（作物遗传育种专业论文）紫菜细菌人工染色体文库的构建和海藻糖合成酶基因的研究.pdf

刖云 海藻不仅有很高的经济实用价值，也有重要的研究价值。紫菜作为大型经济海藻， 其产量居世界首位。在过去的几十年里，对经济海藻的研究主要集中在品种的鉴定和 栽培，以及与增产增值相关的生物技术和生产应用领域上，已取得一定的进展。在细 胞组织、遗传发育、基因工程等方面，海藻的研究相对于陆生植物起步较晚，研究的 范围也多限于栽培、养殖和加工等领域，以及质体基因的分子生物学研究。目前，在 藻类细胞器结构基因组的研究方面已有紫菜叶绿体和线粒体全序列分析及一些编码 基因研究的报道，但在海藻功能基因组学研究方面报导还很少。欧美的研究者主要工 作是运用分子生物学资料，揭示藻类系统进化和对线粒体及叶绿体细胞器基因组的研 究。闩本及韩国具有良好的紫菜、海带、裙带菜养殖加工的基础，在基因组研究方面， 已完成了紫菜上万个编码序列标签( e s t ) 可供上网查询，但至今尚未有海藻的大片 段基因组文库构建和核基因被克隆的报道。 为了深入开发和利用海藻资源，除了提高产量外，通过生理生化以及遗传发育等 相关领域的深入研究，并通过对海藻基因及功能的研究，从而发掘和改造新的品质资 源将成为一条海藻育种和基础研究的新途径。本试验室在植物分子生物学研究中有分 子标记、基因定位、构建基因文库等方面的很好基础。此前在紫菜分子标记方面也已 作过大量工作，又与中科院海洋所、上海水产大学及江苏海洋水产研究所有着良好的 协作关系，对生产和科研上所用的品种有所了解，而且有丰富的实验材料来源。在分 子生物学技术飞速发展的今天，开展有关海藻基因组的研究将为研究海藻功能基因打 下坚实的基础，因此构建进行基因组研究的技术平台是必须的，也是可行的。 在众多的基因组文库中，b a c 文库能够很好的应用于基因的图位克隆、基因组 物理图谱的构建、基因组测序、基因的组织结构分析以及基因表达调控和基因转化等 研究中，它们在备类生物的基因组计划中已经发挥了重要作用。凼此一个高质量的基 因组文库的成功构建将会促进海藻研究的发展，也会为其它海洋植物基因组文库的构 建和利用提供借鉴作用。 海藻糖( 旺一d g l u c o p y r a n o s y l - 【l ，lj 一旺一d g l u c o p y r a n o s e ) 是一种广泛存住于自然界 中的非还原性双糖，由两个分子葡萄糖构成。人们已经在很多生物巾发现有海藻糖的 存在，包括细菌、海藻、真菌、酵母( 啤酒酵母) 、和低等动植物。研究表明它的存 在能使生物体提高抵抗温度、p h 等变化的能力，并且在干旱条件下，它还能够稳定 细胞内的生物结构。由于海藻糖有这些特性，人们认为它是一种很有前景的食品稳定 剂，药品添加剂和植物抗逆的保护剂，目前很多研究者正设法分离有关海藻糖合成酶 的基因，应用生物工程的手段引入植物，提高植物抗干旱、抗盐碱的能力，培育优良 的品种，达到遗传改良的目的。因此海藻糖的相关研究越来越引起人们的关注。 本研究中，我们在国家海洋8 6 3 项目和国家自然科学基金项目的资助下，开展 了紫菜b a c 文库的构建工作，并用已报道的紫菜中与其它物种海藻糖合成酶基因同 源的一段e s t 序列为探针对此文库进行了筛选，从中筛选出含海藻糖合成酶基因的 三个克隆池。随后对此基因进行了克隆，并将进行在原核和真核生物中表达以及功能 鉴定等方面的研究，目的是希望了解海藻糖合成酶基因在海藻中的结构和生理功能， 也希望它能作为一个抗逆基因用于进行农作物遗传改良方面的研究。 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人己经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示溅意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名：震掺 签字日期：游( 7 月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用誉奄含里l 檠酊爱銮痢鳓撂臻；粪擎篓 鳓垂蠢罐；璐茁孓颈蛄能直 接和服务器进行通讯，能够直接访问数据库。 ( 3 )安全 有些c g i 版本有明显的安全弱点。即使使用最新的标准和p e r l 等语 言，系统也没有基本的安全框架。而j a v a 定义有完整的安全机制，包括 s s l 、c a 认证、安全策略等规范。 ( 4 )小巧 j a v as er v l e t 使用j a v a 编写，遵循标准a p i 。它能直接或借助插件 在几乎所有we b 服务器上运行。 絷一部分文献综述第一章植物基因组学研究概况 第一部分文献综述 第一章植物基因组学研究概况 基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，基因组学主要研究内容是生物基因 组的结构与功能，因而是研究生命现象本质的一门科学。在植物基因组学的研究过程 中打破了以往在单个基因水平上进行研究的模式，以整个生物基因组内基因的结构 与功能为研究内容。植物基因组计划作为基因组计划的重要组成部分，其研究领域有： 结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学等( ”。目前世界上的植物基因组计划主 要有拟南芥基因组计划、水稻基因组计划、麦类基因组计划、玉米基因组计划等。