（免疫学专业论文）人mblmasps复合物及人血清白蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用.pdf

硕士学位论文 m b l m a s p s 复合物及人血清白蛋白 单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用 硕士研究生：马政辉 指导教师：陈政良教授 摘要 m b l m a s p s 复合物( m b l m a s p sc o m p l e x e s ) 由甘露聚糖结合凝集素 ( m a n n a n b i n d i n gl e c t i n ，m b l ) 和甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶 ( m b l a s s o c i a t e ds e r i n ep r o t e a s e s ，m a s p s ) 两类蛋白分子结合构成。m b l 为c 型凝集素超家族中胶凝素( c o l l e c t i n s ) 家族成员，是天然免疫系统中一种重要的 模式识别受体。m a s p s 与补体c l s 、c l r 同属丝氨酸蛋白酶亚家族，目前已确认 的m a s p 家族成员包括3 个丝氨酸蛋白酶( m a s p 1 、m a s p 2 、m a s p 3 ) 和1 个非酶蛋白( s m a p ) ，均可与m b l 形成复合体。人血清中m b l 含量很低，正 常人平均含量水平约1 0 m g l ，且与m a s p s 以一种大分子复合物的形式存在， 因此获取高纯度的m b l m a s p s 复合物、m b l 及m a s p s 蛋白存在困难。血循 环中的m b l m a s p s 复合物有多种，但具体种类、化学计量关系、复合物形成 的调节机制等问题仍不清楚。 m b l 可选择性识别多种病原体的糖结构，通过激活m a s p 1 、m a s p - 2 和 m a s p 3 进一步激活补体凝集素途径而发挥溶破和间接调理功能，并能与吞噬细 胞胶凝素受体( 即c l q r ) 结合而启动调理吞噬，还可介导m b l 依赖的细胞毒 作用，同时m b l 还是一个重要的粘膜表面防御分子。 血清m b l 缺陷及活性降低可导致调理吞噬作用缺损，表现为各种病原体的 反复急慢性感染。m b l 基因突变还与自身免疫病密切相关，甚至h b v 、h i v 等 特殊病原体的感染及其发展转归也与m b l 缺损有关。m a s p - 2 缺陷主要由遗传 中文摘要 多态性引起，其对感染性疾病易感性的影响目前还知之甚少。有报道m a s p 2 缺陷是化疗后感染的危险因素，肾癌患者尿液中s m a p 的含量高于健康人。 由于m b l 和m a s p s 具有上述重要作用，研究其缺损的发病机理尤为迫切， 而m b l m a s p s 复合物单克隆抗体( 单抗) 便是进行该项研究的重要工具之一。 目前国内虽然已有关于制备m b l 单抗的报道，但仍无国产商品化试剂，国外相 关试剂价格昂贵，因此，自制m b l m a s p s 单抗非常必要。 本课题的特色与创新之处在于：从一个单抗制备过程中，获得针对 m b l m a s p s 复合物及其各组成成分m b l 、m a s p l 、m a s p 2 以及其不同表位的 众多目的单抗。由于m b l m a s p s 复合物中成分复杂，因此本课题的难点在于 如何对获得的各种单抗进行特异性鉴定，从目前条件出发，我们初步的解决办 法是使用e l i s a 、w e s t e r nb l o t t i n g 、m b l 功能阻断试验并结合各成分分子量进 行综合分析。 在m b l m a s p s 复合物单抗制备、鉴定过程中，我们得到两株人血清白蛋 白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 单抗，证明用来免疫小鼠的m b l m a s p s 复 合物抗原中含有微量h s a 。h s a 是血液系统的重要组分，具有结合和运输内源 性及外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板功能及影响 动脉血管渗透性等生理作用。临床上高纯度的h s a 作为血浆容量扩充剂广泛应 用于大出血、休克、烧伤、癌症、红白细胞增多症、白蛋白过少症等。另外， 微量白蛋白尿是糖尿病肾病最早的临床表现，是心血管疾病发病率和死亡率显 著增高的一个标志，而早期监测尿微量白蛋白水平能够使个体化的积极治疗及 早实施，达到预防或延缓糖尿病肾病向终末期肾病进展的目的。鉴于上述h s a 的作用和性质，为了建立灵敏、快速、准确的微量白蛋白检测方法及h s a 提纯 方法，同时也为了进一步纯化m b l m _ a s p s 复合物抗原，使关于m b l m a s p s 复合物功能性质的研究结果更可信，我们决定应用杂交瘤技术制备h s a 单克隆 抗体作为必要的工具。 硕士学位论文 第一章：m b l - m a s p s 复合物单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 为了研究m b l 和m _ a s p s 的功能特性及其缺损时的发病机理，我们以 m b l m a s p s 复合物为抗原制备单克隆抗体，希望能够得到针对m b l m a s p s 复合物及其各组成成分m b l 、m a s p l 、m a s p 2 、m a s p 3 、s m a p 以及其不同表 位的众多目的单抗，尤其是针对m b l 与m a s p s 结合位点或二者结合后两蛋白 之间空间结构的单抗。我们采用杂交瘤技术，通过多次细胞融合及克隆化并用 h s a 作为抗原进行差减筛选，最终建立能分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。采 用e l i s a 、w e s t e r nb l o t t i n g 结合m b l m a s p s 复合物及其各组成成分分子量进 行特异性鉴定分析，并通过检测所得单抗对m b l 功能的阻断作用进一步证明其 特异性。结果总计获得2 2 株可能分泌m b l m a s p s 复合物单抗的杂交瘤细胞， 经抗体亚类( 型) 鉴定，其中1 0 株为i g m 亚类，其余1 2 株为i g g 亚类。对于 i g m 亚类单抗，我们只用间接e l i s a 法进行了初步鉴定，而对i g g 亚类单抗则 进一步用了w e s t e r nb l o t t i n g 和m b l 功能阻断试验做了鉴定。结果表明1 2 株i g g 亚类单抗中，有7 株可能针对m b l 二聚体或m b l ( - 聚体) m a s p 2 ( 单体) ；l 株 针对m b l 单链或m b l 多聚体；1 株针对m b l 单体、m b l 三聚体( 含) 以上 多聚体；1 株针对m b l 三聚体，其余两株分别针对m a s p l 和m a s p 3 。