（作物遗传育种专业论文）水稻两个芽鞘紫线相关基因的图位克隆与应用研究.pdf

摘要 摘要 花青素性状具有肉眼可见，不影响其他性状发育，受多个基因控制等特点，在杂交种的纯度 鉴定，目的基因的瞬时表达，转基因指示中有重要作用，是研究多基因控制单一性状的典范，在 基因互作研究中占有重要地位。 水稻芽鞘紫线是在种子出芽后，胚芽鞘两侧各出现的一条清晰可见的紫色线条。由于该性状 表达时期极早( 出芽期) 和稳定，又具有“双亲芽鞘无紫线但其f 1 有紫线”的遗传现象，为我们利 用该性状快速、准确、经济地鉴定杂交种纯度提供了可能，相关基因还具有发展成水稻来源的色 素报告基因的潜在可能。为了促进其应用，我们通过解剖和细胞学观察、精细定位、克隆测序、 半定量和定量r t - p c r 以及转基因等工作，进行正、异常材料的外观和组织结构比较、候选基因 的筛选、紫线功能缺失原因分析、部位表达特异性和相互关系分析以及o s a i 基冈的转基因等研 究；通过回交和杂交育种选育出了易于纯度鉴定的杂交组合，对芽鞘紫线法鉴定杂交种纯度的可 靠性进行了验证，主要结论如下： 1 有紫线材料和无紫线材料在组织结构上没有区别，仅是色素沉积上的差异 在有紫线的r 2 5 的芽鞘上，对称分布着两条紫线；r 2 5 紫线处的薄壁细胞小而密集，芽鞘在 此处显得薄而有缢痕，y r 2 5 芽鞘的外观及细胞学特征与r 2 5 在结构上无明显差异，只不过在相 应位置无色素沉积。 2 两个芽鞘紫线相关基因的精细定位和候选基因的确定 用y i i 3 2 a x r 2 5 的f 2 群体将o s a i 基因定位于第1 1 染色体的第8 5 6 3 7 4 9 碱基到8 6 1 4 9 8 9 碱 基之间，该范围内的伪6 舭日，4 基因的同源基因与色素途径有关，初步确定其为o s a i 基因的候 选基因：用中九a x r 2 5 的f 2 群体将水稻色素原基因c 定位于第6 染色体的r m 5 7 5 4 和r m l 9 6 6 5 之间，这两个引物之间有一个m y b 转录因子基因o s c l ，与玉米的尸施j 色素基因家族同源，初 步确定其为c 基因的候选基因。 3 o s a i 和o s c l 基因在各自亲本间的差异及o s a i 基因的m r n a 序列 3 1o s a i 基因的差异 o s a i 基因在d n a 水平上差异较多，在起始密码和终止密码间共有2 4 处差异，其中有三处 导致氨基酸替换，但我们无法确定与性状的相关性。在突变型y i i 3 2 b 中，该基因不表达，使芽 鞘紫线不表现。 3 2o s c l 基因的差异 无紫线的y r 2 5 的o s c l 基因比正常的r 2 5 在第三外显子少1 0 b p ，其氨基酸序列移码并提前 终止翻译，而且移码区位于m y b 功能区域，这将无法启动下游结构基因的转录。 i 两南大学博十学位论文 3 3o s a i 基因的结构及m r n a 序列 获得o s a i 基因m r n a 的序列长度为1 6 1 0 b p ，其中3 端u t r 全长2 8 0 b p ，o r f 长1 2 8 4 b p ， 5 u t r4 6 b p ：该基因共有5 个外显子，该序列比n c b i 和g r a m e n e 等网站预测的基因结构多了一 个外显子，且最后一个外显子向预测的3 端延伸了3 5 b p - 预测序列第4 外显子实际含有一个内含 子。 4 o s a i 和仇c _ 7 基因的进化分析 o s a i 基因不但在玉米，高粱，葡萄，拟南芥中有垂直同源基因，而且在水稻中还有水平同源 基因o s b l ，该基冈控制紫叶和紫色果皮，o s a i 基因同高粱、玉米及水稻中的相关基因聚成禾本 科色素分枝；o s c l 基因与高粱、玉米和小麦的相关基因形成禾本科分枝，与水稻中的其他m y b 基因同源性低。 5 o s a i 和o s c l 基因的部位表达特点及相互关系 本研究中，o s a i 基因仅在芽鞘中表达，其他器官不表达；o s c l 基因在芽鞘和叶片中表达， 其他器官极少表达：o s a i 基因在无紫线的y r 2 5 中的表达和o s c l 基因在无紫线的y i i 3 2 b 中的 表达无大幅的上下调变化，说明o s a i 和o s c l 基因在芽鞘紫线的表现中是一种互补关系。 6 o s a i 基因功能验证载体的构建及转基因 将o s a i 基因全长及上游1 5 0 4 和下游1 0 5 2 b p ，通过分段载入方式成功载入p c a m b i a l 3 0 1 ， 转化中花11 获得了4 株阳性植株，基因验证工作进行中。 7 新选不育系i 3 2 a 和2 0 8 1 a 所配组合能够用芽鞘紫线法进行纯度鉴定 通过回交育种，将有紫线的i i 3 2 a 改造成了无紫线的y i i 3 2 a ，通过杂交育种，获得了新的 不育系2 0 8 1 a ( 无紫线) ，两个不育系同无紫线的恢复系泸恢1 7 杂交，f l 代均有紫线，表明可 以用芽鞘紫线法鉴定所配组合杂交种子纯度。 8 芽鞘紫线法鉴定杂交稻种纯度的结果可靠 用盲试法、分子标记法和田间鉴定法对紫线法的鉴定结果进行验证，表明紫线法结果准确可 靠；同其他纯度鉴定法相比，准确性不相上下，时间和费用大大减少，紫线法能够同时满足水稻 杂交种纯度鉴定的准确、快速、经济的要求。 