（内科学专业论文）mmp12和mmp13基因多态性与肺癌发病关系的研究.pdf

；：i ，： 1 1l， 目录 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l 洲m l l l l l l l l l l m 1 1 1 1 1 17 7 9 9 2 4 1 ”“”“”oooooo 4 2 和m m p 一1 3 基因多态性与肺癌发病关系的研究 ”- 7 ”一8 结果1 4 附l 虱1 6 附表- 1 8 讨论- - 2 3 结论2 7 参考文献2 8 综述基因多态性与肺癌的发病风险的相关性研究3 2 致谢4 6 个人简历o ooooooooboo 4 7 究 是一个高 基质和基 相关。基 质金属蛋白酶- 1 2 、1 3 都是m m p s 家族成员，研究发现m m p 1 2 及m m p 1 3 基因中存在一些多态性位点可以通过调控基因的转录或蛋白的表达水平 而影响肿瘤的发生和发展。本研究旨在探讨m m p 1 2 8 2 a o 和m m p 1 3 7 7 a j g 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p s ) 与中国北 方汉族人群肺癌易感性和淋巴结转移的关系。 方法：采用病例一对照研究方法。病例组选取2 0 0 5 年9 月至2 0 0 9 年9 月 在河北医科大学第四医院呼吸内科住院治疗，经组织和或细胞病理学确 诊的肺癌患者共4 2 0 例，所有患者均于放、化疗前采集空腹静脉血标本。 对照组选取同期在河北医科大学第四医院进行健康体检者共4 1 9 例，经胸 部x 线、腹部b 超等检查除外肺内及肺外肿瘤，且无遗传性疾病病史及肿 瘤家族史。采用蛋白酶k - 氯化钠盐析法提取基因组d n a ，聚合酶链反应一 限制性片段长度多态性( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，p c r r f l p ) 方法检测m m p 12 8 2 g 和m m p 13 7 7 g 基因多态性位点的各种基因型。 数据统计分析采用s p s s l 3 0 版软件包( s p s sc o m p a n y ，c h i c a g o ， i l l i n o i s ，u s a ) 进行处理，正常对照组各基因型频率分布行贮检验做 h a r d y - w e i n b e r g 平衡分析。病例组与对照组的年龄差异采用t 检验。两组间 的基因型和等位基因频率分布比较采用贮检验，以非条件l o g i s t i c 回归方法 计算表示相对风险度的比值比( o d d sr a t i o ，o r ) 及其9 5 可信区间 ( c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，c i ) 。采用e h 软件分析m m p 1 2 8 2 a g 和m m p 1 3 7 7 a g 基因单体型频率，2 l d 软件分析连锁不平衡状态。p 0 0 5 作为差异 有显著性的标准。 结果： 1m m p 1 2 _ 8 2 g 多态的a 、g 、g g 三种基因型在病例组和对照组 中文摘要 中的频率分别为9 6 2 、3 8 、0 j 9 1 9 5 2 、4 8 、0 ，两组相比无统计学 差异( p - - 0 4 9 1 ) ；a 、g 等位基因频率在病例组和对照组相比亦无统计学 差异( p - = - 0 4 9 6 ) 。与a 7 a 基因型相比，携带m m p 1 2a g 基因型与肺癌总 的发病风险无关( o r = 0 7 6 0 ，9 5 c i - - - 0 3 8 5 一1 5 0 1 ) 。根据病理类型分层 分析未发现m m p 1 2 8 2a g 多态与不同病理类型肺癌的发病风险相关。 2m m p 1 3 7 7 o 多态的g g 、g 、a a 三种基因型在病例组和对照组 中的频率分别为2 5 7 、4 9 3 、2 5 和2 4 1 、5 4 2 、2 1 7 ，两组相比 无统计学差异( 尸b o 3 4 0 ) ；a 、g 等位基因频率在病例组和对照组相比亦 无统计学差异( 卢o 7 3 2 ) 。与g g 基因型相比，携带m m p 1 3 7 7a g 及 a a 基因型均与肺癌总的发病风险无关( o r = 0 8 9 0 ，9 5 c i = 0 6 3 7 - - , 1 2 4 4 和o r = i 1 0 0 ，9 5 c i = 0 7 4 1 1 6 3 2 ) 。根据病理类型分层分析未发现 m m p 1 3 7 7a g 多态与不同病理类型肺癌的发病风险相关。 3 病例组的吸烟者占4 7 6 ，而对照组占3 5 3 ，两者相比有显著性差异 ( p = o 0 0 0 ) 。 