其中5 a 7 杂交株与商品化m b l 抗体w e s t e r nb l o t t i n g 结果相同。我们选取5 a 7 和1 c 8 两 株单抗进行了m b l 功能阻断试验，发现二者均能抑制m b l 对p b m c 分泌细胞 因子几6 、i l 2 及刀阶h 的刺激作用，由此印证了这两株单抗与m b l 结合的特 异性。而1 2 株i g g 亚类单抗中有无针对m b l 与m a s p s 结合位点或二者结合后 两蛋白之间空间结构的单抗还需进一步鉴定。此外，我们还对纯化的 m b l m a s p s 复合物单抗进行了辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h i 冲) 的标记，为以后建立m b l m a s p s 复合物及其相关成分的e l i s a 检测体系做准 备。总之，通过使用杂交瘤技术，我们获得了m b l m a s p s 复合物的多种单抗 并进行了初步鉴定，基本达到了预期目的，为后续的m b l 功能特性、缺陷时发 病机理以及蛋白分离提纯等研究工作提供了重要工具。 i i i 中文摘要 第二章：人血清白蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 为了建立灵敏、快速、准确的h s a 定量方法及分离提纯方法并进一步纯化 m b l m a s p s 复合物抗原，我们应用杂交瘤技术制备h s a 单克隆抗体，希望利 用h s a 单抗建立双抗体夹心e l i s a 检测体系并制备抗体偶联亲和层析柱。通过 细胞融合及克隆化筛选，建立特异性杂交瘤株。采用e l i s a 、w e s t e r nb l o t t i n g 进行特异性鉴定分析，通过交叉配对法选择合适的夹心e l i s a 抗体对，利用棋 盘滴定法确定包被抗体和检测抗体的适宜工作浓度，制备h s a 单抗与c n b r a c t i v e ds e p h a r o s e4 b 偶联的亲和层析柱并鉴定其对h s a 和m b l m a s p s 复合物 的分离纯化效果。结果总计获得2 0 株分泌h s a 单抗的杂交瘤细胞，经抗体亚 类( 型) 鉴定均为l g g 亚类，所得单抗经辛酸硫酸铵法纯化后全部用简易过碘 酸钠法进行了h r p 标记。间接e l i s a 法和w e s t e r nb l o t t i n g 对各个单抗特异性鉴 定结果良好。我们对其中1 c l l 、2 e 9 、3 a 5 、4 h 1 四株单抗进行了较深入的研究， 并初步建立了3 a 5 - 2 e 9 和2 e 9 2 e 9 两个双抗体夹心e l i s a 检测体系。前者标准 曲线为y = o 1 7 6 4 l n ( x ) 0 2 3 7 8 ，r 2 = 0 9 6 8 9 ：后者为y = 0 1 6 7 6 l n ( x ) 0 2 0 7 9 ， = 0 9 6 6 3 ：二者检测范围和灵敏度均相同，分别为1 6 - - 2 0 0 0 n g m l 和8 n g m l ，灵 敏度均满足尿微量白蛋白检测要求，但仍有待进一步完善和临床考核。我们用 单抗1 c l l 成功制备了抗体偶联亲和层析柱，w e s t e r nb l o t t i n g 结果表明，该层析 柱能够较好地分离提纯人血清和m b l m a s p s 复合物中所含的h s a ，换言之， 能够去除m b l m a s p s 复合物中的h s a 杂质，但去除杂质后m b l m a s p s 复合 物的功能活性尚有待进一步鉴定。 关键词：m b l m a s p s 人血清白蛋白单克隆抗体e l i s a m ss t u d e n t ：m a z h e n g h u i a d v i s o r ：p r o f e s s o rc h e nz h e n g l i a n g a b s t r a c t m b l - m a s p sc o m p l e x e sa r ec o m p o s e db yt w ot y p e so fp r o t e i nm o l e c u l e s ， n a m e l yt h em a n n a n - b i n d i n gl e c t i no v i b l ) a n dm b l a s s o c i a t e d s g r i n ep r o t e a s e ( m a s p s ) a saf a m i l ym e m b e r o fe o l l e e t i n s ，m b li sa ni m p o r t a n tp a t t e r nr e c o g n i t i o n r e c e p t o ro fi n n a t ei m m u n n i t y m a s p sa n dc o m p l e m e n tc l s c lra l em e m b e r so f s e r i n ep r o t e i n a s es u b f a m i l y a tp r e s e n tt h ec o n f i r m e dm a s p f a m i l ym e m b e r si n c l u d e 3 s e r i n ep r o t e a s e s ( m a s p - 1 、m a s p - 2 、m a s p 一3 ) a n d1 n o n - e n z y m a t i cp r o t e i n ( s m a p ) ，a l lo fw h i c hc a l lm a d ec o m p l e x e s 谢t hm b l t h e r ei sv e r yl i t t l em b l i n h u m a ns e r u m - a v e r a g e l y1 0 m g lf o rn o r m a lp e o p l e ，w h i c he x i s t si nt h ef o r mo fa s u p r a m o l e c u l a rc o m p l e x 、j v i mm a s p s h e n c et h ed i f f i c u l t yt oo b t a i nh i g h - p u r i t y m b l - m a s p s c o m p l e x e sa n dm b l m a s p sp r o t e i n t h e r ea r em u l t i p l em b l - m a s p s c o m p l e