关键词：水稻；芽鞘紫线：b h l h 因子；m y b 因子；图位克隆；纯度鉴定 i i a b s t r a c t a b s t r a c t a n t h o c y a n i np h e n o t y p e s ，w i t hs g o n gv i s u a ld e t e c t i o n ，i sn o te s s e n t i a lf o rd e v e l o p m e n t , a n d n o n t o x i c ，h a sl o n gb e e nc o n s i d e r e da sm a r k e rg a i t si np u r i t yi d e n t i f i c a t i o no fh y b r i ds e e d sa n dau s e f u l r e p o r t e rs y s t e mf o rb o t ht r a n s i e n te x p r e s s i o ns t u d i e sa n dt r a n s f o r m a t i o ni n d i c a t i n g a sa ne x a m p l eo f m a n yd i s p e r s e dg e n e sc o n t r o l l i n gas i n g l et r a i t p i g m e n t a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ns t u d i e so fg e n e i n t e r a c t i o n a sap i g m e n tt r a i t , c o l e o p t i l ep u r p l el i n e ，w h i c hc l e a r l ya p p e a r si nb o t ho p p o s i t es i d eo fc o l e o p t i l e i ns o m er i c em a t e r i a l s ，i su s e f u li ni d e n t i f y i n gt h ep u r i t yo fr i c eh y b r i ds e e d sq u i c k l y , e x a c t l ya n d c h e a p l yb e c a u s ei te x p r e s s e sa tb u d d i n gp e r i o da n dc a l lp e r f o r m a n c eai n h e r i t a n c eb e h a v i o ro ff l g e n e r a t i o n se x p r e s s i n gp u r p l el i n eb u ti t st w op a r e n t sd o n t a n da l s ot h e s ec o l e o p t i l ep u r p l el i n e i n v o l v e dg e n e sc a nb ee m p l o y e di nd e v e l o p i n gp i g m e n tr e p o r t e rg e n es y s t e mf o rt h o s ec h a r a c t e r i s t i c s a b o v e t oe f f e c t i v e l ya d v a n c ei t su s i n gi nt h o s ee x p e c t e df i e l d s ，f o l l o we f f o r t sh a v eb e e nd o n e ：c o m p a r i n g t h em o d a l i t ya n dt i s s u es t r u c t u r eb e t w e e nw i l da n dm u t a n tb ya n a t o m i c a la n dc y t o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ； c a n d i d a t eg e n e sg u e s s i n ga n dd e t e c t i o no fm u t a t i o nl o c u sb yf i n em a p p i n ga n ds e q u e n c i n g ；t h eo r g a n s p e c i a l i t yo fg e n e se x p r e s s i o na n dt h ei n t e r r e l a t i o no ft h ei n v o l v e dg e n e sb yr t - p c ra n dq - p c r ； t r a n s f o r m a t i o no fo s a