4 根据个体吸烟状况分层分析，均未发现m m p 1 2 8 2a g 、m m p 一1 3 7 7 a g 多态对吸烟人群或非吸烟人群肺癌发病风险的影响。 5m m p 1 2 8 2 g 和m m p 1 3 7 7a g 多态的基因型分布在有淋巴结转移 组和无淋巴结转移组相比，无显著性差异( 辟o 5 8 6 和p = 0 3 6 2 ) 。m m p 1 2 8 2 g 和m m p 1 3 7 7a g 多态均与肺癌患者的淋巴结转移风险无关 ( o r = 0 7 0 2 ，9 5 c i = 0 1 9 乱2 5 1 2 和o r = 0 7 9 4 ，9 5 c i = 0 4 8 4 - - 1 3 0 4 ) 。 6 采用2 l d 软件分析发现m m p 1 2 8 2 g 和m m p 1 3 7 7 a gs n p s 间 不存在连锁不平衡关系( d7 = o 0 4 9 ) 。 结论： 1m m p 1 2 8 2a g 和m m p - 1 3 7 7a g 的基因多态性与中国北方汉族人群 肺癌遗传易感性无关。 2 根据病理类型分层分析未发现m m p 1 2 8 2 躺和m m p - 1 3 7 7a g 基因 多态对不同病理类型肺癌发病风险的影响。 3m m p 1 2 8 2a g 和m m p 1 3 7 7 躺单核苷酸多态性均与吸烟人群或非 吸烟人群肺癌的发病风险无关。 4m m p 1 2 8 2 g 和m m p 1 3 7 7a g 单核苷酸多态性均与肺癌淋巴结转 移无关。 平衡关系。 遗传易感性 英文摘要 a s s o c i a t i o no fs i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m si nt h em m p - 1 2 a n dm m p - 1 3 g e n e sw i t hl u n g c a n c e r a b s t r a c t o b j e c t i v e ：m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ( m m p s ) a r eaf a m i l yo fh i g h l y c o n s e r v e dz i n c d e p e n d e n tp r o t e o l y t i ce n z y m e s c o u l d ，w h i c hp l a yi m p o r t a n t r o l e si nt u m o rd e v e l o p m e n t ，i n v a s i o na n dm e t a s t a s i sb yd e g r a d a t i n gt h e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) a n db a s e m e n tm e m b r a n e ( b m ) ，a n df a c i l i t a t i n g a n g i o g e n e s i s m m p 一12a n dm m p 一13a st w oo ft h em m p sf a m i l y ，g r o w i n g e v i d e n c e si n d i c a t et h a ts i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) o fm m p 一12 a n dm m p 一13 g e n e sm a ya l t e rp r o t e i ne x p r e s s i o n l e v e l sb y r e g u l a t i n g t r a n s c r i p t i o na c t i v i t y t oi n f l u e n c e m a l i g n a n t t u m o r s d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n t h ea i mo f o u rs t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h ea s s o c i a t i o no fm m p 一12 8 2 a ga n dm m p 13 7 7 a gs n p sw i t ht h es u s c e p t i b i l i t ya n dl y m p h a t i c m e t a s t a s i so fl u n gc a n c e ro fh a nn a t i o n a l i t yi nn o r t h e r n ，c h i n a m e t