x e si nb l o o dc i r c u l a t i o n , y e tt h er e m a i nm a n yu n k n o w nq u e s t i o n sa b o u tt h e i r a c t u a l t y p e s ，s t o i c h i o m e t r i cr e l a t i o n s h i p ，a d j u s t i n g m e c h a n i s m d u r i n gc o m p l e x f o r m a t i o n , e t e b e s i d e ss e l e c t i v er e c o g n i t i o nt o w a r d sc a r b o h y d r a t eo fv a r i o u sp a t h o g e n s ，m b l c a na l s o a c t i v a t et h e c o m p l e m e n tc a s c a d ev i al e c t i np a t h w a yt h r o u g hm a s p 一1 ， m a s p 一2a n dm a s p - 3 ，w h i c hf u r t h e re n h a n c em e d i c a t i n ga n dr e g u l a t o r yf u n c t i o n s i t g a l la l s oc o m b i n eclq rt os t a r to p s o n o c y t o p h a g i cp r o c e s s ，m e d i c a t et h em b l d e p e n d e n tc y t o t o x i c i t y , a n df u n c t i o na sam a j o rm o l e c u l ei nm u c o u sm e m b r a n e a b s t r a c t d e l e n s e s e r u mm b ld e f e c t sa n dd e c r e a s e da c t i v a t i o nc a nl e a dt oo p s o n i z a t i o nd e f i c i e n c y , w h i c hr e s u l t i n gi nr e p e a t e da c u t eo rc h o m ci n f e c t i o no fv a r i o u sp a t h o g e n s m b l g e n em u t a t i o nh a sc l o s er e l a t i o n s h i p 、 r i t t la u t o i m m u n ed i s e a s e s e v e nt h ei n f e c t i o n , d e v e l o p m e n ta n do u t c o m eo fs p e c i a lp a t h o g e n sl i k eh b v a n dh i vh a ds o m e t h i n gt o d 0w i t l lm b ld e f e c t s t h ed e f e c t i n go fm a s p - 2i s m a i n l yc a u s e db yg e n e t i c p o l y m o r p h i s m ，a n di t ss u s c e p t i b i l i t yi m p a c tt o w a r d si n f e c t i o u sd i s e a s e si ss c a r c e l y k n o w n i tw a sr e p o r t e dt h a tm a s p - 2 d e f e c t i n g i sah a z a r d o u sf a c t o r f o r p o s t - c h e m o t h e r a p yi n f e c t i o n , a n dt h ei l r i n es m a pl e v e lf o rk i d n e yc a n c e rp a t i e n t si s h i g h e rt h a nh e a l t h yp e o p l e a sm b la n dm a s p sh a v et h ea b o v ee s s e n t i a lf u n c t i o n s ，i ti si m p e r a t i v et os t u d y p a t h o g e n e s i sf o rt h e i rd e f e c t s ，a n dt h em b l - m a s p sm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) i s o n eo ft h em a j o rt o o l si nr e s e a r c h i n g a tp r e s e n tt h e r ew a sr e p o r t sa b o u tm b lm c a b p r e p a r a t i o ni nc h i n a , y e tt h e r ei s s t i l ln od o m e s t i cc o m m e r c i a l i z e dp r o d u c t i o no f r e a g e n t sw h i l et h ef o r e i g nc o u n t e r p a r t s a r eq u i t ee x p e n s i v e h e n c et h eu r g e n t d e m a n d sf o rn a t i o n a lp r o d u c t i o no fm b l - m a s p sm c a b t h eu n i q u ec h a r a c t e ra n di n n o v a t i v ep a r to ft h i ss t u d yl i e si n ：f o r mt h ep r e p a r i n g o fo n em c a b ，o b t a i nm c a b so fm u l t i p l ep u r p o s e sw h i c hc o r r e s p o n d i n gt o m b l - m a s p sc o m p l e x e sa n dm b l ，m a s p1 ，m a s p 2 & c o n s t i t u e n t so fv a