（作物遗传育种专业论文）甘蓝型油菜ssr指纹库的构建及小孢子培养改良自交不亲和系.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 鹄 如需保密，解密时间2 0 0 9 年0 7 月1 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 碱雌各嘶 帅。眇7 “鹏目 ：j 学位论文使用授权书 学位论文作者签名：豆忒华 导师签名：孑劾z 签名日期：2 7 年z 月z 妇 签名日期： 幽7 年多月矿日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略词表v 1 文献综述1 1 1 品种鉴定技术研究进展1 1 1 1 形态标记2 1 1 - 2 细胞学标记技术2 1 1 3 指纹图谱技术2 1 1 3 1 生化指纹图谱3 1 1 3 1 1 贮藏蛋白指纹图谱3 1 1 3 1 2 同工酶指纹图谱3 1 1 3 2d n a 指纹图谱4 1 1 3 2 1 限制性片段长度多态性( r f l p ) 4 1 1 3 2 2 随机扩增片段长度多态性( r a p d ) 2 1 1 3 2 3 扩增片段长度多态性( a f l p ) 2 1 1 3 2 4 简单重复序列( s s r ) 6 1 2 甘蓝型菜遗传图谱7 1 3 本研究的目的、意义及研究内容8 2 材料和方法9 2 1 材料及其来源9 2 2 实验方法1 1 2 2 1 样品准备1 1 2 2 2d n a 提取1 2 2 2 3s s r 检测1 2 2 2 4 数据处理1 3 2 2 5 利用形态学分析品种纯度1 3 2 2 6 利用s s r 标记分析品种纯度1 3 3 结果分析1 4 3 1s s r 引物筛选1 4 3 22 0 0 5 。2 0 0 6 年度国家区试参试材料的s s r 指纹1 6 3 3 核心引物的初步确定1 6 3 42 0 0 6 2 0 0 7 年度国家区试参试材料的s s r 指纹1 7 3 52 0 0 5 - 2 0 0 6 年度与2 0 0 6 2 0 0 7 年度参试材料s s r 指纹的整合1 8 3 6 材料的纯度分析1 8 4 讨论2 0 4 1 国家区试新材料s s r 指纹图谱的构建2 0 4 2 核心引物的确定2 1 4 3 材料纯度分析2 l 4 4 全国区试新材料s s r 指纹库的应用前景2 2 1 文献综述2 4 1 1 小孢子培养2 4 1 1 1 小孢子培养技术的发展2 4 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢子培养改良白交不亲和系 1 1 2 小孢子培养技术在油菜遗传育种中的应用2 4 1 2 芸薹属自交不亲和研究进展2 5 1 2 1 自交不亲和性的遗传机制2 6 1 2 2 自交不亲和的鉴定方法研究进展2 6 l - 3 杂种优势预测研究进展2 8 1 3 1 配合力法2 8 1 3 2 亲缘关系法2 8 1 3 3 分子标记遗传距离法2 9 1 4 本研究的目的、意义及研究内容2 9 2 材料和方法3 0 2 1 实验材料3 0 2 1 1 研究材料3 0 2 1 2 各培养基成分3 0 2 2 实验方法3 0 2 2 1 小孢子培养方法3 0 2 2 2 再生苗的继代培养3 1 2 2 3 再生苗的移栽与田间管理3 l 2 2 4d h 单株的亲和性调查与繁殖3 l 2 2 5 品质分析3 l 2 2 6 一般配合力测定3 l 2 2 7 自交不亲和系的性状调查3 2 2 2 8d h 系亲和性调查3 2 2 2 9 利用分子标记评价d h 系的遗传变异3 2 3 结果分析3 4 3 1 小孢子培养及再生植株继代培养、移栽和田间管理3 4 3 2 小孢子再生植株亲和性调查结果3 4 3 3 品质分析结果3 5 3 4 部分自交不亲和d h 系的配合力分析3 8 3 4 1 组合及亲本的农艺性状3 8 3 4 2 配合力分析4 0 3 5 其它自交不亲和d h 系的性状表现4 l 3 6s s r 检测d h 系的变异4 2 4 讨论4 3 4 1 小孢子培养在选育自交不亲和d h 系优点4 5 4 2 对获得自交不亲和d h 系的评价4 6 参考文献4 8 致谢5 6 附录5 7 图版5 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 油菜是我国最主要的油料作物之一，目前我国杂交油菜种植面积已占油菜总面 积的5 0 以上。随着育种进程的加快，品种数量急剧增加，利用形态学标记进行品 种鉴定愈来愈困难，迫切需要建立一套可靠、快速、简便、高效的品种鉴定体系。 油菜自交不亲和性是杂种优势利用的重要途径之一，对自交不亲和系进行遗传改良 非常必要。本研究开展了两个方面的工作：一是利用s s r 标记技术构建甘蓝型油菜 的s s r 指纹库；二是利用小孢子培养改良自交不亲和系s 1 1 3 0 0 。