植 物基因组计划近年来取得了巨大的进展，产生了一系列的理论与方法，从而发展成为 一门囊摧蟠掣吉美葡 苣ji 往配合v o 来简化数据的读写和 传递。主要目的是为了避免数据库读写的代码充斥在应用程序中，解决 应用程序在持久性存储问( 如不同的关系数据库) 迁移时所导致的访问 数据库等代码重写问题。 使用d a o 模式来抽象和封装所有对数据源的访问。d a o 管理着与数 据源的连接以便检索和存储数据。 d a o 实现了用来操作数据源的访问机制。数据源可以是r d b m s ， l d a p ，f “e 等。依赖于d a o 的业务组件为其客户端使用d a 0 提供更简 单的接口。d a o 完全向客户端隐藏了数据源实现细节。由于当底层数据 源实现变化时，d a 0向客户端提供的接口不会变化，所有该模式允许d a o 调整到不同的存储模式，而不会影响其客户端或者业务组件。重要的是， d a 0 充当组件和数据源之间的适配器。 数据采集系统中对d a x 絷一部分文献综述第一章植物基因组学研究概况 第一部分文献综述 第一章植物基因组学研究概况 基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，基因组学主要研究内容是生物基因 组的结构与功能，因而是研究生命现象本质的一门科学。在植物基因组学的研究过程 中打破了以往在单个基因水平上进行研究的模式，以整个生物基因组内基因的结构 与功能为研究内容。植物基因组计划作为基因组计划的重要组成部分，其研究领域有： 结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学等( ”。目前世界上的植物基因组计划主 要有拟南芥基因组计划、水稻基因组计划、麦类基因组计划、玉米基因组计划等。植 物基因组计划近年来取得了巨大的进展，产生了一系列的理论与方法，从而发展成为 一门新兴学科一植物基因组学。目前取得的主要进展有：1 发现了一系列的分子标 记；2 绘制出了水稻、小麦、玉米等主要单子叶农作物和拟南芥等双子叶模式植物的 高密度的遗传图谱及水稻的精细物理图谱等；3 对许多重要的农艺性状基因进行了定 位、作图与标记：4 发现了禾本科作物基因组间的保守性及部分非同源染罂恭堡坦缝 上矗：l ：簇翔影酯辖理i 创一游罐港磷嘣耐挚摧羹前囊群型ig j 器鬣匐鑫舞耕蟠 鲥掣稹笔算麓茗噶曛曦研蛄强瑚。薹岩墨随噶港 t o b j e c t m o d e l ) 、j do m ( j a v ad o c u m e n to b j e c tm o d e l ) 。这样程序可以从树的顶部 开始遍历，按照从一个树单元到另一个单元的引用，从而找到需要的信 息。 3 、可以用解析器读取文档，当解析器发现标签时告知程序它发现的 标签。例如它会告知它何时发现了一个开始标签，何时发现了一些特征 数据，以及何时发现了一个结束标签等等。这实质上是事件驱动接口， 因为解析器告知应用程序它遇到的有含义的事件，如s a x ( s i m p l e a p if o r x m l 、。 3 2 2 支持x m l 的相关技术介绍 1 、d o m d o m 是h t m l 和x m l 文档的编程基础，它定义了处理执行文档的 途径。编程者可以使用d o m 增加文档、定位文档结构、添加修改删除文 第一部分文献综述第一章植物基因组学研究概况 拟南芥、水稻的全基因组测序工作都已完成，随之将产生数以亿计的d n a 序列数据。 为了分柝这些基因组d n a 序列的结构与功能，一门新的学私卜一生物信息学 ( b i o i n f 0 h 1 1 a l i c s ) 已得到了很大的发展。应用生物信息学的原理与方法，对基因组测序 的巨大数据库进行分析，将会显著地加快基因克隆的速度，并将最终阐明植物基因组 的全部基因。 1 植物基因组学研究的几个重要领域 1 1 结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o r i l i c s ) 结构基因组学主要是研究d n a 的顺序排列，包括遗传图、物理图的绘制、转录 图谱、基因组序列的测定以及解读、注释分析基因组序列等方面的内容。通过分析基 因组序列能够获得基因组结构的完整信息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的 闸隔区结构，启动子的结构以及内含子的分布等。 目前，在植物结构基因组的研究上，对部分主要农作物进行了遗传图谱构建， 列一些重要基因，特别是数量性状位点( o t l ) 的标记、定位和作图。构建了许多重 要农作物的b a c 文库，为其物理图谱构建和基因的图位克隆提供了有力的工具。已 经绘制出水稻、小麦、玉米等主要农作物的高密度的遗传图谱及水稻的物理图谱等。 随着d n a 测序水平和计算机运算速度的提高，使得大规模测序成为可能。现在已经 完成了拟南芥和水稻的全基因组序列测定( 2 “。 