h o d s ：t h i sc a s e c o n t r o ls t u d yi n c l u d e d4 2 0l u n gc a n c e rp a t i e n t sa n d 419h e a l t h yc o n t r o l s p a t i e n t s 谢t hh i s t o l o g i c a l l yc o n f i r m e dl u n gc a n c e rw e r e r e c r u i t e db e t w e e ns e p t e m b e r2 0 0 5a n ds e p t e m b e r2 0 0 9 ，a tt h ed e p a r t m e n to f r e s p i r a t o r y ，f o u r t hh o s p i t a l ，h e b e im e d i c a lu n i v e r s i t y a l l p a t i e n t sh a d n e v e ru n d e r g o n er a d i o t h e r a p yo rc h e m o t h e r a p yb e f o r ev e n o u sb l o o do fe m p t y s t o m a t hw a sd r a w n t h ec o n t r o l sw e r es e l e c t e df r o mc a n c e l 一f r e ei n d i v i d u a l s w h oc o n d u c t e dm e d i c a l c h e c k - u p i nf o u r t h h o s p i t a l ，h e b e i m e d i c a l u n i v e r s i t y i nt h es a m ep e r i o d g e n o m i cd n aw a se x t r a c t e db yu s i n g p r o t e i n a s ekd i g e s t i o nf o l l o w e db yas a l t i n go u tp r o c e d u r e m m p 一1 2 8 2 a g a n dm m p - 13 7 7 a gs n p sw e r e g e n o t y p e db yp o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n r e s t r i c t i v ef r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( p c r r f l p ) a n a l y s i s s t a t i s t i c a la n a l y s i sw a sp e r f o r m e du s i n gs p s s13 0s o f t w a r ep a c k a g e ( s p s sc o m p a n y , c h i c a g o ，i l l i n o i s ，u s a ) h a r d y - w e i n b e r ga n a l y s i sw a s p e r f o r m e db yc o m p a r i n gt h eo b s e r v e da n de x p e c t e dg e n o t y p ef r e q u e n c i e si n s t u d yg r o u p su s i n gc h i s q u a r et e s t t h et t e s tw a su s e dt oe x a m i n et h e 4 英文摘要 d i f f e r e n c eo fa g e sb e t w e e nc a s e sa n dc o n t r o l s c o m p a r i s o no ft h eg e n o t y p e a n da l l e l o t y p ed i s t r i b u t i o n si nt h et w og r o u p sw a sp e r f o r m e db ym e a n so f t w o s i d e dc o n t i n g e n c yt a b l e su s i n gc h i s q u a r et e s t t h eo d d sr a t i o ( o r ) a n d 9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l ( c i ) w