ig e n e ；a n db r e e d i n gt h eh y b r i dc o m b i n a t i o n sw h o s ep u r i t yc a nb ee a s i l y i d e n t i f i e d ；a n dv a l i d a t i o nt h er e l i a b i l i t yo ft h ep u r i t yo b t a i n e df r o mt h ep u r p l el i n em e t h o d a n dt h em a i nc o n c l u s i o n s 砌a sf o l l o w s ： 1 t h e r ei sn od i f f e r e n c eb u tp i g m e n t a t i o nb e t w e e np u r p l el i n ea n dn o p u r p l el i n e m a t e r i a l s i nw i l dr 2 5 ，t w op u r p l el i n e sl e ii nt h ec o l e o p t i l es y m m e t r i c a l l y t h ec e l l si nt h ep i g m e n tr e g i o n a les m a l l e ra n dd e n s e rt h a nt h eo t h e rp a r e n c h y m ac e l l sw h i c hr e s u l t si nt h ec o n s t r i c t i o n si nt h e c o l e o p t i l e e x c e p tn o n ea n t h o c y a n i ns t a i n i n go nt h ec o r r e s p o n d i n gr e g i o ni ny r 2 5t h e r ei sn od i f f e r e n c e b e t w e e nt h ew i l da n dm u t a n tp a r e n t sa f t e ra n a t o m i c a la n dc y t o l o g i c a le x a m i n a t i o n 2 f i n em a p p i n go ft w op u r p l el i n er e l a t e dg e n e sa n dc a n d i d a t e ss c r e e n i n g u s i n gt h ef 2g e n e r a t i o no fi i - 3 2 a x r 2 5 ，w er e s t r i c t e dt h eo s a ig e n eb e t w e e n8 5 6 3 7 4 9 b pa n d 8 614 9 8 9 bo nc h r o m o s o m e11 t h e r ei sab h l hf a c t o rg e n eo s b h l h l 4i nt h i sr e g i o n b e c a u s et h e o r t h o l o g s ( z m b la n de g l 3 ) o fo s b h l h l 4i nm a i z ea n da r a b i d o p s i sa l ei n v o l v e di np i g m e n tp a t h w a y , w ec o m m e n do s b h l h l 4a st h ec a n d i d a t eo fo s a i b yt h eo t h e rf 2g e n e r a t i o no fz h o n g i i u a x r 2 5 ，w e f o u n dt h a tt h ec h r o m o g e ng e n ecr i d i n go nc h r o m o s o m e6 ，b e t w e e nr m 5 7 5 4a n dr m 19 6 6 5 o n e t t i 两南大学博十学位论文 】m m m = m m mn l =j , m, _ nm 鼍曼曼蔓曼鼍曼曼皇曼曼鼍 m a i z ep i c 1o r t h o g l o go s c l ，w h i c hi sam y b t r a n s c r i p t i o nf a c t o r , i sw a i t i n gt h e r ea n dw es p e c u l a t e t h a to s c li st h ec a n d i d a t eo f g e n ec 3 t h ed i f f e r e n c eo fo s a ia n do s c g e n e sb e t w e e nt h e i rw i l da n dm u t a n tt y p ea n d t h eo s a im r n a s e q