l2 功能基因组学( 凡n c t i o n a lg e n o m i c s ) 功能基因组学又往往被称为后基因组学( p o s t g e n o m i c s ) ，它利用结构基冈组学所 提供的信息和产物，应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基凶的 功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行 的系统研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能 研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生 物学功能，如作为蛋白激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰：细胞学功能，如参与细胞 问和细胞内信号传递途径：发育上的功能，如参与形态建成等。采用的手段包括经典 的减法杂交、差示筛选、c d n a 代表差异分析以及m r n a 差异显示等。但由于这些 技术不能对基因进行全面系统的分析，因而又相继发展了一些新的技术包括基到表达 2 第一部分文献综述第一章植物基因组学研究概况 拟南芥、水稻的全基因组测序工作都已完成，随之将产生数以亿计的d n a 序列数据。 为了分柝这些基因组d n a 序列的结构与功能，一门新的学私卜一生物信息学 ( b i o i n f 0 h 1 1 a l i c s ) 已得到了很大的发展。应用生物信息学的原理与方法，对基因组测序 的巨大数据库进行分析，将会显著地加快基因克隆的速度，并将最终阐明植物基因组 的全部基因。 1 植物基因组学研究的几个重要领域 1 1 结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o r i l i c s ) 结构基因组学主要是研究d n a 的顺序排列，包括遗传图、物理图的绘制、转录 图谱、基因组序列的测定以及解读、注释分析基因组序列等方面的内容。通过分析基 因组序列能够获得基因组结构的完整信息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的 闸隔区结构，启动子的结构以及内含子的分布等。 目前，在植物结构基因组的研究上，对部分主要农作物进行了遗传图谱构建， 列一些重要基因，特别是数量性状位点( o t l ) 的标记、定位和作图。构建了许多重 要农作物的b a c 文库，为其物理图谱构建和基因的图位克隆提供了有力的工具。已 经绘制出水稻、小麦、玉米等主要农作物的高密度的遗传图谱及水稻的物理图谱等。 随着d n a 测序水平和计算机运算速度的提高，使得大规模测序成为可能。现在已经 完成了拟南芥和水稻的全基因组序列测定( 2 “。 l2 功能基因组学( 凡n c t i o n a lg e n o m i c s ) 功能基因组学又往往被称为后基因组学( p o s t g e n o m i c s ) ，它利用结构基冈组学所 提供的信息和产物，应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基凶的 功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行 的系统研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能 研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生 物学功能，如作为蛋白激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰：细胞学功能，如参与划竞 再羹葡增囊嚣臻嚣张鲥铒；引残善鍪眇窆。黼醴铬驰鲤塑萋：测纠髯套吵垂匿莅蛰 x 第一部分文献综述第一章植物基因组学研究概况 系列分析、c d n a 微阵列、d n a 芯片等。 1 3 生物信息学( b i o i n f o m a t i c s ) 生物信息学是以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学 的理论和方法去研究生命现象，组织和分析生物信息数据的一门科学。首先是研究作 为遗传物质载体的d n a 及其编码的蛋白质：然后以计算机为工具，研究各种学科交 叉的生物信息学的方法，找出其规律性，进而发展出适合它的各种软件；对逐步增长 的d n a 和蛋白质的序列和结构进行收集、整理、发布、提取、加工、分析和发现。 生物信息学由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。其关注的研究热点包括： 序列对比，基因识别和d n a 序列分析，蛋白质结构预测，分子进化，数据库中知识 发现等眠扪。目前除e m b l ( e u r o p e 柚m o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y ) ，g e n b a n k ( 由 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o m l a t i o n ，n c b i ) 和d d b j ( d n ad a d ab a n ko f j a p a n ) 等大型生物信息网站外，拟南芥、水稻、小麦、棉花、玉米等植物数据库也都 相继建成。 l4 比较基因组学( c o m p a r a t i v eg e n o m i c s ) 比较基因组学是基于基因组物理图谱和序列测定的基础之上的，利用生物信息学 手段对已知的基因和基因组结构进行比较，从而了解基因的功能、表达机理和物种进 化的一门学科。