r i o u s e p i t o p c b e c a u s em b l - m a s p sc o m p l e x e sh a v ec o m p l i c a t e dm a k e u p ，t h ed i f f i c u l t y o ft h i ss t u d yl i e si nt h es p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o no fv a r i o u sm c a b so b t a i n e d v i at h e a v a i l a b l ee q u i p m e n t s ，o u ri n i t i a lp r o p o s e ds o l u t i o ni st ou s ee l i s a , w e s t e r nb l o t t i n g a n dm b lf u n c t i o nb l o c k i n gt e s t s ，a n dc o m p r e h e n s i v ea n a l y s i sw h i c ht a k e si n t o c o n s i d e r a t i o no fc o n s t i t u e n t sm o l e c u l a rw e i g h t s i nt h ep r o c e s so fm b l - m a s p sm c a bp r e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n , w eh a d t w os t r a i n so fh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) m c a b ，w h i c hp r o v e st h a tm b l - m a s p s c o m p l e xa n t i b o d yw e u s e df o rm i c ei m m u n i z a t i o nc o n t a i n ss m a l la m o u n to fh s a a s a l le s s e n t i a lp a r to fh e m a t o l o 西c a ls y s t e m , h s a sf u n c t i o n si n c l u d ec o m b i n i n ga n d t r a n s p o r t i n ge n d o g e n o u sa n de c t o g e n o u sm a t t e r , s u s t a i nb l o o dc o l l o i d o s m o t i c p r e s s u r e ，e r a d i c a t ef t e er a d i c a l s ，c o n t r o lf u n c t i o n so fp l a t e l e ta n di n f l u e n c em e r y s 硕士学位论文 o s m o t i ct r a i t s i nc l i n i c a lu s e ，l l i 曲- g r a d ch s aa 豫w i d e l yu s e da sp l a s m av o l u m e e x p a n d e ri nt r e a t m e n to fm a s s i v eh e m o r r h a g e ，s h o c k ，b u r n , c a n c e r , p o l y c y t h e m i aa n d l e u k o c y t o s i s ，h y p o a l b u m i n e m i a , e t c w h a t sm o r e ，m i c m a l b u m i n u r i ai st h ee a r l i e s t c l i n i c a lm a n i f e s t a t i o no fd i a b e t e s r e n a ld i s e a s e s ，a sw e l la sas i g n a lf o rm a r k e d l y h i g h e rc a r d i o v a s c u l a r d i s e a s em o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yr a t e s e a r l ym o n i t o r i n go f m i c r o a l b u m i n u r i ag a sb r i n ge a r l ya n da c t i v ei n d i v i d u a lt r e a t m e n t , w h i c hc a np r e v e n t o rs l o wt h ep r o c e s s i n go fd i a b e t e s r e n a ld i s e a s e st u r n i n gi n t oe n d - s t a g ed i a b e t i c r e n a ld i s e a s e s w i t ht h ea b o v eh s af u n c t i o n sa n dt r a i t s ，i no r d e rt oe s t a b l i s hak e e n , f a s ta n da c c u r a t em i c m a l b u m i n u r i at e s t i n gm e t h o da n dh s a p u r i f i c a t i o nm e t h o d , a s w e l la st of u r t h e r 删匆m b l m a s p sc o m p l e xa n de n a b l et h er e s e a r c ho ft h e c o m p l e x e st ob em o r et r u s t w o r t h y , w eh a v ed e c i d e dt oa p p l yh y b r i d o m at e c h n i q u et o p r e p a r eh s am c a b c h a p t e ro n e ：p r e p a r a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n di n i t i a la p p l i c a t i o no f m b l - m a s p sc o m p l e xm o