（内科学专业论文）stat3作为一种新的肺肿瘤标志物的实验研究.pdf

惝y帆1删8891 3 9 s t a t 3 作为一种新的肺肿瘤标志物的实验研究 摘要 目的：检测信号传导和转录活化因子3 ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o r o f t r a n s c r i p t i o n3 , s t a t 3 ) 、癌胚抗原( c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ，c e a ) 、 糖类抗原1 2 5 ( c a r b o h y r d r a t ea n t i g e n l 2 5 ，c a l 2 5 ) 在人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细胞m r c 5 中的表达，分析三者在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的相互关系，探讨s t a t 3 对肺腺癌早期诊断的价值及能否成为一种 新的肺肿瘤标志物。方法：1 、采用电化学发光免疫法( e c l i a ) 检 测人肺腺癌细胞a 5 4 9 署1 正常人胚肺细胞m r c 5 培养3 天的培养液中 c e a 、c a l 2 5 的表达水平。2 、采用免疫组织化学p v 法检测人肺腺癌 细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细胞m r c 5 中s t a t 3 、c e a 、c a l 2 5 蛋白表 达。采集图像，利用i p p ( i m a g e p r op l u s ) 6 o 图像分析软件分析图像， 通过测图像m o d ( m e a no p t i c a ld e n s i t y ，平均光密度) 值判断图片染色 强度。并分析在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中s t a t 3 蛋白分别与c e a 、c a l 2 5 蛋白表达的相关性。3 、采用荧光定量p c r 法检测人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细胞m r c 5 中s t a t 3m r n a 、c e am r n a 、c a l 2 5 m r n a 的相对表达量，分析人肺腺癌细胞a 5 4 9 中s t a t 3m r n a 分别 与c e am r n a 、c a l 2 5m r n a 表达的相关性。结果：1 、电化学发光 免疫法结果：c e a 、c a l 2 5 在人肺腺癌细胞a 5 4 9 培养液中的表达水平 明显高于它们各自在正常人胚肺细胞m r c 5 培养液中的表达，经统计 学分析，它们各自在两组细胞中的表达差异有统计学意义( p o 0 5 ) ； 2 、免疫组织化学染色图像分析结果：( 1 ) s t a t 3 蛋白、c e a 蛋白、 c a l 2 5 蛋白在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的表达水平均明显高于它们各自 在正常人胚肺细胞m r c 5 中的表达，经统计学分析，它们各自在两组 细胞中的表达差异有显著统计学意义( p o 0 1 ) 。( 2 ) s t a t 3 蛋白与 c e a 蛋白在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的表达呈正相关( r = o 5 6 0 ，p = 0 0 1 ， p 0 0 5 ) 。( 3 ) s t a t 3 蛋白与c a l 2 5 蛋白在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的表达 呈正相关( f o 7 2 1 ，p = 0 0 0 0 ，p 0 0 1 ) ；3 、荧光定量p c r 技术结果显 示：( 1 ) s t a t 3 、c e a 、c a l 2 5 和g a p d h 扩增产物特异；扩增效率分 别为9 6 9 7 、9 8 7 1 、9 5 1 7 和9 6 7 6 。( 2 ) s t a t 3m r n a 、c e a m r n a 、c a l 2 5m r n a 在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的表达水平均明显高于 它们各自在正常人胚肺细胞m r c 5 中的表达，经统计学分析，它们各 自在两组细胞中的表达差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。( 2 ) s t a t 3 m r n a 与c e am r n a 在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的表达呈正相关( r = 0 5 2 1 ，p = 0 0 4 7 ，p 0 0 5 ) 。