通过寻找种内、种属间产生基因结构差异的分子基础，以期获取与目 的性状相关的基因。通过比较基因组学研究，已经发现了禾本科作物基因组问的保守 性及部分非同源染色体的重排现象和植物不同抗病基因在结构上的同源性或保：于性 7 。”。目前，随着多种生物，尤其水稻与拟南芥全基因组测序的完成，有越来越多的 数据可以被直接利用。 2 植物功能基因组的研究方法 2 1 应用模式植物深入研究植物基因组 2 1 1 双子叶模式植物拟南芥 由于拟南芥的基因组小、生育期短、植株小，在实验室容易培养等特点，已经成 为深入研究双子叶植物基因组的模式植物。拟南芥约有2 5 ，9 0 0 个基因，其中仅有l o o o 第一部分义献综述第一章植物基因组学研究概况 个左右的基因已经通过直接的实验证明确定了功能。目前通过对公共数据库中基因序 列的比较，可以确定拟南芥大约5 5 的基因没有生物学上的作用。现计划用十年时 间，对拟南芥的每个基因进行一次或多次实验，这些实验将使特定的基因失活或得到 全面的表达。作为结果的表现型将通过所有可用的标准加以检测，包括全基因组 m r n a 表达图和代谢曲线等。最终将可以获得下述有关的综合信息：每种基因在何 时何处表达；蛋白质在何处定位：如何修正蛋白质：基因产物与何种其他蛋白质相互 作用。9 0 0 多种蛋白激酶的作用底物将被了解，每种转录因子控制的启动子将得到确 认。拟南芥特有的信息与其他物种同系物的信息联系起来的巨型数据库，将有助于理 解从多种分析中得到的信息。在基因组中有明显功能的基因，其多种突变体的表现型 将得到确认。这样获得的信息不仅可用于推断基因及其表达产物特有的功能而且还 可推断每个基因在生物有机体生长和发育过程中的作用。这种信息还将用于研究所有 其它的植物基因。 2 12 单子叶模式植物水稻 在重要粮食作物研究方面，水稻的基因组相对较小，是研究单子叶作物的重要模 式植物。国际水稻基因组测序计划始于1 9 9 8 年，测序对象为日本粳米，由中国、同 本、美国等1 0 个国家和地区参加。2 0 0 2 年底，国际水稻基因组测序计划己圆满完成， 共测定碱基对3 亿6 千6 0 0 万个，精确度达到9 9 9 9 ，并预测遗传基因6 2 4 3 5 个。 该工程的完成将使人们可以利用遗传途径改良水稻品种，并为解读其它谷物的基因排 序提供帮助。中国科学家完成了第4 号染色体精确测序图。测序图拼接后总长为3 5 0 0 力个碱基对，精确度为9 9 9 9 ，覆盖染色体全长序列9 8 ，达到了国际公认的基因 组测序完成图的标准( m ) 。最近我国科学家又在世界上首次完成的水稻基因组“精细 圈”，覆盖率达9 7 ，其中9 7 的基因被精确定位在染色体上。“精细图”绘制了水稻 哑种内和亚种间分子遗传标记图谱，并提供了大量的基因多念性位点，这些标记可以 用来鉴别基因的起源和进化，追踪它们在遗传群体和杂交过程中的分布。为分子育种 研究奠定了分子生物学基础，对基因预测、基因功能鉴定及基因表达等均具有莺要作 用。另外我国在水稻功能基因组学研究方面，获得了3 0 0 0 多个水稻插入突变体和l 万多条u n i c d n a 的测序，初步建立了水稻c d n a 芯片技术，克隆到了水稻温敏不育、 广亲和、育性、单分蘖、脆杆等重要农艺性状密切相关的基因，并初步建立了我国水 稻基因生物信息的技术平台。 第一部分文献综述 第一章植物基因组学研究概况 2 2 应用r n a 干预技术研究功能基因组 r n a 干涉是指短的d s r n a 可以降解内源的同源r 址矾a ，而使相应基因沉默的现 象，简称r n a i ，r n a i 的机理是：在细胞质内，有互补序列的m r n a 相互结合，形成 d s r n a ，d s r n a 被一种d i c c r 的复合体切成2 1 2 5 b p 大小的小片段( s i r n a ) ，d i c e r 结构中 包括一个螺旋酶结构域，两个r n a 酶i i i 结构域，一个双链r n a 结合位点。s i r n a 的双 链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与s i r n a 互补的m r n a 结合， 一方面使具有互补序列m r n a 被r n a 酶降解，另一方面以s i r n a 作为引物，以m r n a 为模板，在r d r p ( r n a d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ) 作用下合成出m r n a 的互补链”7 ”) 。结果m r n a 也变成了双链r n a ，它在d i c e r 酶的作用下也被裂解成s i r n a 。这些新 生成的s i i 斟a 也具有诱发r n a i 的作用，通过这个链式反应，细胞内的s i r n a 大大 增加，显著增加了对基因表达的抑制。s i r n a 不但可以使m r n a 降解，s i r n a 还可以 进入细胞核内，指导相应的序列甲基化，从而使基因在转录水平上保持沉默。r n a i 信号可以进行系统传输、具有局部感染、系统反应的特点。 在功能基因组研究中，r n a i 能作为一种强有力的研究工具对特定基因进行功能 丧失或降低，以确定其功能。由于r n a j 具有高度的序列专一性，可以特异地使特定 基因沉默，获得功能丧失或降低的突变体。