n o c l o n a ia n t i b o d y t os t u d yt h es p e c i a lf u n c t i o nt r a i t so fm b la n dm a s p s ，a sw e l la st h e p a t h o g e n e s i so ft h e i rd e f e c t i n g ，w eh a dp r e p a r e dm c a bw i t hm b l m a s p s c o m p l e x e sa sa n t i g e n , i nt h eh o p eo fo b t a i n i n gm u l t i p l em e a b si na c c o r d a n c ew i t h m b l - m a s p sc o m p l e x e s ，m b l ，m a s p l ，m a s p 2 ，m a s p 3 ，s m a pa n dc o n s t i t u e n t s o fv a r i o u s 印i t o p e ，e s p e c i a l l yt h em e a bt h a ta i m sa tm b l - m a s p sb i n d i n gs i t eo rt h e p r o t e i ns t r u c t u r ea f t e rt h et w oi n t e g r a t e d a p p l y i n gh y b r i d o m at e c h n i q u e , w eh a d c a r r i e do u tm u l t i p l ec e l lf u s i o na n dc l o n i n g , a sw e l la sh u m a ns e r u ma l b u m i ni n s u b t r a c t i v es c r e e n i n g , a n df i n a l l ye s t a b l i s h e dt h eh y b r i d o m ac e l ls t r a i nw h i c hc a l l s e c r e t es p e c i f i cm c a b b yc o m b i n gt h eu s eo fe l i s a & w e s t e r nb l o t t i n g 谢m m o l e c u l a rw e i g h t sm e a s u r e m e n tf o rm b l m a s p sc o m p l e x e sa n dc o n s t i t u e n t si n s p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o na n da n a l y s i s ，a n df u r t h e re x a m i n i n gt h es p e c i f i ct r a i t sb y m e a s u r i n gt h em c a b sb l o c k i n gf u n c t i o nt om b l ，w eh a da c q u i r e d2 2h y b r i d o m a c e l ls t r a i n sw h i c hc a np o s s i b l ys e c r e t em b l - m a s p sc o m p l e x e sm c a b s a f t e r s u b g r o u pi d e n t i f i c a t i o n , 10s t r a i n sb e l o n gt oi g ms u b g r o u pw h i l et h eo t h e r 12i g g s u b g r o u p f o rt h ei g ms u b g r o u p ，w ec a r r i e do u ti n i t i a li d e n t i f i c a t i o nv i ai n d i r e c t i “ a b s t r a c t e l i s a ；w h i l ef o rt h ei g gs u b g r o u p ，f u r t h e ri d e n t i f i c a t i o nw e r e d o n et h r o u g hw e s t e r n b l o t t i n ga n dm b lb l o c k i n g t h er e s u l ts h o w e dt h a ta m o n gt h e1 2i g gm c a b s ，7 m i g h ta i ma tm b ld i m e ro rm b l ( d i m e r ) - m a s p 2 ( m o n o m e r ) ，1a i ma tm b ls i n g l e c h a i ro rm b lm u l t i m e r ；1a i ma tm b lm o n o m e ro rm b lt r i m e r ；1a i ma tm b l t r i m e r , w h i l et h eo t h e rt w oa i ma tm a s p 1a n dm a s p 3 r e s p e c t i v e l y a m o n gt h e s e ， t h e5 a 7h y b d d o m as t r a i nd i s p l a y e ds a m ew e s t e r nb l o t t i n gr e s u l t sa st h o s eo f c o m m e r c i a lm b l a n t i b o d y w eh a dc h o s e n5 a 7a n d1c 8i nm b l f u n c t i o nb l o c k i n g t e s t sa n df o u n db o 廿1o ft h e mc a nb ea b l et or e s t r a i nm b u ss t i m u l a t i o nt o w a r d s p b m cs e c r e t i n gc y t o k i n ei l 一6 ，i l 一2a n di f n 吖，w h i c hp r o v e st h et w os t r a i n s m b l s p e c i f i c n e s s f o rt h e12i g gs u b g r o u pm e m b e r s ，w h e t h e rt h e r ew e r ea n ym c a