e r ec a l c u l a t e du s i n ga l lu n c o n d i t i o n a ll o g i s t i c r e g r e s s i o n m o d e l t h em m p 12 8 2 a i g ，m m p - 13 7 7 a gh a p l o t y p e f r e q u e n c i e sa n dl i n k a g ed i s e q u i l i b r i u mc o e f f i c i e n tw e r ee s t i m a t e db yu s i n g e h l i n k a g es o f t w a r ea n d2 l d s o f t w a r e p 0 0 5w a sc o n s i d e r e ds i g n i f i c a n tf o r a 1 1s t a t i s t i c a la n a l y s e s r e s u l t s ： 1t h ef r e q u e n c yo ft h et h r e eg e n o t y p e s ( a a ，a g ，a n dg g ) o fm m p - 12 8 2 a gi np a t i e n t sa n dc o n t r o l sw e r e9 6 2 ，3 8 ，0a n d9 5 2 ，4 8 ，0 ， r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w og r o u p s 俨o 4 91 ) ；t h ef r e q u e n c yo fa ，ga l l e l e so ft h em m p - 1 2 8 2 a gs n pi nc a s e s w a sn o td i f f e r e n tf r o mt h a ti nh e a l t h yc o n t r o l s ( p = 0 4 9 6 ) c o m p a r e dt ot h e 入g e n o t y p e ，a gg e n o t y p ed i dn o ts i g n i f i c a n t l ym o d i f yt h er i s ko fl u n g c a n c e r ( o r = 0 7 6 0 ，9 5 c i = 0 3 8 5 1 5 01 ) t h em m p 一12 8 2 gw a s n o t a s s o c i a t e dw i t ht h er i s ko fl u n gc a n c e rw h e ns t r a t i f i e db yh i s t o l o g i c a l s u b t y p e s 2t h ef r e q u e n c yo ft h et h r e eg e n o t y p e s ( g g ，a g ，a n d a ) o fm m p - 13 - 7 7 a gi np a t i e n t sa n dc o n t r o l sw e r e2 5 7 ，4 9 3 ，2 5 a n d2 4 1 ，5 4 2 ， 2 1 7 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w o g r o u p s ( 卢o 3 4 0 ) ；t h ef r e q u e n c yo fa ，ga l l e l e so ft h em m p 一1 3 - 7 7 a gs n p i nc a s e sw a sn o td i f f e r e n tf r o mt h a ti nh e a l t h yc o n t r o l s ( 尸卸7 3 2 ) c o m p a r e d t ot h eg | gg e n o t y p e 。ga n da ag e n o t y p e sd i dn o ts i g n i f i c a n t l ym o d i f yt h e r i s ko f l u n gc a n c e r ( o r = 0 8 9 0 ，9 5 c i = o 6 3 7 - - 1 2 4 4 a n do i b1 10 0 ， 9 5 c i = 0 7 4 1 - - 1 6 3 2 ) t h em m p 一1 3 - 7 7 a gw a sn o ta s s o c i a t e dw i t ht h er i s k o fl u n gc a n c e rw h e ns t r a t i f i e db y h i s t o l o g i c a ls