u e n c e 3 1 t h ed i f f e r e n c eo fo s a ib e t w e e ni i 3 2 ba n dy i i 3 2 b f r o mt h es t a r tt os t o pc o d eo fo s a ig e n e ，w ed e t e c t e d2 4m u t a n tl o c i ，i nm u t a n tt y p ey i i 一3 2 b ， i n c l u d i n g3a m i n oa c i ds u b s t i t u t i o nm u t a t i o n s i ti st o om u c ho ft h ed n am u t a t i o nt od e t e r m i n a t ew h i c h m u t a n t i o nr e s u l t e di nf u n c t i o nl o s i n g h o w e v e r ，w ef o u n dt h a to s a if a i l e dt oe x p r e s si ny i i 3 2 b c o l e o p t i l ew h i c hi n d i c a t e t h a tn op u r p l el i n ei ny i i 3 2 bi sr e s u l t e df r o mt h e f a i l e dt r a n s c r i p t i o n p r o m o t i o no fo s a ig e n e 3 2t h ed i f f e r e n c eo fo s c lb e t w e e nr 2 5a n dy r 2 5 w ed e t e c t e da1 0 b pd e l e t i o ni nt h et h i r de x t r o no fo s c l g e n ei nm u t a n ty r 2 5 t h ed e l e t i o n o c c u r r e di nt h em y bd o m a i na n dr e s u l ti ns h i f tm u t a t i o ni na m i n oa c i ds e q u e n c ea n dt r a n s l a t i o ns t o p a h e a d s u c hat r e m e n d o u sc h a n g em u s tp r e v e n tp i g m e n ts t r u c t u r eg e n ed o w n s t r e a mf r o me x p r e s s i n g a n dm a k en op u r p l el i n ei nc o l e p t i l e 3 3t h eg e n es t r u c t u r ea n dt h em r n a s e q u e n c eo fo s a i i n c l u d i n g2 8 0 b p3 u t r1 2 8 4 b po r fa n d4 6 b p5 u t r , t h em r n as e q u e n c ei s1610 b pl o n g b y a l i g n i n gw i t ht h ed n as e q u e n c e ，w ef o u n dt h e r ea r e5e x t r o n si no s a ig e n e i nt h ep r e d i c t e df o u r t h e x t r o r gah i d d e ni n t r o nw a sd i s c o v e r e d a n dt h u s ，t h ef a c t u a le x t r o n sa r eo n em o r et h a nt h ep r e d i c t i o n a d d i t i o n a l ，t h ef a c t u a lo r fe x t e n d3 5 b pt o w a r d st h ep r e d i c t e d3 u t r 4 p h y l o g e n e t i ca n a l y s bo fo s a ia n do s cl t h e r ea r eo r t h o l o g so fo s a ii nm a n yp l a n t ss u c ha sm a i z e ( z m b la n dz m r s ) ，s o r g h u m ( s b g l 一，a n d s b b l 一j ) ，h t i sv i n i f e r a ( v v m y c a l ) a n da r a b i d o p s i s ( g l 3a n de g l 3 ) a n ds oo n a n da n o t h e rb h l h f a c t o rg e n eo s b l ，w h i c hc o n t