始越来越 地的关注r o s 产生途径机制的研究，在运动导致的r o s 产生的研究的前二十余 年里，逐渐形成了多种关于运动诱导r o s 产生的机制的学说，其中占据主导地位 的是线粒体呼吸链学说，但是，最近的一些研究发现开始对这一学说产生质疑。 以线粒体产生r o s 所消耗的氧分子含量的多少为代表的一些研究数据，推翻了线 粒体产生r o s 的主导地位。同时其他的产生r o s 的途径，如黄嘌呤氧化酶、中 性粒细胞、儿茶酚胺等，日渐被研究者重视起来。其中n a d p h ( n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e ) 氧化酶途径最为重要。而n a d p h 氧化酶是一种 酶复合物，反应中起到递氢作用，可催化分子氧单电子还原形成超氧阴离子0 2 ， 从而生成活性氧。研究也表明n a d p h 氧化酶存在于很多细胞当中，经过其途径 产生的活性氧还在细胞中起着调节信号传导和基因表达的作用。最值得关注的是， 逐渐增多的证据提示，n a d p h 氧化酶也参与了运动诱导的骨骼肌r o s 的产生。 本研究假设n a d p h 氧化酶途径是运动所致r o s 增加的主要机制。通过建构 小鼠不同游泳负荷的运动模型( 详细训练方法见本文第二部分) ，采用n a d p h 氧 化酶的抑制剂a p o c y n i n ( 夹竹桃麻素) 来抑制n a d p h 氧化酶的活性。预期的实 验结果是施药并运动的动物组织中产生的r o s 将低于同组未施用药物的，以此推 断n a d p h 氧化酶在不同训练负荷所致的r o s 中的作用。 本研究的完成，将实现进一步阐明运动性骨骼肌内源性r o s 的理论创新，为 运动引起的氧化应激及机体抗氧化能力等方面的研究提供有效的研究方法。 不同训练负荷导致活性氧增加的n a d p h 氧化酶途径研究 第一部分文献综述 1 1r o s 的相关生物学特性 1 1 1r o s 的定义 机体氧化反应中产生的有害化合物，具有较强的氧化性，可以损害机体组织 和细胞，从而引起慢性疾病及衰老的效应，这种有害化合物就是自由基。人们把 自由基定义为：含有奇数电子或者不配对电子的原子、原子团及分子。由于生物 体内氧自由基与r o s 二者相互转变，很难将其绝对分开，所以有很多的研究者把 r o s 和氧自由基视为同一概念【。其实r o s 远比自由基代表的范围广泛【2 1 。r o s 不仅是生物体内的氧自由基，包括氧及含氧的高反应活性分子；而且r o s 是需氧 细胞在很多代谢反应和相应的刺激作用下产生，这些中间体都是直接或间接的由 分子氧转化而来，也就是氧的衍生物，具有比分子氧更加活泼的化学反应性质； 许豪文早期在其著作中指出r o s 是指氧自由基及其衍生物，这类衍生物有单线态 氧( 1 0 2 ) ，过氧化氢( h 2 0 2 ) ，脂质自由基( ( l o ) ，脂质过氧自由基( l o o 。) ，有 机过氧化物( l o o h ) 等【3 1 。后来很多学者又将单线态氧( 1 0 2 ) ，过氧化氢( h 2 0 2 ) ， 脂质自由基( ( l o ) ，脂质过氧自由基( l o o ) 及其衍生物过氧亚硝酸基( o n n o o ) 等也归类于r o s 【l 】。随着人类对r o s 研究的不断深入，有研究者对r o s 进行了 广义和狭义的概括，即广义的r o s 是指：所有比大气中的常态氧( 三线态氧) 的反 应性更高的氧类的总称，在0 2 的电子结构上，不能一次给予4 个电子而还原成水； 狭义的r o s 则指：在0 2 接受4 个电子而变成水的过程中被还原的0 2 分子，它包 括1 个电子被还原的超氧阴离子( 0 2 。) 和质子化超氧阴离子( h 0 2 ) ，2 个电子被还 原的过氧化氢( h 2 0 2 ) ，3 个电子被还原的羟自由基( h o ) ，以及脂氧自由基( l o 。) 、 过氧自由基( l o o ) ，单线态氧( 1 0 2 ) ，还有次氯酸和一系列脂质过氧化物( r o o h ) ， 一氧化氮( n o ) ，及其氧化物( o n o o h ) ，超氧亚硝酸( o n o o 一) 等【4 j 。 