u b t y p e s 3t h e p r o p o r t i o no fs m o k e r si nl u n gc a n c e rp a t i e n t s ( 4 7 6 ) w a ss i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tf r o mt h a ti nh e a l t h yc o n t r o l s ( 3 5 3 ) ( 尸= 0 0 0 0 ) 4n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e db e t w e e nm m p - - 12 - 8 2 a ga n d m m p - - 13 7 7 a gp o l y m o r p h i s m sa n dt h er i s ko fl u n gc a n c e rw h e ns t r a t i f i e d 5 英文摘要 b ys m o k i n g s t a t u s 5n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e di nt h ef r e q u e n c i e so ft h em m p 12 - 8 2 a ga n dm m p - 13 7 7 a gg e n o t y p e sb e t w e e nl y m p h a t i cm e t a s t a s i sa n d n o n - l y m p h a t i cm e t a s t a s i s ( p = o 5 8 6 a n dp = - 0 3 6 2 ) t h e r em i g h tb en o a s s o c i a t i o nb e t w e e nm m p 12 - 8 2n ga n dm m p 一13 1 乩gp o l y m o r p h i s m s a n d l y m p h a t i c m e t a s t a s i si n l u n g c a n c e r p a t i e n t s ( o r = 0 7 0 2 ， 9 5 c i = o 19 6 2 512a n do r = 0 7 9 4 ，9 5 c i = o 4 8 4 - - 1 3 0 4 ) 6t h er e s u l t so ft h e2 l dp r o g r a ma n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em m p - 12 8 2 a g a n dm m p - l3 7 7 gp o l y m o r p h i s m s d i s p l a y e dl i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m ( d7 = o 0 4 9 ) c o n c l u s i o n s ： 1t h eh 删p 一1 2 8 2 a ga n dm m p - 1 3 7 7 a gs n p s m a yh a v e n o s u s c e p t i b i l i t yt ot h el u n gc a n c e ro fh a nn a t i o n a l i t yi nn o r t h e r n ，c h i n a 2t h em m p 12 8 2 a ga n dm m p 13 7 7 gw e r en o ta s s o c i a t e dw i t ht h e r i s ko fl u n gc a n c e rw h e ns t r a t i f i e db y h i s t o l o g i c a ls u b t y p e s 3n e i t h e rm m p 12 8 2 舶n o rm m p 13 7 7 gw e r ea s s o c i a t e dw i t ht h er i s k o fl u n gc a n c e rw h e ns t r a t i f i e db ys m o k i n gs t a t u s 4n e i t h e rm m p 1 2 8 2 n gn o rm m p 1 3 7 7 a gw e r ea s s o c i a t e dw i t h l y m p h a t i cm e t a s t a s i so fl u n gc a n c e r 5t h em m p 一12 8 2 a ga n dm m p 一13 7 7 a gp o l y m o r p h i s m sd i s p l a y e d l i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m k e yw o r d s ：m m p 1 2 ；m m p 1 3 ；s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ；l u n g c a n c e r ；s u s c e p t i b i l i t y 6 的研究 起源于肺支气 管和肺泡上皮细胞。