( 3 ) s t a t 3m r n a 与c a l 2 5m r n a 在人肺腺 癌细胞a 5 4 9 中的表达呈正相关( f o 8 1 4 ，p = 0 0 0 0 ，p 0 0 1 ) ；结论： s t a t 3 、c e a 、c a l 2 5 蛋白和m r n a 在人肺腺癌细胞a 5 4 9 中的表达均 明显高于它们各自在正常人胚肺细胞m r c 5 中的表达，且s t a t 3 蛋白 和m r n a 的表达与临床上常用的肺肿瘤标志物c e a 、c a l 2 5 蛋白和 m r n a 的表达都呈正相关，说明s t a t 3 可以作为一种新的肺肿瘤标志 物推荐临床使用。 关键词：肺腺癌；s t a t 3c e a ；c a l 2 51 肺肿瘤标志物 e x p e r i m e n t a ls t u d yo fs t a t 3 a san e wt u m o r m a r k e ro fl u n g a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t e t h ee x p r e s s i o no fs t a t 3 ( s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n3 ) ，c e a ( c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ) a n dc a 12 5 ( c a r b o h y r d r a t ea n t i g e n ) i nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 a n dh u m a nn o r m a ll u n gc e l lm r c - 5 ，a n a l y z et h e i rr e l a t i o n s h i pi nl u n g a d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 ，e x p l o r et h ev a l u eo fs t a t 3o ne a r l yd i a g n - o s i so fl u n gc a n c e ra n dt h ep o s s i b i l i t ya san e wt u m o rm a r k e r m e t h o d s ： 1 、u s e dt h ee l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c et od e t e c tt h el e v e l so fc e a ， c a12 5i nm e d i u mw h i c hc u l t u r el u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 ，h u m a n n o r m a ll u n gc e l lm r c - 53d a y s 2 、e x p r e s s i o no fp r o t e i no fs t a t 3 ，c e a a n dc a12 5i nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9a n dh u m a nn o r m a ll u n g c e l lm r c 5w e r et e s t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n i n g ( p v ) t h e c e a ，c a 12 5i n l u n g a d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 sm e d i u mw e r e a p p a r e n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nh u m a n n o r m a ll u n gc e l lm r c - 5 a f t e r s t a t i s t i c a la n a l y s i s ，t h e yh a ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 2 、t h e r e s u l t so ft h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ：( 1 ) t h ep r o t e i n l e v e l so f s t a t 3 ，c e aa n dc a 12 5i n l u n g a d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9w e r e a p p a r e n t l yh i g h e rt h a nt h a t i nh u m a nn o r m a ll u n g c e l lm r c - 5 a f t e r s t a t i s t i c a la n a l y s i s ，t h e yh a ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 01 ) ( 2 ) t h ep r o t e i nl e v e lo fs t a t 3w a si nap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t h c e ai nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 ( r = 0 5 6 0 ，p = 0 0 1 ，p 0 0 5 ) ( 3 ) t h ep r o t e i nl e v e lo fs t a t 3w a si nap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hc a 12 5i n l u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 ( r = 0 7 21 ，p = o 0 0 0 ，p 0 01 ) 3 、t h er e s u l t s o ft h er e a lt i m ep c r ：( 1 ) t h ep c rp r o d u c t so fs t a t 3 ，c e a ，c a12 5a n d g a p d hw e r es p e c i f i c t h ep c re f f i c i e n c yo fs t a t 3 ，c e a ，c a 12 5a n d g a p d hw e r e9 6 9 7 ，9 8 7 1 ，9 5 1 7 a n d9 6 7 6 s e p a r a t e l y ( 2 ) t h e m r n al e v e l so fs t a t 3 ，c e aa n dc a l 2 5i nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l l a 5 4 9w e r ea p p a r e n t l yh i g h e rt h a nt h a t i nh u m a nn o r m a ll u n g c e l l m r c 5 a f t e rs t a t i s t i c a l a n a l y s i s ，t h e y h a d s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) ( 3 ) t h em r n a l e v e lo fs t a t 3w a si nap o s i t i v e c o r r e l a t i o nw i t hc e ai nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 ( r 2 o 5 21 ，p = 0 0 4 7 ，p 0 0 5 ) ( 4 ) t h e m r n al e v e lo fs t a t 3w a si nap o s i t i v e c o r r e l a t i o nw i t hc a l 2 5i nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l la 5 4 9 ( f o 8 1 4 ，p 2 0 0 0 0 ，p 0 01 ) c o n c l u s i o n ：t h ep r o t e i n a n dm r n al e v e l s o f 4 5 - 址! 鱼 刖 吾 世界卫生组织( w h o ) ( ( 2 0 0 8 年世界癌症报告指出：至l j 2 01 0 年， 癌症将超越心血管病，成为人类头号杀手。至1 j 2 0 3 0 年，全球每年将有 2 7 0 0 万新发癌症病例出现、1 7 0 0 万癌症死亡病例。与2 0 0 7 年的1 2 0 0 万例新发癌症病例和不n 8 0 0 万癌症死亡病例相比，癌症负担将加倍。 在所有癌症之中，肺癌的发病率和死亡率在男性居首位，在女性其发 病率仅次于乳腺癌，但死亡率却居首位。其中非小细胞肺癌( n o n s m a l l c e l ll u n gc a n c e r ，n s c l c ) 约占全部肺癌病例的8 0 左右【1 1 。2 0 0 4 年全世 界因肺癌死亡的人数达7 4 0 万，约为当年全世界总死亡人数的1 3 f 2 1 。 在现有的技术和卫生条件下，约8 0 以上的肺癌患者确诊时已属晚 期，其5 年生存率仅1 5 ，而早期诊断的肺癌患者，5 年生存率却高达 8 0 【3 1 。因此，在肺癌的研究和临床实践中，一级预防固然重要，而 早期诊断仍是提高患者治愈率和降低死亡率的关键。目前在肺癌的诊 治过程中，影像学、细胞学以及病理学检查仍然起着关键作用。影像 学检查容易漏诊和误诊，痰或胸水细胞学检查阳性率不高，尤其是腺 癌的阳性率最低。病理学检查主要是通过开胸活检、纤维支气管镜或 经皮肺穿刺活检等方法取得细胞学和组织学依据，是诊断肺癌的“金 标准”，虽特异性极高，但对于生长在肺周边无法取得病理组织的病 灶、隐性病灶、亚临床病灶及微小转移病灶的病理活检仍存在局限性， 且费用较高，创伤较大，患者不易接受，l 临床应用受限。肿瘤标志物 是癌细胞生长过程中产生的一种或几种正常情况下没有或含量很低 的特异性物质，或是宿主细胞因癌细胞入侵而过量产生的正常细胞组 分。因为肿瘤标志物是在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞合成、释 放或是宿主对癌细胞反应性的一类物质，因此可用于指示肿瘤的存 在。为探索特异、高效的肿瘤标志物，国内外已开展了大量的实验研 究，自上世纪8 0 年代以来，包括肺癌在内的各种肿瘤的标志物相继被 发现，并广泛应用于临床。