r o l st h e p u r p l ep e f i c a r pi nr i c e ，p l a y sa sap a r a l o go fo s a i o nt h e p h y i o g e n e t i ct r e e ，o s a ia n do s b l ，z m b la n dz m r s ，s b b l ja n ds b b l j ，t h e s es i xg e n e sf e l li n t ot h e s a l n eg r a s sb h l hc l a d e t h eo s c la n di t so n h o l o g s ，z i n c l ，z m p l 3 ，s b 3 5 0 p 0 3 1 4a n dt a m y b 3 ，f e l l i n t oag r a s sm y bb r a n c h d i s l i k eo s a ig e n e ，o s c lh a sn op a r a l o gi nr i c e 5 t h eo r g a ns p e c i f i c i t yo fo s a ia n do s cle x p r e s s i o na n dt h ei n t e r r e l a t i o nb e t w e e n t h e s et w og e n e s i nt h i sr e s e a r c h , o s a ig e n eo n l ye x p r e s s e di nc o l e o p t i l ea n do s c lg e n ee x p r e s s e di nc o l e o p t i l ea n d i v a b s t r a c t 曼! 曼曼鼍曼皇蔓曼曼曼皇- - - - i i i i ii 舅曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼皇曼曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼皇曼鼍曼曼皇曼量皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼量 l e a f a n dw ef o u n dt h a tt h eo s a ig e n ec a ne x p r e s s e sn e a rn o r m a l l yi nm u t a n to fy r 2 5a n do s c lg e n e c a ne x p r e s s e sn e a rn o r m a l l yi nm u t a n to fy i i 一3 2 b i ts h o w st h a tt h er e l a t i o nb e t w e e no s a ia n do s c li s n o t 锄u p d o w n s t r e a mb u tac o o p e r a t i o nr e l a t i o n s h i p 6 f u n c t i o nc o m p l e m e n t a t i o nv e c t o ro fo s a ig e n ew a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s g e n i c p l a n t sh a v eb e e nd e t e c t e d a n 一4 9 k bg e n o m i cd n af r a g m e n tc o n t a i n i n gt h ee n t i r eo s a ic o d i n gr e g i o n , a15 0 4 b pu p s t r e a m s e q u e n c e ，a n da10 5 2 一b pd o w n s t r e a ms e q u e n c ew a sc l o n e di n t ot h eb i n a r yv e c t o rp c a m b i a i3 01t o g e n e r a t ep 1 3 0 l o s a ic o n s t r u c t w eh a v ed e t e c t e df o u rp o s i t i v et r a n s f o r m a n t sf r o mt h ed i f f e r e n t i a t e d p l a n t sa n dt h ef u n c t i o nv m i d m i o ni su n d e r w a y 7 h y b r i ds e e d s i i - 3 2 a ，2 0 8 1 a x l u h u i17 ) p u r i t yi d e n t i f i c a t i o nc a nb ec o n d u c t e d b ye m p l o y i n gp u r p l el i n em e t