按组织病理类型主要分为非小细胞肺癌( n o n s m a l l c e l ll u n gc a n c e r ，n s c l c ) 和小细胞肺癌( s m a l lc c l ll u n gc a n c e r ，s c l c ) 两大类，其中n s c l c 主要包括鳞癌( s q u a r n o u sc e l lc a r c i n o m ao fl u n g ，s c ) 和腺癌( a d e n o c a r c i n o m ao f l u n g ，a c ) 。 肺癌居全球男性癌症死亡原因首位和女性第2 位且发病率和死亡率在 世界各国都有明显增高的趋势。据2 0 0 4 年首届中国肺癌南北高峰论坛上卫 生部全国肿瘤防治研究办公室提供的资料显示，肺癌已成为我国第一大癌 症，发病率及病死率增长最为迅速，是预后最差的恶性肿瘤之一。在一些 发达国家中，肺癌患者5 年生存率不足1 5 ，而在发展中国家中肺癌患者5 年生存率刚刚达到5 甚至更低。如此低的生存率，主要是由于7 0 的肺癌 患者发现时均为晚期。因此，早期诊断是提高肺癌患者生存率的关键。肺 癌的病因主要是吸烟和环境化学致癌物。流行病学研究表明，肺癌具有家 族聚集现象，肺癌患者的亲属和后代的发病率明显高于普通人群【l 】，这些 证据提示肺癌的发病具有遗传易感性，目前，家族的遗传易感性所起的作 用逐渐为人们所重视【2 1 。近年来随着分子生物学技术的发展，人们对疾病 的认识达到了基因水平。单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ， s n p ) 作为一种新的遗传标记，也越来越受到世人的关注，将为我们早期 诊断及治疗肺癌提供一个新的思路。 m m p s 是一组依赖于锌离子的内切蛋白水解酶，通过降解细胞外基 质、调节细胞粘附、促进肿瘤血管生成等，参与了肿瘤的发生发展、侵袭 和转移【3 1 。其作为一组重要的遗传候选基因，已引起研究者的高度关注。 以往对m m p s 基因在组织中的表达水平与肿瘤相关性的研究较多，近年来 的研究发现存在于该基因中的一些功能性多肽位点可能通过改变该基因 的转录或表达水平从而影响肿瘤的发生、发展【4 。5 】。存在于m m p 1 2 启动子 区8 2 g 和m m p 1 3 启动子区7 7 g 多态性位点可以通过改变基因的转 录活性，而影响蛋白表达水平，进而与多种恶性肿瘤，如乳腺癌、膀胱癌、 研究论文 头颈部癌、皮肤癌等的发病相关，但与肺癌的相关研究尚少见报道，本研 究采用病例一对照研究方法，探讨m m p 1 2 8 2 m g 和m m p 1 3 7 7 a g 单核 苷酸多态性与中国北方汉族人群肺癌发病风险和淋巴结转移的关系。 材料与方法 1 研究对象 1 1 病例组本研究收集肺癌患者4 2 0 例，为2 0 0 5 年9 月至2 0 0 9 年9 月在我院 呼吸内科住院患者，均经组织病理和或细胞病理确诊为肺癌，均无遗传 性疾病病史，所有患者均于放、化疗前采集空腹静脉血标本。准确记录肺 癌患者的性别、年龄、吸烟状况、淋巴结转移情况。 1 2 对照组对照组4 1 9 份j 均为同期在本院体检中心进行健康体检的人员， 经胸部x 线、腹部b 超等检查除外肺内及肺外肿瘤，且无遗传性疾病病史及 肿瘤家族史。准确记录对照组个体的性别、年龄、吸烟状况。 病例组及对照组均为中国北方人，且均为汉族，彼此无血缘关系。吸 烟者的定义是参照w h o 确定：每日吸烟1 支或以上，连续吸烟3 个月或以上 为吸烟者。螺旋c t 影像学显示纵膈淋巴结短径大于1 0 r n m t 6 j ，或浅表淋巴结 经病理证实转移者被定义为有淋巴结转移。所有研究对象的信息均通过面 对面直接询问获得并准确记录。 