功能未知基因的编码区或启动子区，以反 向重复的方式由同一启动子控制表达，这样在转基因个体内转录出的r n a 可形成 d s r n a ，产生r n a 干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技 术即为r n a i 技术。根据所选用序列的不同，可将其分为编码区r n a i 和启动予区r n a i 技术峥，2 。近年研究人员对r n a i 技术在植物中应用的可能性进行了探索，加州理工 大学的c h u a n g 和m e g e r o “t z ( 2 0 0 0 ) 使用此技术研究了拟南芥的a gc l v 3 ，a p l ，p a n 四个开花相关基因。结果表明使用r n a i 技术可以产生功能丧失或降低突变体，其表 型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。i a i 现象存在的广泛性远远超过人们的 - 预期，对此问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。而与其它几种进行功 能丧失或降低突变的技术相比，r n a i 技术具有明显的优点，它比反义r n a 技术和同 源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动予及 可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，1 ，t _ d n a 技术造成的功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。 第一部分文献综述第一章植物基因组学研究概况 隆群的过程中，重复、嵌合克隆或克隆的插入片段的重排及重复序列都会阻碍染色体 步行的进程。此外，染色体步行方式对基因组文库的要求高，不仅要有很好的覆盖率 且插入片段应尽可能的要大，以减少步行次数及重叠群中的g a p s 。但这反过来却增加 了后续亚克隆等过程的难度。这些都影响了用图位克隆技术克隆目的基因的效率。当 连锁标记与目的基因的物理距离小于基因组文库的平均插入片段时，尤其是为共分离 标记或基因本身的部分片段时，通过基因组文库的筛选可直接获得含有目的基因的阳 性克隆，这被称为染色体登陆。它免去了繁琐的染色体步查，减轻了物理图谱构建及 分析等程序，是实现用图位克隆技术分离基因的最佳方式。第一个获得染色体登陆的 基因是蕃茄的j d 幻( 2 8 ) ；水稻抗白叶枯病基因j 么2 l 的克隆也是在获得了一个与抗病基 因共分离的标记，通过染色体登陆而成功的( 2 9 ) 。可见，寻找与目的基因紧密连锁的分 子标记是决定图位克隆技术分离目的基因的难易程度和效率的关键环节。目前利用好 的目的基因分离群体( 如d h ，i u l ，n i l 等) ，结合b s a 以及信息量大、高效率的 分子标记技术( 如a f l p 、s s r 等) ，通过进行目的基因区的精细作图，已成功地在 拟南芥、水稻等具有较小基因组的模式植物上获得共分离标记并克隆了多个基因。 3 2 基因标鉴法 基因标鉴法是利用转座子或t _ d n a 跳跃性插入植物基因组中，导致某一基因失 活，从而有效地诱导产生表型突变体，并构建对应于突变体的基因库。然后用t d n a 或转座子特异性基因片段作探针，对突变体文库进行杂交筛选，分离出由转座子特异 性插入导致突变的目的基因的方法。这一方法首先在玉米和金鱼草两种植物上使用， 因其有很明显特征的转位因子。 对于缺乏内源性转座子的植物，引入玉米转座子a c d s ，其作用与在玉米中一样， 目前己证明大多数植物都能使用玉米的爿c 转座子和勋卅转座子。这一系统对于广泛 的定点诱变有很大用途，目前已在几种植物上对基因组的不同插入位点进行制图，并 得到大量被标记位点的植物株系图，应用前景十分诱人。然而，来源于金鱼草的而j 在转座过程中会引起染色体序列重排，因而受到限制。自1 9 9 2 年j o h a l 和b r i g g s 通 过a 缸转座子示踪法，首次从玉米中克隆到抗圆斑病基因胁”，以来。至今，利用这 种方法己克隆出多种基因。 33 基因的电子克隆 7 第一部分文献综述 第二章海藻及紫菜基因组研究概况 第二章海藻及紫菜基因组研究概况 海藻是海洋植物中的重要组成者，它可以像农作物一样给人类提供蛋白质、能 量、医药以及多种维生紊等，特别是它含有农作物无法提供的各种藻胶，如琼胶、卡 拉胶、褐藻胶等。虽然人类对海藻的应用在很早就有历史记载，但是由于地理分布和 海洋生物不易获取和离海养殖难等原因，对其生物学特点的认识、细胞学和遗传学背 景的研究以及对它深度的开发和利用都相对与陆生植物起步晚。研究的范围也多限于 形态学、分类学和海藻的栽培、养殖、加工等应用生物技术领域的研究。由于陆地植 物资源的匮乏，增加了人们对海藻资源的需求。各海洋大国在过去的十几年里都加强 了对海藻的基础研究领域的投入，海藻的研究和开发进入了一个发展相对较快的时 期。对海藻生理生化、系统发生、遗传发育等以及一些质休基因的克隆和基因工程的 t i j f 究上都积累了一些经验。 i 海藻概述 海藻是指生长在海洋中的藻类，基本上它们是一群能进行光合作用而且构造非常 简单的生命体。