研究的主要结果 如下： 1 利用9 5 对引物分析参加2 0 0 5 2 0 0 6 年国家区试的1 0 4 个材料，有4 6 对引物扩 增清晰、多态性好，共扩增出1 8 2 个带型，其中1 7 2 个为多态性带，多态性比 例达9 5 3 。 2 4 6 对引物能够区分1 0 4 份材料，聚类结果表明：相同育种单位的材料遗传距离 近、不同地区或育种单位的材料遗传差异较大。说明这4 6 对s s r 引物适合构建 指纹图谱。初步构建了包含1 0 4 个材料的甘蓝型油菜s s r 指纹库。 3 根据各引物扩增带型的清晰程度结合考虑p i c 值，初步确立了9 对s s r 引物作 为构建指纹库的核心引物。 4 利用上述4 6 对s s r 引物构建了参加2 0 0 6 2 0 0 7 年国家冬油菜区试8 8 个材料的 指纹，并与1 0 4 个材料的指纹进行了整合。聚类分析结果表明：4 6 对s s r 引物 能够区分所有的材料。 5 随机挑选一个材料，分别用形态学和s s r 标记进行纯度分析，结果表明利用s s r 标记技术更为准确、快速。 6 对s 1 1 3 0 0 与s 1 1 3 0 0 x 0 4 p 6 3 外1 6 ( s 1 1 3 0 0 的恢复系，双低) 、丙4 0 9 ( s 1 1 3 0 0 保 持系，双低) 杂交得到的0 5 9 1 5 1 5 、0 5 9 1 5 0 7 ( 均为f l 单株) 进行小孢子培 养，分别获得5 5 0 、2 0 2 个胚，分别有4 6 8 、1 4 5 个胚再生成苗，成苗率分别为 8 5 1 、7 9 7 。 7 盛花期进行倍性调查，两材料分别有2 8 2 、8 4 个d h 系加倍成功。花期套袋隔 离自交调查亲和性，结果分别有1 4 、9 4 个d h 系为自交不亲和d h 系。 8 分析自交不亲和d h 系的品质，0 5 9 1 5 1 5 产生的d h 系中有5 3 个为双低自交不 亲和系，0 5 9 1 5 0 7 仅有5 个。两材料均没有出现含油量较高的材料。 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢子培养改良自交不亲和系 9 对6 个自交不亲和d h 系及s 1 1 3 0 0 进行4 个产量相关性状的般配合力测定， 有1 个材料各性状的一般配合力优于s 1 1 3 0 0 ，并且在每个性状上均出现了优于 中油杂2 号( c k ) 的杂交组合。 1 0 在自由授粉条件下考察两个材料产生自交不亲和d h 系的4 个农艺性状，在各 性状上均有显著高于s 1 1 3 0 0 的d h 系。 1 1 利用2 4 对s s r 引物分析d h 系的变异，进一步证明了上述自交不亲和系与 s 1 1 3 0 0 在遗传上的差异。 关键词：油菜；s s r ；区域试验；指纹库；小孢子培养；双单倍体；自交不亲和 华中农业大学2 0 0 7 届硕：卜学位论文 a b s t r a c t r a p e s e e di so n eo ft h em o s ti m p o r t a n to i l s e e dc r o p si nc h i n a n o wt h ep r o p o r t i o no f h y b r i d sp l a n t i n g a r e a sw a sa b o v e5 0 i ti sd i f f i c u l tt o s e p a r a t e t h ev a r i e t i e sb y p h e n o t y p eb e c a u s eo ft h ei n c r e a s i n gl a r g en u m b e r so fv a r i e t i e s s e l f - i n c o m p a t i b l i t y ( s i ) i so n eo ft h em a i nw a y st oe x p l o i th e t e i o s i s t h ei m p r o v e m e n to fs i130 0h a sg r e a t s i g n i f i c a n c e i nt h i sr e s e a r c h ，f i r s t l y ，w ee s t a b l i s h e ds s rf i n g e r p r i n t i n gd a t a b a s eo f b r a s s i c an a p u sl s e c o n d l y , w ei m p r o v e dt h es i13 0 0b ym i c r o s p o r ec u l t u r e t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 9 5s s r p r i m e rp a i r sw e r ee m p l o y e dt of i n g e r p r i n t1 0 4m a t e r i a l sb