2 主要实验设备、仪器与器皿 ( 1 ) s w c j 2 f d 型净化工作台苏州安泰空气技术公司 ( 2 ) 离心机l x j 6 4 01北京医疗仪器修理厂 ( 3 ) 台式离心机p q 1 6 0 0 a上海培清科技有限公司 ( 4 ) h j 3 恒温磁力搅拌器江苏金坛医疗仪器厂 ( 5 ) h 1 微型混合器上海彭氏实业有限公司 ( 6 ) 电子天平p b 3 0 0 2 sm e t t l e r c o m p a n y ，s w i t z e r l a n d ( 7 ) p c r 扩增仪m a s t e r c y c l e r 5 3 3 3 ( 8 ) d y y i i l 2 稳压稳流电泳仪 ( 9 ) d y y 1 3 i d 型电泳槽 ( 1 0 ) 微波炉( m i c r o w a v eo v e n ) ( 1 1 ) 紫外线检测仪 德国e p p e n d o r 忪司 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 上海中达医学应用研究所 北京市新技术应用研究所 研究论文 ( 1 2 ) 澳柯玛冰柜 青岛澳柯玛公司 ( 1 3 ) 海尔冰箱b c 1 6 5 d青岛海尔集团 ( 1 4 ) m d f u 5 0 v 8 6 低温冰箱日本三洋公司 ( 1 5 ) 2 0 2 2 a 型电热恒温烤箱上海阳光实验仪器公司 ( 1 6 ) e p p e n d o r f r e s e a r c h 移液器德国e p p e n d o r f 公司 ( 1 7 ) d y y i i i2 8 a 型电泳槽北京市六一仪器厂 ( 1 8 ) t s 1 型脱色摇床江苏省海门市麒麟医用仪器厂 ( 1 9 ) 凝胶成像分析仪a l p h a l m a g e r2 2 0 0 美国a n l a i 公司 ( 2 0 ) 冰盒上海复日科技有限公司 3 主要实验试剂 ( 1 ) t r i t o n x 1 0 0 s i g m a ( 2 ) t r i s h c l ( 三羟甲基氨基烷)s i g m a 。 ( 3 ) e d t a ( 乙二胺) s i g m a ( 4 ) s d s ( 十二烷基磺酸钠) s i g m a ( 5 ) 蛋白酶km e r c kk g a a6 4 2 7 1 d a r m s t a d t ，g e r m a n y ( 6 ) 1 0 x p c rb u f f e r北京赛百盛生物有限公司 ( 7 ) 10 m m o l ld n t p s q b i o g e n e ，g e r m a n y ( 8 ) t a q d n a 聚合酶北京赛百盛生物有限公司 ( 9 ) 琼脂糖 s i g m a ( 1 0 ) 溴化乙锭( e b ) n u rf u rl a b o r z w e c k eg e p r u f i ( 11 ) 1 0 0 b pd n al a d d e r华美生物工程公司 ( 1 2 ) 限制性内切酶 p v ui i北京赛百盛基因技术有限公司 x s p i大连宝生物有限公司 ( 1 3 ) 引物北京赛百盛基因技术有限公司 ( 1 4 ) 溴酚蓝石家庄市制剂厂 ( 1 5 ) n a c l石家庄市制剂厂 ( 1 6 ) 无水乙醇天津市北方化玻购销中心 4 实验流程 4 1 入组所有研究对象在征得本人或其家属同意后，无菌操作下采集外 周静脉血5 m l ，加入内置有0 8 5 m l 枸橼酸钠的试管中，混匀，放置于4 冰 研究论文 箱保存备用。 4 2 记录临床资料记录病例组及对照组个体相关资料，包括姓名、性别、 年龄、籍贯、民族、吸烟史、病史及肺癌患者的淋巴结转移情况。 4 3 外周血白细胞d n a 的提取采集每位研究对象的静脉血后1 周内提取 外周血白细胞d n a 。 4 3 1 实验试剂的制备 4 3 1 1d n a 提取液的制备 1 mt r i s h c l ( p h - 8 o ) l m l o 5 me d t a2 m l 1 m n a c l l m l 加水至1 0 0 m l 4 3 1 2t e 缓冲液的制备 1 mt r i s h c ll m l o 5 me d t a0 2 m l 加水至1 0 0 m l 4 3 1 35 0 t a e 贮液的制备 t r i s 2 4 2 9 冰乙酸5 7 1 m l 0 5 m o l le d - f a 10 0 m ( p h - 8 0 ) 加水至1 0 0 0 m l 4 3 1 45 x t b e 的制备 t r i s 5 4 9 e d t a n a 2 3 7 2 9 硼酸 2 7 5 9 加水至1 0 0 0 m l 4 3 2 外周血白细胞d n a 的提取 d n a 提取采用蛋白酶k 消化一饱和氯化钠盐析法。具体操作程序如 下： 4 3 2 1 将血液标本置于5 0 m l 离心管中，加预冷蒸馏水至5 0 m l ，反复吹打 混匀，2 5 0 0 r p m 室温离一t 二, 1 5 分钟，缓慢倾倒，弃上清，重复2 3 次至红细 胞完全裂解。 研究论文 4 3 2 2 加入预冷的o 1 t r i t o n - x1 0 0 至5 0 m l ，同上离心，去上清，用预冷 蒸馏水洗涤1 - 2 次，沉淀物即为白细胞。 