b st h a t a i ma tm b la n dm a s p s b i n d i n gs i t eo rt h ep r o t e i ns t r u c t u r ea f t e rt h et w oi n t e g r a t e d , f u r t h e ri d e n t i f i c a t i o n sa r es t i l ln e e d e d b e s i d e s ，w ec a r r i e do u th o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h g p ) m a r k i n gt o t h ep u r i f i e dm b l - m a s p sc o m p l e xm e a b ，w h i c hp r e p a r e df o r e s t a b l i s h m e n to ff u r o r ee l i s ae x a m i n a t i o ns y s t e mf o rm b l - m a s p sc o m p l e x e sa n d r e l a t i v ec o n s t i t u t e s t os u mu p ，t h r o u g hh y b r i d o m at e c h n i q u e s ，w eh a do b t a i n e d m u l t i p l em b l - m a s p sc o m p l e x e sm c a b sa n dc a r r i e do u tp r i m a r yi d e n t i f i c a t i o n , w h i c hb a s i c a l l yr e a c h e do u rp l a n n e dg o a la n dp r o v i d e di m p o r t a n tt o o l s f o r s u b s e q u e n tr e s e a r c hw o r k sl i k em b l f u n c t i o n a lt r a i t s ，m b ld c f e c t sp a t h o g e n e s i s ， p r o t e i ni s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , e t c c h a p t e r t w o ：t h ep r e p a r a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dp r i m a r ya p p l i c a t i o n o fa l b u m i nh u m a ns e r u mm o n o c l o n a la n t i b o d y i no r d e rt oe s t a b l i s hak e e n , f a s ta n da c c u r a t em i c r o a l b u m i n u r i at e s t i n gm e t h o d a n dh s a p u r i f i c a t i o nm e t h o d ，嬲w e l l 嬲t of u r t h e rp u r i f ym b l - m a s p sc o m p l e x , w e h a v ed e c i d e dt oa p p l yh y b f i d o m at e c h n i q u et op r e p a r eh s am e a b ，h o p i n gt h a th s a m e a bc a nh e l pt ob u i l dd o u b l e - a n t i b o d ys a n d w i c he l i s ad e t e c t i o ns y s t e 皿a n dt o p r e p a r ea n t i b o d yc o n j u g a t e da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n t h r o u g hm u l t i p l ec e l l f u s i o na n dc l o n i n gs c r e e n i n g ，w eh a de s t a b l i s h e ds p e c i f i ch y b r i d o m ac e l ls t r a i n b y c o m b i n gt h eu s eo f e l i s a & w e s t e r nb l o t t i n gi ns p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o na n da n a l y s i s ， u s i n gt h em e t h o do fc r o s s - m a t c ht oc h o o s et h et w os u i t a b l ea n t i b o d i e so fe l i s a , 硕士学位论文 a p p l y i n gc h e s s b o a r dt i t r i m e t r i c m e t h o dt od e t e r m i n ea p p r o p r i a t ew o r k i n gc o n - c e n t r a t i o no fc o a t i n ga n t i b o d ya n dd e t e c t i n ga n t i b o d y , m a k i n ga n t i b o d yc o n j u g a t e d a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yc o l u m nw i t hh s a m e a ba n dc n b ra c t i v e ds e p h a r o s e4 b i nt h ee n d , at o t a lo f2 0h y b r i d o m ac e l ls t r a i n sw h i c hc a ns e c r e t eh s am c a b sw e r e a c q u i r e d , w h i c hw e r ei n d e n t i f i e d a si g cs u b g r o u p a l lm c a b so b t a i n e dw e r ep u r i f i e d t l l r o u g ho e