e i n gs u b j e c t e dt o n a t i o n a lo f f i c i a lf i e l dt e s t 4 6p r i m e rp a i r sw h i c hg i v ep o l y m o r p h i c ，s t a b l ea n d r e p e a t e da m p l i f i c a t i o np r o f i l e sw a ss e l e c t e dt of i n g e r p r i n ta l lo ft h em a t e r i a l s 2 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：a l l10 4m a t e r i a l sw e r ed i s t i n g u i s h e dw i t hs e v e r a lp r i m e r s c o m b i n a t i o nw h i l et h a tc o u l dn o td ow i t hs i n g l ep r i m e r 3 4 6s s rp r i m e r ss c r e e n e dw e r ea n a l y s e d ，f i n a l l y9c o r ep r i m e rp a i r sf i t t i n gf o r e s t a b l i s h i n gr a p e s e e dd n af i n g e r p r i n t i n gw e r ee s t a b l i s h e d 4 4 6s s r p r i m e r sw e r ee m p l o y e dt of i n g e r p r i n t8 8m a t e r i a l sa n dt h er e s u l t ss h o w e d t h a ta l lt h e19 2m a t e r i a l sw e r ed i s t i n g u i s h e d 5 t h ep u r i t ya n a l y s i so fr a n d o ms a m p l ep r o v e dt h a ts s rc a nb eu s e di ni d e n t i f y i n g t h ep u r i t ya n dr e a l i t yo fr a p e s e e dh y b r i d sq u i c k l ya n dp r e c i s e l y ； 6 w i t hi s o l a t e dm i c r o s p o r ec u l t u r e ，w eg a i n e d5 5 0 ，2 0 2a m b r y o i d sr e s p e c t i v e l y f r o m 0 5 9 1 5 1 5 、0 5 - 9 1 5 0 7 ( f i ) u s i n gm i c r o s p o r ec u l t u r e ，( t h ef r e q u e n c yw e r e 8 5 1 、7 9 7 r e s p e c t i v e l y ) 7 14 、10 7d hl i n e sw e r es e l f - i n c o m p a t i b i l i t yl i n e sr e s p e c t i v e l y 8 1 1 1 eq u a l i t yo fd hl i n e sw e r ea n a l y s e d s o m eo ft h ed hl i n e sp r o v i d e dw i t hd o u b l e l o w q u a l i t y 9 4m a i na g r o n o m i cc h a r a c t e r so ft h ep a r e n t sa n df ih y b r i d sw e r ea n a l y s e d m e a s u r i n gt h eg c a o fs i xs e l f - i n c o m p a t i b i l i t yd hl i n e s ，o n l y1d hl i n ee x c e l l e d s 1 1 3 0 0 1o i nf r e e d o mp o l l i n a t i o nc o n d i t i o n s ，c o m p a r e dt os i13 0 0d hl i n e s ，t h e4m a i n i i i 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢了培养改良自交不亲和系 a g r o n o m i cc h a r a c t e r so ft h es e l