藻类的主要特征可以归纳为：无维管束组织，故没有真正的根、茎、 叶器官的分化；不开花结果：不产生种子；生殖构造不受特化的组织保护，所有藻类 常由单一细胞产生配子或孢子：没有胚的形成；细胞内均含有叶绿素a 。所有藻类因 含有叶绿素a ，可以进行光合作用丽获得养分。此外，不同种类的海藻含有不同型式 及含量的辅助色素，如叶绿素b 、叶绿素c 、叶绿素d 、旺d 一胡萝卜素、藻蓝素、藻红 素、藻褐素、叶黄素等，这些辅助色素之间的组合及含量比例不同，使得藻类具有多 姿多彩的色彩。 藻类因内部构造没有维管束组织的分化，所以不具有真正的根、茎、叶等器官 虽然有许多种类具有特化的细胞，但其分化并不完全，那些类似根的固着器除了柯| i 寸 着作用之外，整个藻体大多可由环境中直接吸收养分或交流物质。所有的藻类也不会 j 丁花结果，其生殖构造基本上是由单细胞个体自身变成配子或孢子，或由多细胞藻体 的某一细胞形成配子囊或孢子囊。 一般海藻分为两大类：微藻和大型海藻。 1 、微藻类多为单细胞藻类，肉眼看不见，主要行浮游性生活，海中只要光线所到之 i n 第一部分文献综述第二章海藻及紫菜基因组研究概况 处均有其分布，有的种类甚至具有鞭毛，能在水中游动，其数目与种类很多，常见的 由矽藻( d i a t o m ) 、涡鞭毛藻( p y h d p h ) 恤) 等，是海洋食物链中基础的重要生产者。 2 、大型海藻则是指长在潮间带或潮下带岩礁上、具有假根、可固着生长的藻类，其 结构比较复杂，形态多样，色彩缤纷，有些海藻如巨藻( m a c r o c y s t i s ) 长可达6 0 公 尺以上，是所有海藻中外形最大的。 目前为了区分方便，一般将漂浮水中的微细藻类通称为“浮游植物”，而把在海边 肉眼可见的大型海藻称为“海藻”，包括蓝藻、绿藻、褐藻及红藻四大类群。不同藻类 之间，其形态、大小、色彩变化多端，无奇不有。它们的分类主要根据其所含色素种 类、储藏物质、细胞壁成分、藻体生长型式、分枝型式、固着器、孢子囊种类、果胞 枝和囊果等特征。 以下为蓝藻植物门( c y a l l o p h y t a ) 、绿藻植物门( c h l o r o p h y t a ) 、褐藻植物门 ( p h a e o p h y t a ) 及红藻植物门( r h o d o p h y t a ) 的主要特征与区别： 在过去的生物分类中只有三界，即动物界、植物界及菌类界，这些海藻因为有细 胞壁及叶绿素可以进行光合作用而归在植物界中。但目前在生物分类上，已改分为血 界，其中包括：原核生物界、原生生物界、真菌界、植物界及动物界，而海藻则因无 维管束组织而抽离植物界，改为横跨原核生物界及原生生物界两界，其中蓝藻在原核 第一部分文献综述第二章海藻及紫菜基因组研究概况 生物界，绿藻、红藻及褐藻则改在原生生物界。 占地球百分之七十的海洋中，海藻是制造氧气与食物的重要基础生产者，海藻可 以净化水质，同时也是海洋生物栖息、产卵、觅食的地方，它对海洋生态的平衡和稳 定，及渔业资源的保育有着不可磨灭的影响力。 许多海藻可以食用，如紫菜、海带、裙带菜等。由于海藻普遍含有多种人体必需 的氨基酸、蛋白质、糖类、类胡萝卜素、维生素( b l 、b 2 、b 1 2 、c ) 及矿物质( 如 碘、钾、镁、铁、硒等) ，而脂肪含量却极低( 0 2 2 左右) ，是平衡营养的健康食 品。在我国古代就己把海带当成长生不老药，因其富含碘、钾，具有治疗甲状腺肿及 预防高血压的医疗效果。在近年研究上也发现海藻有退烧、消炎、抗菌、抗癌、催生、 防止血栓、利尿等特殊的生理活性，其所提炼的藻胶也常被用来外敷或内服，如抗溃 疡、促进结合组织形成、止血、降低胆囿醇及降血压等。 海藻还是极佳的家畜( 猪、牛、羊) 饲料添加剂，有促进食欲及增强抗病力的功 能。在水产养殖方面( 鱼、虾、蟹、贝) ，海藻也是重要饵料之一，如龙须菜( g ，口c f 切曲 肠m 口盯e 扣r 卅括) 。 由海藻做成的肥料，因不含杂草种子及病虫害源，可避免杂草及虫害发生，而其 所含的大量有机质，更可以提高土壤的保水力及改善土壤结构，部分具石灰质的海藻 ( 如石枝藻) ，更可用来制造泥灰土或改善土壤的酸碱度。 从海藻提炼的各种藻胶，如洋菜、褐藻酸、角叉藻聚糖等，利用它特殊的凝胶性、 粘稠性及乳化性，而广泛地应用于食品加工、造纸、纺织、化妆品、污水净化、基础 研究用的培养基等。另外，利用大型海藻来生产碳氢化合物( 如甲烷) 等，为人类未 来的新能源开拓了新境界。 2 海藻生物技术的发展 早在5 0 年代用羽藻肼y 咖括( “) 和6 0 年代用墨角藻凡c “s 的叶状体切段培养出了 假根，进行的海藻生物技术研究，大多研究形态发生及再生。到了7 0 年代仞由于分 子生物学、细胞生物学和细胞工程技术等研究取得了重大进展，农业生物技术所取得 的成果为海藻业提供了很好的借鉴海藻生物技术随着农业生物技术的发展而逐渐兴 起。但由于人们认识和开发海洋所存在的自然和技术障碍，因此发展历史耵l 深度都远 远晚于前者。前者已有8 0 多年的历史，经历了假说和探索阶段( 1 9 0 2 1 9 2 9 年) ，植物 第一部分文献综述第二章海藻及紫菜基因纽研究概况 组织培养方法与定义的建立阶段( 1 9 3 0 1 9 3 9 年) ，植物细胞全能性的证实阶段 ( 1 9 4 0 1 9 5 9 年) ，植物组织培养迅速发展阶段( 1 9 6 0 年以来) 四个时期。而海藻生物技 术的发展仅始自于5 0 年代，到现在只有5 0 多年的历史。最初的早期工作大都限于器 官方面，如叶状体的培养、假根的培养。