1 1 2r o s 的种类 生物体内产生的r o s 主要包括：一种激发态的氧分子，即一重态氧分子或称 单线态氧分子( 1 0 2 ) ；三种含氧的自由基，即超氧阴离子是自由基( 0 2 。) 、羟自由 基( h o ) 和氢过氧自由基( h 0 2 。) ；两种过氧化物( h 2 0 2 ) 和过氧化脂质( r o o h ) 以及一种含氮的氧化物( n o 、o n o o h 和o n o o 。) p j 。 1 1 3 生物体内r o s 的产生 微生物以及人体在内的这些需要氧来维持生命的生物体，都有氧代谢，而且 在代谢过程中可以通过非酶反应和酶反应产生r o s 。 2 学位论文硕士 1 1 3 1 非酶反应 非酶反应中的0 2 能从还原剂那里接受一个电子，转变生成0 2 。其证据如： 一些生物分子( 包括甘油醛、还原型核黄素、f m n 与f a d 、肾上腺素、四氢喋 呤) 氧化时可产生0 2 ；另外在人体内，非蛋白质结合的铁极少，在离体实验中 已经证明f e ( i i i ) 是稳定的，而f e ( i i ) 可在空气逐渐被氧化为f e ( i i i ) ，同时0 2 转变 成0 2 。；血细胞中氧和血红蛋白( 蛋白质血红素f e ( i i ) 0 2 ) 可转变成蛋白质 血红素f e ( i i i ) 0 2 。；在生物体内产生的h 2 0 2 ，如果没有及时被清除，则可以通过 与过渡金属离子或其化合物反应生成。 1 1 3 2 酶反应 1 1 3 2 1 黄嘌呤( 或次黄嘌呤) 氧化为尿酸 在胞浆中黄嘌呤氧化酶的催化下，黄嘌呤或次黄嘌呤可以通过单电子给予0 2 的方式氧化为尿酸，同时产生0 2 ，后者在生物体内铁离子存在的条件下可进一 步转变为h o 。有报道称，在p h 7 8 的实验条件下，通过黄嘌呤氧化酶的催化， 黄嘌呤氧化酶为尿酸的过程中，约有5 6 的电子转移属于双电子反应，其他的电 子转移为单电子反应【l 】。另外黄嘌呤氧化酶也可催化黄嘌呤以双电子给予0 2 的方 式，氧化生成尿酸，产生h 2 0 2 。 1 1 3 2 2 线粒体呼吸链有关的酶促反应 线粒体呼吸链为n a d h ，含有黄素单核苷酸( f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e ，f m n ) 与黄 素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d ef a d ) 的黄素蛋白、泛醌与细胞色素 类组成的一系列氧化还原反应。f m n 或f a d 的氧化还原反应过程中产生的半醌 自由基可以将一个电子交给0 2 生成0 2 1 1 。 1 1 3 2 3 微粒体电子传递系统 微粒体是用差速离心分离细胞器得到的核蛋白体与内置网膜【l 】。微粒体电子 传递系统中产生0 2 ，并间接产生h o 。 1 1 3 2 4 其他酶体系 n a d p h 氧化酶、铁氧还蛋白n a d p h 氧化酶，半乳糖氧化酶、色氨酸双氧 酶等都能通过酶反应产生0 2 。 1 1 4 自由基的清除与防护机制 在生物体内，除了极微量r o s 被利用以外，几乎所有的r o s 都应当及时清 除，否则r o s 会损伤生物分子，引起细胞或组织损伤从而产生更多的r o s ，进 一步加重损伤。生物体的进化过程，是在含氧丰富的大气层中实现的，因此体内 3 逐渐形成内源性的生理防护系统，以防卫r o s 的毒性；而外源性的抗氧化剂主要 取决于营养p j 。 抗氧化剂保护机制主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 预防r o s 的形成； ( 2 ) 避免反应性较低的r o s 转变成为反应性更加强烈的r o s 6 j ； ( 3 ) 有利于修复r o s 引起的损伤，激发抗氧化剂蛋白质类密码基因表达； ( 4 ) 接受r o s 的攻击，反应性的代谢产物使r o s 转变成为低反应性的分子， 或增强对r o s 攻击敏感的生物学靶结构，及物质的抵抗能力； ( 5 ) 为其他抗氧化剂能发挥有效机能提供有利的环境，作为辅助因子或者维持 其他抗氧化剂在还原状态【3 】。 