f i n c o m p a t i b i l i t yd h l i n e sf r o mt h et w om a t e r i a l s w e r en o t a b l yh i g h e r 11 s s rp r i m e r sw e r ee m p l o y e dt oa n a l y s i st h es e l f - i n c o m p a t i b i l i t yd hl i n e s t h e r e s u l ts h o w e dt h a t ：t h eg e n e t i cv a r i a n c eo c c u r e db e t w e e nd hl i n e sa n ds i130 0 k e yw o r d s ：r a p e s e e d ；s s r ；o f f i c i a lf i e l dt e s t ；d n af i n g e r p r i n t i n g ；m i c r o s p o r ec u l t u r e ； d h ；s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y i v 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 v 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章国家油菜区试新材料s s r 指纹图谱库的构建 1 文献综述 油菜是最主要的油料作物之一，在世界范围内被广泛种植。中国是世界上最大 的油菜生产国，其种植总面积和产量均约占世界的3 0 左右( 刘文冰，2 0 0 5 ) 。另 外，我国也是一个大面积推广杂交油菜的国家，杂交油菜种植面积已占油菜总面积 的5 0 以上。 杂种优势利用是提高油菜产量的最主要的途径，对油菜产业具有举足轻重的作 用。1 9 8 5 年陕西农垦中心育成国际上第一个油菜杂交种“秦油二号”，并大面积应用， 标志着国际杂交油菜进入了实用化阶段，杂交油菜品种逐年增加( 李殿荣，2 0 0 3 ) 。 预计在未来3 5 年内，我国油菜杂交品种种植面积可能要占总面积的6 0 7 0 ，杂交 品种在油菜生产中的作用将越来越重要。近几年来，随着育种进程的加快，育成新 品种的速度大大提高，而某些育种者急功近利，只是集中利用有限的几个骨干系配 杂交种，其结果必然导致：一方面，使得利用形态特征、生理特征、同功酶、种子 贮藏蛋白进行品种鉴定愈来愈困难，给品种保护和品种审定带来困难。另一方面， 少数骨干系的杂种优势潜力难以被继续挖掘，品种产量水平很难有较大的提高。另 外，忽视其它自交系的育种潜力的做法，将造成遗传资源的浪费，携带优良基因的 材料难以得到有效的保护。 1 1 品种鉴定技术研究进展 随着现代育种技术的不断进步，使油菜品种的选育和推广速度加快，大量品种 的被审定和推广。然而目前人们往往集中少数优良品系选育品种，使选育出的新品 种差异越来越小，使形态学进行品种鉴定越来越不准确。由于油菜杂交种具有较高 的科技含量和商业价值，某些种子生产和经营者唯利是图，以劣质种子冒充优质种 子或窃取他人的材料进行种子生产，严重损害其他种子生产者和消费者的利益，甚 至给国家带来巨大损失。在当前油菜品种数量众多并且差异较小的情况下，建立一 种准确、可靠的品种鉴定方法，对维护种子生产经营单位品种产权和经济利益具有 重要意义。目前，品种鉴定的方法主要有：形态学鉴定、细胞学鉴定及指纹鉴定。 下面就三种方法应用的标记进行综述。 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢子培养改良自交不亲和系 1 1 1 形态标记 形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 是指那些能够明确显示遗传多态性的外观 性状，如花色、花型、株高、叶形、叶质等的相对差异；还包括那些借助简单测试 即可识别的某些性状，如千粒重、抗病性等等。利用形态标记进行品种鉴定的方法 简单、方便、直观，是生产上使用最广的方法之一( 张光恒等，1 9 9 9 ；吴新杰等，2 0 0 5 ) 。 但是，形态标记是基因与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果，受环境影响 较大，容易给鉴定结果造成偏差。另外，形态学鉴定的结果还与鉴定者的经验、水 平有关，鉴定的结果受鉴定者的偏好影响较大。最主要的是，随着杂交品种种的急 剧增多和少数骨干亲本的利用，形态标记的数量已不能满足品种鉴定需要，利用形 态标记进行品种的特异性、一致性和稳定性( 即d u s ) 测试将越来越困难( t o m m a s i n i e ta 1 2 0 0 3 ) 。 1 1 2 细胞学标记技术 细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征， 常见的细胞学标记主要是染色体的结构特征和形态特征。