6 0 年代发展到性细胞培养，在这期问培养 基以天然海水培养基或者简单的人工海水培养基为主，如e s 、p e s 、p e s i a s p 等 配方的发展。初期的培养不是无菌的，培养方法简单，主要目的是研究不同藻类不同 器官的再生能力，再生极性及再生形态建成。到7 0 年代酶解分离原生质体成功，适 于酶解海藻的各类酶，主要有纤维素酶、海螺酶、鲍鱼酶、琼胶酶等先后被研制出来。 这些酶可特异的分离那些和高等陆生植物的细胞壁成分不同的褐藻、红藻等海藻的原 生质体。促进了8 0 年代初期的单细胞和原生质体培养技术的开展，在此基础上又开 展了细胞杂交技术。在8 0 9 0 年代、生物技术发展的另一方面是从海藻中提取各种活 性物质用于医药卫生、营养保健以及生产藻胶。随着养殖品种的退化和病害的发生， 科学家们也利用生物技术进行高产、优质、抗逆为目的的品种改良研究。8 0 年代还 发展了超低温技术与固定化技术以及大分子技术，用于对单细胞和多细胞藻类研究。 到9 0 年代随着基因工程的迅速发展，再加上藻类细胞工程有了一定的基础，此时海 藻生物技术也向着纵深方向发展，如单克隆抗体、r f l p 等技术已应用于海藻蛋白质、 核酸生物大分子的研究，藻胆蛋白以及藻类r u b i s c o 基因已经分离，并己转化到大肠 杆菌内作进一步的研究。 3 藻类基因工程研究进展 藻类基因工程起步较晚，6 0 年代首先对蓝藻或蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) 进行了分子 遗传学的研究。由于质粒的发现及载体的利用，8 0 年代，在真核藻类方面，r o c h a i x 和v a nd i i l e 、v j i n 第一个报导了在单细胞衣藻( 胁哪如m o ”a 5 ，p m 口础f f ) 中利用质粒 为载体进行了基因转移。随着大型海藻分子遗传学研究的发展，特别是在质体基冈组 结构，序列，及基因定位等方面做了大量的研究，并根据基因序列进行藻类发生和分 类方面的研究，目前各种新技术如r a p d 技术，p c r 技术，基因枪喷射技术等也广 泛的应用于藻类基因工稃研究中。 3 1 蓝藻基因工程 帮一邾分文献综述第二章海藻及紫菜基因组研究概况 属于原核生物的蓝藻具有自己的质粒，通过改造可成为理想的基因载体，所以蓝 藻基因工程发展较为迅速。目前已建立了单细胞及丝状蓝细菌的宿主载体系统，其载 体由埃希氏菌质粒和蓝藻质粒融合改建而成，可在细菌和蓝藻中复制，因而称为”双 向质粒”，改造的质粒具有抗生素标记并可携带外源d n a ，有的还能检测基因的表达， 以及测定基因转录启动子的启动子探测质粒，现己获得的双向质粒达十多种。目前已 分离到1 3 0 多种蓝藻基因，并克隆到了大肠杆菌中。h e 盯c r o 和w o l k ( 4 5 ) 曾建立了 一n & 6 a e 舢v d r 晒6 j 胁9 6 0 个克隆的c o s m i d s 文库，并通过染色体检查技术制定基因图 谱，并把一些基因定位于4 0 连锁族内，b a n c r o r 等( 4 6 在此基础上采用p h o g e 和 s o u n h e m 杂交，从而制成质体基因组大片断物理图谱，并把3 0 个基因用探针定位于 陔酶切图谱上。c y a n o n e w s ( 1 9 9 0 年) 已完成了单细胞藻篷岬e c d c c “sp c c7 0 0 2 染色 体物理图谱。分离到的一些蓝藻基因，如r b c ，c p c ，t ，l e u 等，可在大肠杆菌或枯 草杆菌及链霉菌中进行功能表达。目前己能利用大肠杆菌生产蓝藻的一些限制性内切 酶如a v ai i 和a v ai 等。这为今后将蓝藻特殊产物借用微生物大量发酵进行商品化生 产丌辟了道路。同样外源基因也可在蓝藻细胞中表达。c s i s z a r 等( 1 9 8 7 年) 把耐寒藻株 的脂肪酸脱饱和基因导入到冷敏感型的藻株中使其增加抗寒性。v e e c k 等( 1 9 8 7 年) 则 将芽孢杆菌的杀虫毒素基因导入到蓝藻中并得到了表达。 32 绿藻基因工程 衣藻( c 协，d m y d d 彻础陀加 口r 出是单细胞绿藻，也是较为理想的遗传操作材料。 1 9 7 8 年，r o c h a i x 4 7 进行了衣藻叶绿体基因图制作研究。1 9 8 2 年r o c h a i x ( 4 8 采用携带 有酵母a r g 4 基因的一个酵母质粒成功的转化了一个缺乏细胞壁的嗜精氨酸的衣藻 藻株。目前已做到将藻类d n a 片断，嵌入带有酵母a r g 4 基因的细菌质粒p b r 3 2 2 的衍生物中而构成在藻类自主复制的质粒。但这种质粒多是从叶绿体而不是从核 d n a 得到复制的质粒，因此不能被稳定保持，转化频率也不高。l e u n g 用s w o 启动 子、新霉素( n e o ) 基因及r n a 终止子构建了2 p m 质粒并成功转化了缺壁的衣藻突变体， 得到抗新霉素类似物g 4 1 8 的转化植株。8 0 一9 0 年代，b o y n t o n 等，n e w m e n 等和h a r i s 等连续报导了用基因枪喷射技术把克隆有野生型叶绿体基因的d n a 导入到衣藻细胞 中，并使基因能稳定地结合在叶绿体基因组中，并使发生2 5 k b 删除突变的叶绿体基 因组恢复原长度和功能。