4 3 2 3 沉淀物中加入3 m ld n a 提取液，充分混匀，悬浮白细胞，加10 s d s1 5 0 1 且l ( 终浓度o 5 ) 剧烈振荡至无凝块。 4 3 2 4 加入蛋白酶k 至终浓度为1 0 0 i - t g m l ( 约4 0 0 u 1 ) ，混匀，3 7 。c 水浴 过夜消化。 4 3 2 5 加入5 m o l l 的n a c l1 2 m l ，剧烈振荡2 5 s ，2 5 0 0 r p m 室温离- i , 1 5 m i n 。 4 3 2 6 将上清倒入另一盛有8 m l 无水乙醇的玻璃瓶中，反复颠倒混匀。 4 3 2 7 挑出d n a 至内置7 0 乙醇l m l 高压灭菌的e p p e n d o r f 管中， 1 2 0 0 0 r p m 室温离。l 二, 5 m i n 后弃去乙醇，倒置e p p e n d o r 借并使乙醇挥发干净。 4 3 2 8 以2 0 0 1t e 溶解d n a ，4 c 放置至少2 4 h ，至彻底溶解。 4 3 2 9d n a 鉴定：将提取的基因组d n a ，在o 8 琼脂糖凝胶中电泳( 恒 压8 0 v ，电泳缓冲液1 x t b e ) 3 0 分钟后，将凝胶移至0 【成像系统下进行观 察。 4 3 2 1 0d n a 定量：用无菌去离子水将鉴定合格的d n a 用溶解液稀释 适当倍数，在紫外分光光度仪上澳0 量2 6 0 n m ( o d 2 6 0 ) 和2 8 0 n m ( o d 2 8 0 ) 两个波长的吸光度( o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值大于1 6 ) ，将可用的d n a 置 于8 0 冰箱储存备用。 4 4 稀释d n a 备用：将t e 溶解的d n a 用无菌蒸馏水按比例稀释，终浓度 为1 0 0 n g p l ，在震荡器上震荡2 0 秒后短暂离心，置于2 0 c 冰箱备用，此即 为p c r 反应中的模板d n a 。 4 5 引物的设计与合成：m m p 1 2 和m m p 1 3 基因上的多态性位点特异性 核苷酸序列引物设计，并从g e n e b a n k 核对引物无误，由北京赛百盛基因 技术有限公司合成。 4 5 1m m p 1 2 8 2 g 特异性上游引物：5 g a g a t a g a t c a a g g g a t g a t a t c a g c 3 ；下游引物：5 - a a g a g c t c c a g a a g c a g t g g 3 。 4 5 2m m p 13 7 7 a g 特异性上游引物：5 g a ，r a c g t t c t t a c a g a a g g c 3 ；f 游引物：5 g a c a a a t c a t c t t c a t c a c c 3 。 4 6 扩增m m p 1 2 和m m p 1 3 基因的反应体系： 灭菌去离子水 1 0 x p c r 缓冲液 1 0 8 u l 2 4 i _ t l 研究论文 p c r 染料 2 o 山 上游引物 1 o 山 下游引物 1 o 山 1 0m m o l l 心汀p s 0 4 山 taq酶04山 模板d n a 2 o n 将上述反应液轻弹混匀、短暂离心以集中反应液于管底。 4 7 依据设计的循环参数进行扩增，反应条件： 4 7 1m m p 1 2 8 2 g ：9 4 预变性1 0 m i n ，然后按9 4 变性4 5 s ，5 7 退 火4 5 s ，7 2 延伸4 5 s ，3 5 个循环后，7 2 c 延t 申7 m i n 。 4 7 2m m p 1 3 7 7 g ：9 4 预变性1 0 m i n ，然后按9 4 变性4 5 s ，5 2 退 火3 0 s ，7 2 延伸4 5 s ，3 5 个循环后，7 2 延伸7 m i n 。 4 8 琼脂糖凝胶的制备 用电子天平分别秤取2 9 、铅的琼脂糖粉末，溶于1 0 0 m llx t a e 中， 加入装有琼脂糖粉末的椎形瓶中混匀，置于微波炉内至熔融，取出后加入 溴化乙锭1 0 - t l ( o 5 t g m 1 ) ，充分混匀后将熔融液体倒入胶板，冷却备用。 2 、4 的琼脂糖凝胶分别用于p c r 产物和酶切产物分析。 4 9p c r 产物分析 4 9 1 将制备好的胶板放入水平电泳槽内。 4 9 2 将稀释的l x t a e 液，倒入电泳槽至稍高出胶面为宜。 4 9 3 吸取3 山扩增产物( 余置于4 保存备用) 加样于琼脂糖凝胶电泳， 加样阴性对照( 未加模板d n a ，用灭菌去离子水替代的p c r 产物) 及阳 性对照( 多次重复所获得的稳定的p c r 产物) ，同时选择l o o b pd n a l a d d e r 水平电泳。 4 9 4 通电，稳压l o o v ，电泳时间为1 0 分左右。 4