机体抗氧化防御系统主要包括：酶促和非酶促两大系统。抗氧化酶系统主要 包括s o d 、过氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 、谷胱甘肽还原酶( g r ) 和6 - 磷 酸葡萄糖脱氢酶( g 6 p d ) ；非酶类抗氧化剂主要包括：脂溶性物质、维生素e 、 b 2 胡萝卜素、辅酶q 和黄酮类化合物等，以及水溶性物质、维生素c 和还原型 谷胱甘肽( g s h ) 等【7 1 。另外，微量元素( 如锌、铜、硒、锰、等) 参与酶类抗氧化 剂的生物合成，并以其自身电子传递的性质，而起着抗氧化的作用。所以微量元 素在抗氧化防御体系中占重要地位【7 】。 1 1 4 1 抗氧化酶机制 在该系统中，超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是唯一以氧自由基 为底物的酶类，而且催化效能很高；它是一类金属酶，分为m n s o d ，c u z n - s o d ， 和f e s o d 三类【引。c u z n s o d 主要存在于细胞浆中，氰化物是它的强抑制剂，但 它具有很高的耐热性；m n s o d 主要存在于线粒体中，和f e s o d 在高p h 值时， 活性都降低，不被氰化物抑制，三类s o d 中f e s o d 的活性最低【9 】。过氧化氢酶 主要集中在过氧化酶体中，主要处理由羟乙酸氧化酶和尿酸氧化酶产生的大部分 h 2 0 2 。g p x 主要存在与细胞质中，少量存在线粒体中，主要处理来自线粒体和内 质网的h 2 0 2 【1 0 j 。6 磷酸葡萄糖脱氢酶( g 6 一p d ) 是产生n a d p h 主要途径磷酸戊 糖通路的关键酶，所以有时候也作为抗氧化酶的一种【3 】。此外，在植物和细菌中 还存在非特异性的过氧化物酶，具有广泛的底物，在有h 2 0 2 物被氧化生成有颜 色的产物；牛奶和唾液中发现的乳过氧化物酶，可以把硫氰酸氧化成对细菌毒性 很大的次硫氰酸，存在于吞噬细胞中的髓过氧化物，对炎症反应有重要作用【5 】。 1 1 4 2 非酶防御机制 谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 是体内重要的抗氧化剂之一，在清除氧自由基 及其衍生物的毒性作用中起中心作用；g s h 在细胞内合成，比氧化型谷胱甘肽的 4 学位论文硕士 浓度高1 0 0 倍，在长时间运动时或者恢复期中，g s h 的合成量可能会有所增加， 但是长时间运动时的氧代谢增加，使得细胞内g s h 的浓度降低，细胞还原状态减 少1 。由于s o d 、g s h 、g p x ( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ) 等酶都存在于细胞内，所以， 在体内有还原型与氧化型两种形式的维生素c ，在细胞外充当清除氧自由基及其 衍生物的角色。维生素c 是细胞内外化学反应的一个电子供体，或者叫还原剂， 它可还原超氧化物、羟基、次氯酸以及其它活性氧化剂1 3 】；因为这些氧化剂，可 能影响d n a 转录，也可能损伤蛋白质、d n a 、或者膜的结构，所以，维生素c 在细胞抗氧化防御中起着重要的作用。维生素c 还可以淬灭h o ，直接与过氧化 氢反应，使氧化型谷胱甘肽还原成为g s h ；维生素c 可以为细胞内泡液间的维生 素e 自由基提供电子，使其还原为维生素e t 3 1 。而e 又特别容易被氧化，能保护 多不饱和脂肪酸不被氧化成为脂褐素，可以维持细胞完整，所以有一定抗氧化作 用。有研究表明维生素e 最主要的储存场所在线粒体，维生素e 的缺乏会抑制线 粒体呼吸控制；导致运动大鼠受自由基迫害增加及其耐力下降。 1 1 5r o s 的检测方法 对于r o s 量变的研究有利于掌控生物体活动的内在分子机制，但是由于r o s 的性质比较活泼，在生物体内代谢速度很快，另外机体内多种抗氧化物的存在也 给活性氧的检测带来一定难度。