h o d b yb a c k c r o s sb r e e d i n ga n dh y b r i d i z a t i o nb r e e d i n g ，w em a d et w oc m sl i n e sy i i - 3 2 aa n d2 0 8 1a r e s p e c t i v e l y n oo ft h e mw a sp i g m e n t e di nc o l e o p t i l eb u ti ns t i g m a p o l l i n a t i n gb yr e s t o r e rl i n el u h u i 17w h i c hp e r f o r m a n c en op i g m e n t a t i o ni na l lo r g a n s ，w eg o tt h eh y b r i ds e e d so fy i i - 3 2 aa n d 2 0 8 1 a x l u h u i1 7 b o t ho ft h et w oc o m b i n a t i o n ss e e d se x p r e s sc o l e o p t i l ep u r p l el i n ew h e ng e r m i n a t e d f ld i s p l a y i n gp u r p l el i n eb u tc m sa n dr e s t o r e rl i n e sh a v i n gn op u r p l el i n ei nc o l e o p t i l ep r e s e n t sa p o s s i b i l i t yo fp u r i t yi d e n t i f y i n gb yp u r p l el i n e 8 t h ep u r i t yi d e n t i f i c a t i o nr e s u l t sb yp u r p l el i n ei sr e l i a b l e a f t e rb e i n gv a l i d a t e db yb l i n dt e s t , m o l e c u l a rm a r k e rd e t e c t i o na n df i e l dp l a n t i n ge x a m i n i n g , p u r p l el i n em e t h o di sv e r yr e l i a b l ei np u r i t yi d e n t i f i c a t i o no fh y b r i ds e e d s i na d d i t i o n a l ，t h i sm e t h o di s t h em o s tt i m e a n dm o n e ys a v i n gw a yc o m p a r e dt oo t h e ru s e dm e t h o d s s ow ec o n c l u d e dt h a tp u r p l el i n e m e t h o dc a l ls a t i s f yf a r t h e s tt h e q u i c k , e x a c ta n dc h e a p r e q u i r e m e n tf r o mh y b r i ds e e d sp u r i t y i d e n t i f i c a t i o ni nr i c e k e yw o r d s ：r i c e ；c o l e o p t i l ep u r p l el i n e ；b h l hf a c t o rg e n e ；m y bf a c t o rg e n e ； m a p b a s e dc l o n i n g ；p u r i t yi d e n t i f i c a t i o n v 独创性声明 学位论文题目：丞叠西仝荭鞘紫线担差基国的图僮杰隆星廑旦硒究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已 经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、 朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 1 分狠 签字日期：勿彤年，p 月纩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：哜保密，口保 密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： i 咨扭 签字日期：例7 年j y 月亏日 导师签名： 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬琢迎 类黄酮化合物是广泛存在的植物次生代谢物，它是植物组织中红色、蓝色和紫色花青素色素 的呈色物质。拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 等植物中种皮色素的主要成分是原花青素单体的聚合 物，是由公共苯丙烷途径类黄酮一原花青素途径而合成的。已知有来自于w d 4 0 、m y b 、b h l h 、 m a d s b o x 、w r k y 和b z i p 家族的转录因子参与了类黄酮途径的调控，而这些转录因子表达的 时空特性受到精密调控。 水稻是世界上最重要的粮食作物之一。虽然水稻色泽表现只是经济上的次要性状，但是，色 素的沉积、分布和浓淡在各种水稻间的巨大变化对分类学和遗传学来说具有重要价值；作为标志 性状，它可用于识别杂种真伪，进行纯度鉴定等很多方面：由于色素的表现受多对基因控制，它 在研究基冈的功能和基因间的相互关系中可发挥重要作用；另外，花色苷类色素还安全无副作用， 是很好的食用色素，而且还具有一定的保健功能【l 埘。因此，仍有许多研究是与花色素为内容的。 杂交水稻大面积、长时间的成功应用，为我国水稻产量的大幅度提高作出了巨大贡献。它之 所以比常规稻产量高，关键在于杂种一代整齐一致的强大的杂种优势。杂交稻很容易发生混杂退 化【3 j ，如果因此而使杂种纯度不高，这将严重削弱杂种优势的增产作用。因此，在杂交水稻的应 用中，种子( 不育系和f 1 ) 的纯度鉴定历来受到人们的重视，人们建立了许多的纯度鉴定方法。 下面就有关上述研究成果进行介绍： 1 1 类黄酮及生物合成途径的研究进展 1 1 1 类黄酮化合物结构及其分类 生物类黄酮( b i o f l a v o n o i d s ) 是自然界存在的多酚类物质，亦称维生素p ，常与维生素c 伴存， 属植物次生代谢产物。类黄酮的基本骨架是c 6 - c 3 c 6 ，由两个芳香环a 和b ，通过中央三碳链 相互连接而形成的一系列化合物1 4 1 ( 图1 1 ) 。 图1 1 类黄酮化合物的基本结构 f i g 1 - 1b a s i cs n _ u c t l l r eo ff l a v o n o i d c o m p o u n d s r l 、r 2 、r 3 和心代表可被修饰的基团。r l ，r 2 ， r 3a n dr , g e p r e s e n t i n gr a d i c l e st h a tc a i lb e m o d i f i e d 根据中央三碳链的氧化程度，b 环在c 环上的连接位置以及三碳链是否构成环状等特点，将 类黄酮分为黄酮及黄酮苷、黄酮醇及黄酮醇苷、查耳酮、花色素及花色素苷、黄烷醇、原花色素 等1 4 大类5 1 。目前植物界已鉴定出的类黄酮物质已达8 0 0 0 种以上，是苯丙烷复合途径代谢产物。 l 两南大学博十学位论文 皇量曼曼曼鼍曼鼍曼鼍曼曼曼曼量量量暑曼曼量曼曼曼鼍量曼曼曼曼曼ii 1i 量曼曼曼曼皇量曼曼皇曼皇曼皇曼量置曼皇曼皇曼曼曼量曼舅量曼曼曼曼曼鼍曼 1 1 2 类黄酮物质生物合成的一般途径 类黄酮生物合成是目前植物次生代谢中最广泛的研究领域之一。在不同植物中，类黄酮的种 类和数量不同，但在植物的进化中，中心类黄酮的合成途径是高度保守的【引。类黄酮生物合成途 径( 图1 2 ) 的研究主要是通过大部分植物中的大量改变花色、种皮、果皮、糊粉层色素着色突变体 而了解到的，因此筛选突变体尤为重要。例如在大麦中已分离和鉴定了超过6 0 0 种影响p a 积累 的突变体。这些突变体是不依赖于a n t 的1 0 个位点1 7 】。类黄酮生物合成途径研究得比较透彻的主 要是在拟南芥、矮牵牛( p e t u n i ah y b r i d a ) 、金鱼草( a n t i r r h i n u mm a j u s ) 、玉米( z e am a y s ) 等模式植物 上【剐。类黄酮合成代谢途径起源子自苯丙氨酸经p a l 、c 4 h 和4 c l 这三个关键酶的先后催化形成 4 香豆酰辅酶a 的公共本丙烷途径，然后进入核心类黄酮途径。1 分子的4 香豆酰c o a 与三分 子的丙二酰c o a 在查尔酮合成酶( c h a l c o n es y n t h a s e ，c h s ) 催化下生成了第一个黄酮类化合物一查 尔酮( c h a l c o n e ) 。查尔酮经过c h i 、f 3 h 、f 3 h 等关键酶催化形成二氢山奈酚、二氢懈皮素，然后 在进入多条分枝途径以转化形成各种类黄酮化合物( 图1 2 ) 。 1 1 3 类黄酮合成途径的分子生物学研究 分子生物学技术的发展也推动了类黄酮合成途径的研究。前人利用物理诱变、化学诱变、转 座子标签、t - d n a 标签、异源杂交、差异e d n a 克隆和遗传筛选相结合的方法及实验手段，从多 种植物中分离了一些类黄酮途径合成的结构基因和调控基因。其中，由于p a 物质积累受阻而使种 皮颜色从深褐色变为黄色的基因在拟南芥中被鉴定为透明种皮【n 】。目前在拟南芥中已鉴定f l j 2 3 个乃位剧”】，其中鉴定为结构基因的位点有1 2 个，调控基因位点有6 个，还有5 个位点编码基因未 知。 1 1 3 1 类黄酮合成途径的结构基因 近年来在类黄酮合成途径和公共苯丙烷途径中，编码关键酶的基因已从多种模式作物中分离 同时，大部分基因功能也逐渐明确( 表1 1 ) 。 