大量研究显示肿瘤标志物在肿瘤普查、筛 选、诊断、鉴别诊断、预后、疗效判定及肿瘤复发等方面发挥了重要 作用。 信号转导和转录激活因子( s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n ；s t a t ) 是1 9 9 0 年d a m e l l 4 在研究干扰素( i f n ) 信号转导通路 时作为d n a 结合蛋白而被克隆鉴定的，它是一类具有信号转导和转 录调节功能的蛋白质，参与多种细胞因子、激素和生长因子的信号转 导和转录调控以及细胞的增殖和分化。由7 5 0 9 0 0 个氨基酸组成，分 子量8 4 - - 一，1 1 3 万，包括s t a t l 4 ，s t a t 5 a ，s t a t 5 b ，s t a t 6 等7 个成员 【5 1 。s t a t 3 是s t a t 家族中尤为活跃的一个成员，具有强烈的抑制细 胞凋亡、促进细胞增殖的作用，该通路持续激活可促使肿瘤发生发展 以及转移，已被定义为癌基因【6 1 。近年来研究发现7 别，s t a t 3 可作为 肺癌治疗的新靶位。 c e a 是1 9 6 5 年g o l d 矛i f r e e m a n 1 0 】首先从结肠癌和胚胎组织中提取 的一种具有人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白，由6 4 1 个氨基酸组成， 分子量约为1 5 - - - - 3 0 万。主要存在于胎儿消化道上皮组织，胰脏和肝脏， 正常成年人血清含量极低，在肺癌、肝癌、乳腺癌、类癌等均有较高 分子它执行着癌细胞间及癌细胞与基质胶 原间的粘附反应，在肿瘤生长和转移中起重要作用，是临床最早用于 诊断肺癌的一项肿瘤标志物，对肺癌特别是肺腺癌的诊断价值己被临 床证实。 c a l 2 5 是1 9 8 1 年b a s t 1 2 1 发现的一种大分子的粘液性糖蛋白，分子 量2 0 1 0 0 万，主要存在于胎儿消化道上皮细胞、羊膜、成人胸腺、输卵 管、子宫及宫颈管内膜中，在细胞内合成并贮存在细胞内。正常情况 下，因细胞间的连接和基膜的阻挡作用，c a l 2 5 不能进入血液。正常 人血清中检测不到c a l 2 5 或者浓度很低，当组织恶变时这种阻挡作用 被破坏，c a l 2 5 因而释放到血液中，使血浓度c a l 2 5 升高【1 3 】。 c e a 和c a l 2 5 作为肺肿瘤标志物己被广泛应用于临床。研究发现 1 4 , 1 5 c e a 和c a l 2 5 与肺腺癌的表达有密切的关系，在腺癌中的表达高 于鳞癌。但由于肺癌的多样性、同种肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学 行为的复杂性，目前广泛应用于i 临床的经典的肿瘤标志物仍存在种种 不足和缺陷，远未达到人们的预想值，故发现新的肿瘤标志物一直是 临床所关注的热点问题。 我们的课题组在前期研究中已经阐明了s t a t 3 在n s c l c 中的生 物学效应，初步确定了s t a t 3 作为癌基因在n s c l c 发生发展、增殖 分化、凋亡、细胞周期调控等过程中都发挥了重要的作用，是肺癌多 元化发生机制中重要的一种 7 , 1 6 - 1 8 】。但是s t a t 3 能否成为一个新的肿 瘤标志物，以利于临床提高肺癌的早期诊断率，更好地造福于肺癌患者， 目前国内外尚无这方面的临床和实验报道，鉴于此，我们设计了本实 验，应用电化学发光免疫法检测人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细 胞m r c 5 培养三天的培养液中c e a 、c a l 2 5 的表达水平并分析c e a 、 c a l 2 5 在两种细胞培养液中表达水平有无差异；采用免疫组化、荧光 定量p c r 等方法测定人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细胞m r c 5 中 s t a t 3 、c e a 、c a l 2 5 蛋白和m r n a 的表达，同时对s t a t 3 分别与 c e a 、c a l 2 5 的相关性进行比较，从而探讨s t a t 3 能否成为一种新的 肺肿瘤标志物，为肺腺癌寻找一种简便、快速、准确的检测方法提供 理论基础和实验依据。 材料与方法 1实验材料 1 1 细胞株 人肺腺癌a 5 4 9 细胞株、正常人胚肺m r c 5 细胞株，由泸州医学院 中心实验室提供。 1 2 主要实验试剂 d m 匣m 】h i g hg l u c o s e ( ix ) 胰酶细胞消化液 胎牛血清 p b s 粉剂 二甲亚砜( d m s o ) 青霉素链霉素溶液 癌胚抗原定量测定试剂盒 ( 电化学发光法) 糖类抗原1 2 5 定量测定试剂 盒( 电化学发光法) 兔抗人s t a t 3 多克隆抗体 兔抗人c e a 多克隆抗体 兔抗人c a l 2 5 多克隆抗体 免疫组化p v 试剂盒 h r p d a b 底物显色试剂盒 美国h y c l o n e 公司 碧云天生物技术研究所 美m h y c l o n e 公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 上海生化试剂二厂 碧云天生物技术研究所 瑞典r o c h e 公司 瑞典r o c h e 公司 b i o w o r l d 科技公司 北京博奥森生物技术有限公司 北京博奥森生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 t i a n g e n 公司 苏木素染液 二乙基焦磷酰胺( d e p c ) 氯仿( 分析纯) 无水乙醇( 分析纯) 细胞裂解液t r i z o l 总r n a 提取试剂盒 2 0 0 8b i o b r kr tk i t t a k a r ar n ap c rk i t ( a m y ) v e r 3 0 s t a t 3 引物 c e a 引物 c a l 2 5 引物 g a p d h 引物 2 主要实验仪器 h e a lf o r c e 生物安全柜 二氧化碳细胞培养箱 电热恒温水浴箱 双目倒置相差显微镜 台式离心机 4 。