染色体形态特征主要包括 染色体的绝对大小和相对大小值、着丝点和次缢痕以及随体的数目和位置等特征。 染色体结构特征包括染色体的核型和带型。 就目前植物染色体研究现况来看，由于染色体制片技术和分辨率的限制，能观 察到的染色体数目、结构的变异十分有限，对于植物外观形态相似的品种或种群在 细胞学水平上难以分辨。随着植物染色体制片技术的日益成熟，各种分带技术，染 色体原位杂交技术等的发展和应用，细胞学方法可能在将来可能会成为品种鉴定的 一种有效途径。 1 1 3 指纹图谱技术 电泳图谱的多态性丰富，并且具有高度的个体特异性和环境稳定性，就象人的指 纹一样，因而被称为指纹图谱( f i n g e r p r i n t i n gm a p ) 。目前，在品种鉴定中应用较多 的指纹图谱主要有两种类型：一类是较早开始研究的生化指纹图谱；另一类是上世 纪9 0 年代开始研究的d n a 指纹图谱。 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 1 3 1 生化指纹图谱 生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 是指植物代谢过程中产生的具有特殊意义的生 化成分或产物的特征。目前植物生化指纹图谱主要是指蛋白质电泳指纹图谱，因为蛋 白质的组成由遗传决定，其组分上的差异可以反映出基因型的不同，因而可作为品种 的“生化指纹”。蛋白质电泳由于操作简便快速，而且分辨率相对较高、重复性强， 目前在遗传多样性检测方面仍然被广泛采用( 孙建萍，林红2 0 0 5 ) ，它主要包括同工 酶和贮藏蛋白( 可分为醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白、球蛋白等) 。 1 1 3 1 1 贮藏蛋白指纹图谱 种子贮藏蛋白在品种鉴定中已经被广泛应用。w a l l ( 1 9 8 6 ) 利用等电聚焦聚丙烯 酰胺凝胶电泳法i e f p a g e 对不同玉米品种进行鉴定，证明了双亲和杂交种的z e i n 蛋 白有很大差异，杂交种蛋白中包含有双亲的蛋白。目前，美国、加拿大、法国等国家 已将这一技术应用于品种鉴定和种子纯度检验对部分小麦品种构建了淳溶蛋白指纹 图谱数据库。在国内2 0 0 1 年我国把玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法作为中 华人民共和国农业行业标准之后，盐溶蛋白电泳技术广泛用于玉米的纯度鉴定( 聂琼 等，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 1 2 同工酶指纹图谱 自1 9 5 9 年m a r k e t 和m o i l e r 首次提出同工酶的概念以来，同工酶研究得到了迅速发 展( g o o k e ，1 9 9 5 ) 。同工酶谱差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因和非等位基因 的差异造成的，酶谱是基因表达后的分子水平的表型，通过其谱带的分析能快速简 便地识别出编码这些谱带的基因位点和等位基因。由于同工酶谱带与基因位点直接 相关，而且几乎2 5 的位点具有多态性，所以这种技术已成为一种十分有效的遗传 标记方法。 从研究条件、操作技术、研究成本等诸多方面综合考虑，同工酶法是估测遗传 变异的一个好方法。近年来随着等位酶水平切片凝胶电泳技术的发展，再次给同工 酶标记以巨大的推动作用。但是同工酶标记因其数量少、稳定性差的限制，在生产 中较少应用。 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢子培养改良自交不亲和系 1 1 3 2d n a 指纹图谱 近年来，随着生物技术的不断发展，一系列d n a 分子标记技术的出现使品种 鉴定研究有了巨大的进步。d n a 分子标记( d n a m o l e c u l a rm a r k e r s ) 是在d n a 水 平上遗传多样性的直接反映，可以检测核苷酸序列的任何差异，包括单个核苷酸差 异，在数量上几乎是无限的。另外，此类标记直接以d n a 的形式表现，在植物的 各个组织、各个发育阶段均可检测，不受季节环境限制，不存在表达与否的问题， 十分适合于遗传多样性分析、种质资源研究等方面的研究。 目前，已经建立并在实际研究中得到应用的d n a 指纹图谱技术主要有：一、 基于d n a d n a 杂交的d n a 标记，如i 玎l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 。