c h i 最早是从法国菜豆中以抗体技术分离。拟南芥中用扔表示，硝突变体是用快中子辐 射诱变而得【10 1 。c h i 是第一个被认识的类黄酮合成相关酶，以单体形式存在，分子量冈植物种类 和组织不同而异。矮牵牛基因组中存在2 个c h i ，c h i a 在花冠和成熟的雄蕊中表达，c h i b 在未 成熟的花药中表达：c h i a 启动子可能具备两个顺式作用元件或c h i a 本身具备两个启动子，分 别决定c h i a 在花冠和成熟雄蕊中的表达：c h i a 也在紫外线照射的幼苗中表达；c h i a 表达和 c h s a 、c h s j 表达具类似的器官和细胞特异性；c h i a 全长7 2 6 b p ，编码2 4 1 个氨基酸。c h i 对 花色苷的产生并非必需，但其完全缺乏能限制花色素苷合成的比例。 2 第一章文献综述 p h e n y l a i a n i n e p a lj r c 4 h i r 4 c l ， 4 c o u m a r o y lc o a4 - 3 xm a l o n y lc o a 、， c h sj rt t 4 n a r i n g e n i nc h a l c o n e c h i1 l 舾 n a r i n g e n i n f 3 h i 搿6 f 3 h j rt t 7 d i h y d r o f l a v o n o l s 竖 d f r t t 3 f l s l 1 m t t s , r i 9 1 。p a p l ) l 似2 ，t t 8 ，幻 图1 2 合成花青素苷、黄酮醇和原花青素的类黄酮生物合成途径：引自s h a r m a ( 2 0 0 5 ) 1 9 】 f i g 1 - 2t h ef l a v o n o i db i o s y n t h e t i cp a t h w a yl e a d i n gt ot h es y n t h e s i so fa n t h o c y a n i n s ，f l a v o n o l sa n dp a s ： a d a p t e df r o ms h a r r n a ( 2 0 0 5 ) 1 9 j 实线表示为生物化学和遗传证据所支持的路线，虚线表示推测的路线。酶用大写粗体表示，与之相应的拟南 芥中的遗传位点用小写斜体表示，影响这些关键酶基因表达的调控基因的突变体显示于括弧中。a h a l 0 ：p - 类 h t - a t p a s e ：朋恨：花青素还原酶；b a n ：b a n y u l s ( 红彦) ；c 4 h ：肉桂酸4 羟化酶；c h i ：查尔酮异构酶；c h s ： 查尔酮合酶；4 c l ：4 - 香豆醛辅酶a 连接酶；d f r 二氢黄酮醇还原酶；f 3 h ：黄烷酮3 - 羟化酶：f 3 h ：类黄酮3 羟化酶；f l s ：黄酮醇合酶；g s t ：谷光甘肽s 转移酶；l a r ：无色花青素还原酶；l d o x ：无色花青素双加氧 酶：o m t ：o - 转甲基酶；p a l ：苯丙氨酸解氨酶；p a p l ：产花青素苷色素l ；r t ：鼠李糖基转移酶；u f g t ：尿 苷二磷酸葡萄糖类黄酮葡萄糖基转移酶；t t ：透明种皮；姆，：透明种皮无毛l 。 s o l i dl i n e si n d i c a t et h er o u t es u p p o r t e db yb i o c h e m i c a la n dg e n e t i ce v i d e n c e w h e r e a sd o t t e dl i n e si n d i c a t e h y p o t h e t i c a lr o u t e s e n z y m e sa l ep r e s e n t e di n u p p e r c a s eb o l dl e t t e r s ，w i t hc o r r e s p o n d i n gg e n e t i cl o c ii na x a b i d o p s i s g i v e ni nl o w e rc a s ei t a l i c sa n dm u t a n t so ft h er e g u l a t o r yg e n e sa f f e c t i n gt h e i re x p r e s s i o ni na r a b i d o p s i si nb r a c k e t s a h a l 0 ，p t y p eh t - a t p a s e ；a n r , a n t h o c y a n i d i nr e d u c t a s e ；b a n , b a n y u l s ；c 4 h c i n n a m a t e4 - h y d r o x y l a s e ；c h i ，e h a l c o n e l 。s o m e r a s e ；c h s ，c h a l c o n es y n t h a s e ，4 c l ，4 - c o u m a r a t e ：c o al