因此，探寻灵敏有效的r o s 的检测方法已成为研 究其生物学作用的关键【1 1 1 。超氧阴离子( 0 2 ) 、羟自由基( h o ) 、过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 、以及脂质过氧化物都是较常见的r o s 。其中0 2 的 检测方法一般采用电子顺磁共振( e l e c t r o np a r a m a g e n e t i cr e s o n a n c ee s r ) 波谱分 析以及酶学分析技术，但是前者只能能在较低温的条件下运用，并且所需要的仪 器非常昂贵，一般的实验室无法购置；后者的专一性虽然比较较高，但是灵敏度 低，而且有时因0 2 与h o 都可以产生类似的效应，常常很难鉴别检测i l j 。由于 h o 。在水中的寿命极短，常采用自旋捕捉技术间接的测出h o 的含量，像自旋捕 捉剂二甲基吡啶氧化物，它与h o 反应，生成的稳定性加合物就可以测定出h o 。 另外也可以采用气相色谱法和高效液相色谱法，测其荧光强度，可推算出机体中 h o 的含量。为了能定量测定生物体内的h o 含量，根据h o 。可使胸腺嘧啶或胸 腺嘧啶核苷羟化的原理使用羟化产物的荧光分析方法来测定h o 。，此种方法虽然 检测h o 。较专一，但是操作起来特别繁琐，药品也比较昂贵，一般的实验室使用 受到局限【1 2 】。另外由于生物系统中h 2 0 2 与0 2 在铁络合作用下可以产生h o ， 所以除了自旋捕捉或气相色谱法方法外，还可以用添加h o 。清除剂的方法，以 便观察h o 。效应是否消除或者减弱。在自由基生物学理论一书中还提到关于检测 h o 的漂白试验，h o 。可使藏花素之类的有色化合物转变为无色化合物，通过这 种漂白试验得到检测【l 】。对于水溶液中的h 2 0 2 则可采用分光光度法、碘滴定法、 5 不同训练负荷导致活性氧增加的n a d p h 氧化酶途径研究 化学发光法、荧光法等各种方法测定。在实验室中对1 0 2 的定量方法用直接检测 发光法【7 1 。脂类过氧化物的检测方法有碘释放法、酶法、共轭双键法、烃类气体 测定法等；其中酶法专一性较强，操作也相对简便，可能够准确定量，但是需要 谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) ，而该酶提纯特别麻烦，很难适应多种样品的常规分 析要求，结果偏差大【7 】；碘释放法的局限性大；共轭双键检测法，虽然简便，但 干扰因素比较多，也难于广泛应用【7 l ；烃类气体测定法同样难于广泛应用；目前， 使用较多的是丙二醛( m a l o n i cd i a l d e h y d e ，m d a ) 钡i 定法，此种办法测定的是，脂类 过氧化的最终产物m d a ，它的产量的多少就表示过氧化程度的大小，因此以m d a 作为脂类过氧化的指标【1 2 1 ，但是m d a 法的检测只能间接反映r o s 的生成量，准 确性也受到质疑。 自从r o s 成为生物学、医学等领域的研究热点以来，绝大多数研究都集中在 细胞方面，因此细胞中r o s 的检测方法也最为常见。主要分为四大类：e s r 、化 学发光法、荧光探针法及分光光度法【l 引。其中，荧光探针法具有高灵敏度、高分 辨率，具有可以提供细胞内靶分子时空信息的优点，在r o s 的研究中得到广泛应 用【1 4 l 。荧光探针是一种无色、无荧光而且稳定存在的染料分子，在与r o s 发生 反应后，探针的化学结构发生变化，将生成具有强荧光的产物，因此通过检测反 应产物的荧光强度可在一定程度上反映r o s 水平f 1 5 1 。随着研究的不断发展，检 测方法的应用也相应增多，其中运用用最广泛的荧光探针主要有 d i c h l o r o f l u o r e s c i nd i a c e t a t e( d c f h d a ) ，双氢罗丹明( d i h y d r o r h o d a m i n e ) ， h y d r o e t h i d i n e ( h e ) 1 1 1 。d c f h d a 可以很容易穿过细胞膜，在细胞内，通过细胞 液被水解为d