c 冰箱 2 0 。c 冰箱 8 0 超低温冰箱 南京建成科技有限公司 g i b c o br l 公司 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 t i a n g e n 公司 t i a n g e n 公司 。 成都博瑞克生物技术有限公司 大连宝生物有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海力申科技仪器有限公司 美国t h e r m o 电器公司 上海医疗器械七厂 南京江南光电股份有限公司 上海安亭科学仪器厂 青岛海尔电器有限公司 青岛海尔电器有限公司 美国f o r m a 公司 显微镜 罗氏c o b a se4 1 1 电化学发 光全自动免疫分析仪 四度恒温超速离心机 t c - 512 梯度p c r 仪 i c y c l e ri qr e a l t i m e p c r 扩增仪 微量核酸定量仪 3实验方法 3 1 细胞培养 日本奥林巴斯公司 瑞典r o c h e 公司 美国科俊仪器公司 英国t e c h n e 公司 美国b i o r a d 公司 美 虱n a n o d r o p 公司 3 1 1 相关实验用品的准备 各种玻璃器皿和塑料器皿常规洗涤、泡酸、冲洗、烘干、包装、 消毒后备用。洗涤：各种玻璃器皿和塑料器皿浸泡在洗衣粉水中过夜 ( 注意要让水完全进入器皿，不应留有汽泡) ，然后用试管刷醮洗衣粉 反复刷洗3 遍，清洗干净，在恒温干燥箱中烘干备用。泡酸：将玻璃 器皿浸泡在清洁液( 浓硫酸、重铬酸钾、蒸馏水按一定比例配制) 中， 塑料器皿先后浸泡在2 氢氧化钠、5 稀盐酸中，浸泡都要过夜以除 去蛋白质等生物大分子。冲洗：将器皿从酸中取出，倾倒酸液，自来 水冲洗2 0 遍，蒸馏水反复冲洗3 遍，中和平衡电荷；烘干后用纸包好， 。 再用消毒饭盒和包布包装，贴上标签。消毒：1 2 1 高温高压消毒3 0 分钟，烘干后备用( 消毒后1 周内使用有效) 。熟悉生物安全柜，低速 和高速离心机，二氧化碳培养箱等实验室各种仪器的使用。 3 1 2 溶液配方 1 0 胎牛血清的d m e m 培养液：胎牛血清1 0 m l 溶于9 0 m l d m e m 培 养液中，加入青霉素链霉素溶液l m l ，使青霉素、链霉素的最终浓度 分别为1 0 0 u m l 和0 1 m g m l 。 冻存液：取1 0 胎牛血清的d m e m 培养液9 0 m l ，加入1 0 m l - - i 甲亚 砜( d m s o ) 。 3 1 3 实验试剂 d m e m h i g hg l u c o s e ( i x ) 、胎牛血清、青霉素链霉素溶液、p b s 、 二甲亚砜、胰酶细胞消化液。 3 1 4 细胞复苏 将保存在液氮( 1 9 6 。c ) 中的人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细i 胞m r c 5 取出，迅速置于3 7 c 水浴中，轻轻振荡使冻存的细胞悬液 完全融化。将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加1 0 倍体积的 1 0 胎牛血清的d m 培养液，吹打混均。1 5 0 0r p m 离一1 , 3 m i n ，弃上 清液。加入1 0 胎牛血清的d m e m 培养液适量轻轻吹打沉淀的细胞， 使其悬浮，对细胞进行计数。按5 1 0 5 个m l 的细胞密度，将细胞接种 在培养瓶中，加入1 0 胎牛血清的d m e m 培养液适量，置于3 7 。c - 氧 化碳细胞培养箱中培养，2 4 d x 时后见细胞贴壁生长，说明复苏成功。 3 1 5 细胞传代 用吸管吸弃培养瓶中旧的培养液，向瓶内加入适量的p b s ，轻轻 摇动培养瓶清洗细胞后倒掉。加入0 2 5 胰酶细胞消化液，消化液的 ，轻轻摇动培养瓶，在倒置显微镜下对 培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，迅速将消化 液吸出。加入适量p b s ，转动培养瓶后倒掉，加入1 0 胎牛血清的 d m e m 培养液终止消化。然后用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁， 制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序 进行，保证瓶壁各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力 过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。