另外，j a r v i s 利用c a m v3 5 s 启动子，使带有荧光素酶基因 塑二翌竺= 苎坚堡堕笙三兰塑塑丝茎薹薹望望! ! 塞堡堡 的p d o4 3 2 质粒转化到单细胞小球藻中并得到了表达。在绿藻中，一些科及属内种 之间的区别己采用对叶绿体核编码的1 8 sr r n a 顺序进行分析的方法，确定它们之间 的亲缘关系及建立系统发生树结构。 3 3 质体基因图和质体基鼠的研究 质体基因图的建立：质体基因图是一项艰巨而繁琐的研究工作，继r o c h a i x 进行 衣藻质体基因图构建研究后，其它藻如褐藻纲中地藻d f c 们扭d f c o f d a ，红藻中条 斑紫菜尸w z o 脚捃的质体基因图也相继完成。已发现高等植物和绿藻中出核编码的 r u b i s c o 小亚基基因( r b o s ) ，在紫菜、龙须菜等红藻、具色藻0 f 打厅。斫s c w ，“r p 淞和隐 藻c r 妒0 m o 船s 中都由叶绿体基因编码。c a r o l 等完成了硅藻 c f 。陀如m e 昭 溉“ 的叶绿体完整物理图及部分基因图，并把n d l d ，p s a c ，p s b a ，印o b ，i p o c l ，和r p o c z 基 因定位于叶绿体基因图上。r e i m 和m u n h o l l a n d ( 4 9 用克隆的s o u t h e m 杂交和p c r 方 法建立了紫菜p “m 6 j ，f c n 凰叶绿体物理图谱，用导源杂交法和克隆随机d n a 序列建 立了遗传图谱，现已在叶绿体上定位了5 0 多个基因，其中2 0 多个是在高等植物中未 发现过的，这些基因包括光合系统i 蛋白，铁还原蛋白，一个h s p7 0h o m o l o g 儿个 l r n a ，核糖体蛋白，延长因子，氨基酸生物合成酶基因等。s t e a n e 等( 1 9 9 1 年) 通过 对红藻g r a z 口一i ，a 挺5 目中的1 1 种r r n a 基因及5 个其它目的r 烈a 基因的序列测定， 认为58 sr r n a 基因位于两个i t s 之间。而角叉菜c 伽月出埘口印“s 的1 6 sr r n a 基 因有两个拷贝一个靠近2 3 sr r n a ，一个不在典型核糖体操纵子部分内。a s s a l i 在 褐藻d 妇f p mm f o ，日协中对p s a b 克隆及测定序列，认为褐藻，硅藻中的p s a a 和p s a b 与陆地植物一样由叶绿体编码并为同一个阅读框架，但为一个a t 宿舍区( 2 2 b p ) 所隔 离：而在衣藻中，p s a a 与p s a b 分离且p s a a 由三个外显子组成。 34r r n a 基因序列测定与藻类系统发生树 现已经对绿藻中的胁叼砌m d n ，( k ，p ，娩c ，o ，o c c d 如s ，叫v 掣砂c e d e ， 螂r 。 ? o n “( 却砂c e d g ，尹缸“r 舒f r 印细c e 口e 等许多种绿藻进行了1 8 s ，2 6 sr r n a 基因碱基 序列测定并建立其系统发生树，作为划分属种的分类标识。b i r d 等于9 0 年代初测定 了3 0 4 0 种红藻的1 8 sr r n a 基因，排出了红藻目中各属的系统发育树结构，并认 为在龙须菜属亚属中有2 2 2 4 个核甘酸的不同，g r a c e s a 等用p c r 和r f l p s 列18 s r r n a 嬉凼进行分析，来区别函口c f 肠，曲和g ，伽f ，协秘西及g 口胁晴姗n f o ”种。p a r a o n s i5 辩一部分文献综述第二章海藻及紫菜基因组研究溉况 用限制性内切酶分析法以证明加拿大沿岸与法国沿海的叉枝藻不是同一个种。 b h a t t a c h a r y a 等通过限制性酶切分析，建立了八种海带的进化和亲缘关系。s u u n d e r 和d r u e h l 对海带目中七个属进行了叶绿体核糖体基因测序。f a i n 估计了海带目的属 问差异程度，估算了保守系统，绘制了进化树。c h a r l e n c 等对海带属删觑r 地) 六个 代表种的由核编码核糖体i t s i 和5 8 s 基因进行测序，以建立种之间的系统发生关系。 t u m e r 等5 0 对原丝藻( 尸r d 如f 0 腩骶砷1 6 sm 叮a 序列测定认为与蓝藻更接近。m o r d e n 等 引进行p s b a 序列分析认为其与绿藻更为接近。j a u a n n i c 等( 1 9 9 2 年) 对褐藻巧，f 把船 m ，o f f 叶绿体a t p b 和e 基因测序，认为其与蓝藻更为接近。 4 紫菜研究概况 紫菜属红藻门( r o 却 y f d ) 红毛菜科( 肋增妇c 8 p ) 紫菜属( 尸。伊砂r 口) 植物， 欧荚称l e v e r ，r 本叫n o ( 5 2 ) ，紫菜作为一种重要的大型经济海藻，全世界有7 0 余种， 广泛生长在全球海岸的潮间带，我国大约有1 5 种。作为主要栽培种的有两个，南方 的为坛紫菜( p 口f 细埘珂括) ，北方为条斑紫菜( 户膨o e 月s 曲u e d a ) ( 5 孙。据统计( 5 4 1 9 9 5 年，大型海藻产值约为3 7 亿美元，其中紫菜1 8 亿美元，接近一半，我国紫菜的产量居世 界的首位，在国内的产量仅次与海带，但经济产值却高于海带位居第一。紫菜作为大 型红藻的代表种，不仅经济价值为各海洋大国看好