将吹打后的细胞置于倒置显 微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞 已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。收集细胞悬液于离心 管中，1 0 0 0 r p m 离心3 。5 m i n ，去除上清液。细胞计数，按照1x 1 0 5 1 1 0 6 个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。 3 1 6 细胞冻存 依照传代的方法用0 2 5 胰酶细胞消化液对处于对数生长期的细 胞进行消化。收集消化细胞于离心管中，1 0 0 0 r p m 离一1 , 5 m i n ，弃上清 液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5 1 0 6 1 x1 0 7 个m l 。每个冻存管分装细胞悬液l m l ，旋紧冻存管的盖，并用蜡 膜封严。在冻存管上标明细胞名称、冻存时间等。将冻存管置于如下 条件下逐渐加以冻存：4 。c ，1 h 一2 0 。c ，2 h 一8 0 c ，2 h 一液氮。 3 1 7 细胞的计数 用7 5 酒精棉球清洁计数板和盖玻片，用吸水纸轻轻擦干，用1 0 物镜观察计数板四角大方格，调节焦距使视野清晰后，将盖玻片盖 在计数板两槽中间。0 2 5 胰酶细胞消化液消化细胞，制成单细胞悬 液。用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量悬液滴加在计数板上盖玻片 一侧边沿。在显微镜下，用1 0x 物镜观察计数板四角大方格中的细胞 数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。计算方 法：细胞数毫升原液= ( 4 大格细胞数之和4 ) 1 0 4 x 稀释倍数。 3 2电化学发光免疫法实验 3 2 1标本制备：分别取已培养人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细 胞m r c 5 - - - 天的培养液各5 m l ，3 0 0 0 r p m 离一t 二, 5 m i n ，取上清液，置8 0 度 冰箱待测。 3 2 2实验试剂：罗氏c o b a se4 11 电化学发光全自动免疫分析仪专 业试剂，包括癌胚抗原定量测定试剂盒( 电化学发光法) 、糖类抗原 1 2 5 定量测定试剂盒( 电化学发光法) ； 3 2 3 实验方法：采用电化学发光免疫法( e c l i a ) ，严格按照仪器及 试剂说明书，用r o c h e 公司的罗氏c o b a se4 11 全自动电化学发光免 疫分析仪对c e a 、c a l 2 5 进行检测。 ， 3 2 3 检测标准：根据正常人群测定及试剂盒推荐的正常值，分别将 2 种肿瘤标记物的正常参考值定为：c e ao 3 4 0 n g l ，c a l 2 50 - 3 5u m l 超过上限即认为有临床意义。 3 3 免疫组化实验 3 3 1实验试剂 兔抗人s t a t 3 多克隆抗体、兔抗人c e a 多克隆抗体、兔抗人c a 1 2 5 多克隆抗体、免疫组化p v 试剂盒、d a b 显色剂、苏木素染液、 4 的多聚甲醛、0 5 t r i t o nx 1 0 0 、p b s 、二甲苯、无水乙醇、9 5 乙醇，8 5 乙醇、7 5 乙醇、中性树胶等。 置于6 孔板中，按2 l o m j 的细胞密度 分别将人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺细胞m r c 5 接种于盖玻片上 进行细胞爬片，5 天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 ( 2 ) p b s 清洗标本3 次，每次5 m i n 。 ( 3 ) 4 的多聚甲醛固定2 0 m i n ； ( 4 ) 空气干燥5 m i n 。 ( 5 ) p b s 清洗标本3 次，每次5 m i n 。 ( 6 ) 0 5 t r i t o nx 1 0 0 ( d p b s 配) 孵育1 次2 0m i n 。 ( 7 ) p b s 清洗标本3 次，每次5 m i n 。 ( 8 ) 3 h 2 0 2 去离子水孵育1 0 m i n ，阻断内源性过氧化物酶。p b s 清 洗标本3 次，每次5 m i n 。 ( 9 ) 滴加一抗( 兔抗人s t a t 3 多克隆抗体的稀释度为1 ：1 0 0 ；兔抗人 c e a 多克隆抗体稀释度为1 ：2 0 0 ；、兔抗人c a l 2 5 多克隆抗体稀释度 为1 ：2 0 0 ) ，用p b s 代替一抗作为阴性对照，4 。c 冰箱过夜，p b s 清洗标 本4 次，每次5m i n 。 ( 1 0 ) 二抗工作液p v 6 0 0 1 ( 湿盒) 孵育3 7 c3 0m i n ，p b s 清洗标本 4 7 x ，每次5m i n 。 ( 1 1 ) d a b 显色( 避光，镜下观察至棕色) 约2 m i n 。 ( 1 2 ) 蒸馏水或自来水充分冲洗。 ( 1 3 ) 苏木素复染1 0 m i n ，o 1 稀盐酸分化，p b s 冲洗返蓝。 ( 1 4 ) 梯度酒精脱水7 5 ，8 5 ，9 5 ，1 0 0 各5 m i n 。 ( 1 5 ) 二甲苯透明2 次，每次3 m i n 。 ( 1 6 ) 中性树胶封片。 3 3 3注意事项： ( 1 ) 抗体稀释应遵循“现用现配 的原则；滴加抗体应完全覆盖整个 盖玻片，避免引起边缘效应；孵育时6 孔板应放置水平，否则会导致 抗体流失。 ( 2 ) 抗体孵育切片后冲洗要充分。 ( 3 ) d a b 显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。 3 3 4 免疫组化结果判断 选定阳性细胞的标准：细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表 达，染色对比度好、背景清晰、定位准确；在o l i m p u sb x 6 0 光学显微 镜1 0 0 倍视野下观察整张切片的染色表达情况，在表达阳性切片中每 个切片随机选择5 个阳性染色区域，在2 0 0 倍视野下，在统一光源、光 圈、亮度、对比度、色彩饱和度及关闭白平衡条件下拍摄照片；将数 码照片输入计算机，运用i p p 6 0 图像分析软件测定每张照片的m o d 值，取每张切片的5 个视野所测得m o d 值的平均值进行比较分析。 m o d 值代表染色强度，可较为准确的反映阳性产物表达的相对浓度， 并且有较好的重复性，因此本实验采取m o d 作为定量分析的检查指 标。 3 4 荧光定量p c r 实验 3 4 1实验前的准备 经超纯水处理系统纯化后，按1 0 0 0 ： 1 的体积比加入焦碳酸二乙酯( d e p c ) ，混匀后，闭光室温放置过夜， 1 2 1 高温高压消毒3 0 分钟备用。 ( 2 ) 将移液枪头( 1pl ，2 0 0ul ，l m l ) 、离心管、e p 管等塑料物品放 入烧杯中，倒入0 1 的d e p c 水，所有部分均浸泡在d e p c 水中，室 温下过夜( 以除去r n a 酶) ，分别用移液枪头盒或消毒饭盒包装后置于 恒温干燥箱中以6 0 7 0 。c 烘干，1 2 1 高温高压消毒3 0 分钟备用。 ( 3 ) 镊子等金属制品先洗干净，浸泡在0 1 的d e p c 水中，室温下 放置过夜，1 2 1 高温高压消毒3 0 分钟备用。 ( 4 ) 整个提取过程要在无r n a 酶环境中进行，防止r n a 酶污染。 3 4 2实验试剂 p b s 、细胞裂解液t f i z o l 、氯仿、无水乙醇、总r n a 提取试剂盒、 2 0 0 8b i o b r kr tk i t 、t a k a r ar n ap c r k i t ( a m y ) v e r 3 0 、s t a t 3 引物、c e a 引物、c a l 2 5 引物、g a p d h 引物 3 4 3 细胞总r n a 的提取 ( 1 ) 分别将融合生长达8 0 左右的人肺腺癌细胞a 5 4 9 和正常人胚肺 细胞m r c 5 在实验前2 4 h 更换新鲜培养液。 ( 2 ) p b s 清洗细胞2 次，每1 0 e m 2 面积加入加1m l 裂解液t r i z o l ，用 取样器抽打几次。在1 5 3 0 放置5 m i n ，使得核酸蛋白复合物完全分 离。 ( 3 ) 将匀浆液转入1 5 m l 无r n a s e 的e p 管中，4 。c ，1 2 0 0 0 r p m 离一心5 m i n ， 取上清，转入一个新的无r n a s e 的e p 管中。 ( 4 ) 加入2 0 0ul 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡1 5 s e c ，室温放置3 m i n 。 ( 5 ) 4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离一t 二, 1 0 m i n ，样品分成三层：黄色的有机相，中 间层和无色的水相，r n a 主要在水相中，吸取上层水相至一新的e p 中。 ( 6 ) 缓慢加入0 5 倍体积无水乙醇，混匀，将样品转入吸附柱c r 3 中， 4 0 c ，1 2 0 0 0 r p m 离- t , 3 0 秒，若一次不能将全部样品加入吸附柱c r 3 ， 可分两次转入吸附柱c i 妈中。4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离一1 二, 3 0 秒，弃掉收集管 中的废液。 ( 7 ) 向吸附柱c v , 3 力l a 5 0 0pl 去蛋白液r d ，40 c ，1 2 0 0 0 r p m 离一1 二, 3 0 秒，弃废液。 ( 8 ) 向吸附柱c r 3 中加入7 0 0ul 漂洗液r w ，室温静置2 分钟，4 c ， 12 0 0 0 r p m 离，1 二, 3 0 秒，弃废液。 ( 9 ) 向吸附柱c r 3 中加入5 0 0 l al 漂洗液r w ，室温静置2 分钟，40 c ， 1 2 0 0 0 r p m 离一t 二, 3 0 秒，去除残余液体。 ( 1 0 ) 将吸附柱放，n 2 m l 收集管中，4 0 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟，去除 残余液体。置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。 ( 11 ) 将吸附柱c r 3 转入一个新的离心管中，加入3 0 1 0 0l alr n a s e f r e ed d h 2 0 室温静置2 分钟，4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟即获得总r n a 。 ( 1 2 ) 立即置于8 0 冰箱中保存备用，或立即用于逆转录。 3 4 4r n a 样本的定量分析 取提取的r n a 样本1ul ，于微量核酸定量仪上读取r n a 样本浓度 以及o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值，比值在1 8 _ 1 之间才能用于后续实验。 白量太大，该样本需重新提取一次。 3 4 5c d n a 的合成：按照逆转录试剂盒说明书进行操作按次序分别加 入下列试剂： 试剂使用量 r n a s ef r e eh 2 0 5 r t b u f f e r d n t pm i x t u r e ( e a c h10 r a m ) s u p e r - r i i 汀e n h a n c e r r a n d o mp r i m e r t o t a lr n a r e v e r s et r aa c e t o t a lv o l u m e 2 0ul 在t c 512 梯度p c r 仪上设定3 0 。c10 m i n 一4 2 2 0m i n - - - 9 9 5 m i n 一4 c5 m i n 并将标本放入t c 51 2 梯度p c r 仪中按照设定的程序 运行，完成后取出标本瞬间离心。得到i a 的逆转录产物互补d n a ( c d n a ) ，合成好的c d n a 置于一2 0 。c 冰箱保存，备用于荧光定量p c r 实验。 3 4 6 荧光定量p c r 弓 物设计与合成 荧光定量p c r i j i 物应用生物信息学手段和a b i 公司p r i m e re x p r e s s 3 0 软件进行引物设计，由上海生工生物工程有限公司合成引物。引 物设计原则：a 引物溶解温度t m 在5 8 6 0 ，且上下游引物t m 间差 异在2 c 之内；b 引物长度在1 5 3 0 b p ，最适长度2 0 b p ；c g + c 含量 在3 0 8 0 ；d 避免单个核苷的重复出现，特别序列不能有连续4 个 以上g ；e 5 端的最后5 个碱基中g + c 不超过2 个；f 扩增产物片 2 n 机 m m 眦 兰 州 墨i 段理想大小在5 0 1 5 0 b p 间；g 引物跨外显子( 或分别处于两个外显子) 以避免基因组d n a 的错误扩增。 程序：g e n b a n k 中查阅i 氓n a 序列一a b i 公司p r i m e re x p r e s s3 0 软件设 计引物，并检验其二级结构- - - n c b i 网上b l a s t 程序验证引物的特异性 一交专业公司合成。本课题设计的各基因引物序列，见表1 。 表ls t a t 3 、c e a 、c a l 2 5 、g a p d h 弓i 物序列 t a b l e1 s t a t 3 ，c e a ，c a l2 5 ，g a p d hp r i m e rs e q u e n c e 3 4 7 反应体系和扩增参数 ( 1 ) 参照试剂盒说明书建立利用s y b rg r e e ni 荧光定量p c r 反应体 系如下( 见表2 ) 表2荧光定量p c r 反应体系 t a b l e2r e a lt i m ep c rr e a c t i o ns y s t e m 反应物使用量( u1 ) 2 m i x ( 包括t a q 酶、d n t p 、m g + 、s y b r g r e e ni 等) 1 2 5ul 上游引物1 0ul 下游引物 1 0 | ll c d n a 2 ol il d d h 2 0 8 5pl 总体积2 5u1 ( 2 ) 反应条件： 2 l 1 循环 9 5 预变性2 m i n 4 0 循环 9 5 变性5 s ( p c r 扩增) 5 9 5 退火2 0 s 7 2 延伸1 5 s 在循环第二步采集荧光，扩增结束后进行溶解曲线分析：6 5 3 0 s ，+ o 5 循环& 实时荧光检测，6 0 循环。 3 4 8荧光定量p c r 产物鉴定及扩增效率验证 实验步骤中增加熔解曲线分析，分析产物峰是否为单峰。应用上 述制备的标准品进行荧光定量p c r ，按荧光定量p c r 仪定量测定程序 绘制标准曲线，用b i o r a di q 5 分析软件对标准曲线、扩增效率进行 分析计算。 3 4 9选择数据分析方式 本试验采用相对定量法检验基因的表达变化。相对定量法有两 种：相对标准曲线定量法和c t 值比较法，本实验采用c t 值比较法。 按照下列公式计算样本中s t a t 3m r n a 、c e am r n a 、c a l 2 5 m r n a 的相对表达量 a c t = - 目的基因c t 值一内参基因c t 值 a a c t = a c t - ( 随机阴性对照样品c t 值一该样品内参c t 值) 目的基因的相对总量为2 q c t 值( t h r e s h o l dc y c l e ) 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数，c t 值与s t a t 3m r n a 、c e am r n a 、c a l 2 5 m r n a 的表达水平呈负相关，即c t 值增加，表示s t a t 3m r n a 、c e a m r n a 、c a l 2 5m r n a 水平下降。 4统计学分析 采用s p s s16 0 统计学软件对