二、基于p c r 的d n a 标记，如r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ) 、s t s ( s e q u e n c e m g g e ds i t e ) 、s r a p ( s e q u e n c e r e l a t e da m p l i f i e d p o l y m o r p h i s m ) 、s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 、s s c p ( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m s ) 、s s r ( s i n g l es e q u e n c er e p e a t s ) 等。 三、基于p c r 与限制性内切酶技术结合的d n a 标记，如a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 、c a p s ( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ) 等。四、 基于单核苷酸多态性的d n a 标记，如s n p 等。其中最常用的有r f l p 、r a p d 、s s r 、 a f i ，p 、s r a p 。 1 1 3 2 1 限制性片段长度多态性( r f l p ) r f l p 是g r o d z i c k e r 等于1 9 7 4 年发明的分子标记技术，是最早发展起来的分子标 记。自从b o s t e i n 等( 1 9 8 0 ) 年利用r f l p 构建人类遗传连锁图，奠定分子标记技术研 究的基础以来，植物和动物的分子标记技术及其应用研究取得了令人瞩目的进展。 r f l p 的基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组d n a 后，与同位素或非同 位素标记的探针杂交，从而显示与探针含同源序列的酶切片段在长度上的差异。 r f l p 的探针来源主要是随机的基因组( g d n a ) 克隆矛i c d n a 克隆，其中c d n a 探针 的保守性比较强，许多同科物种的c d n a 探针都可以作为通用探针，对研究物种起源 和演化十分有利，缺点是多态性频率较低，且需要的d n a 量较大，检测方法较为繁 琐，周期长，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信息有限。r u s s e l l 等( 1 9 9 7 ) 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 利用r f l p 、a f l p 、s s r 、r a p d4 种标记方法检测大麦品种的遗传变异发现，利用 r f l p 标记检测到的遗传多样性指数最低，仅为0 3 2 2 。随着p c r 技术的发明，该技术 在指纹图谱绘制上越显不足，逐渐被新兴的分子标记淘汰。 1 1 3 2 2 随机扩增片段长度多态性( r a p d ) r a p d 是1 9 9 0 年由美国杜邦公司的w i l l i a m s 和加利福尼亚生物研究所的w e l s h 等 发明的分子标记技术，它利用一个随机序列的寡核苷酸作引物，通常为1 0 个核苷酸， 以基因组d n a 作模板进行p c r 扩增反应，产生不连续的d n a 片段，经琼脂糖凝胶电 泳来检澳u d n a 片段的多态性( 王忠华，2 0 0 6 ) 。r a p d 弓j 物是1 个1 0b p 的随机引物， 每种随机引物扩增的一条谱带代表了被扩增基因组中的一个遗传位点。r a p d 技术 是在没有任何基因组序列信息的情况下进行指纹图谱的构建及遗传多样性分析最为 快捷、简便的方法( m c g r e g o re ta l ，2 0 0 0 ) 。另外，该标记具有检测灵敏、多态性强 ( 可以检测出r f l p 标记不能检测的重复顺序区，填补r f l p 图潜的空缺) 、无放射性 等优点，在各种作物中已被广泛应用于品种鉴别研究( g o l e m b i e w s k ie ta l ，1 9 9 7 ) 。 但是，r a p d 标记稳定性差，结果不可靠，限制了其在指纹图谱绘制中的应用 ( m c g r e g o re ta l ，2 0 0 0 ) 。另外，该标记为显性标记，不能有效鉴别杂合子，不能用 于品种的纯度鉴定。 1 1 3 2 3 扩增片段长度多态性( a f l p ) a f l p 是z e b e a u 等( 1 9 9 3 ) 发明的一项专利技术，其原理是基于p c r 技术扩增基 因组d n a 限制性片段，扩增片段的数目取决于采用的内切酶种类、选择性碱基数目 以及所研究基因组的复杂程度。该技术实际上是i 强l p 和p c r 相结合的一种方法，产 生的标记数目是无限的。另外，a f l p 标记具有多态性丰富、灵敏度高、不受环境影 响、呈典型的孟德尔方式遗传等优点，被广泛应用到遗传多样性分析。m a r s a n 等人 ( 1 9 9 8 ) 利用r f l p 和a f l p 技术研究了玉米自交系的遗传多样性及其与杂种优势表 现的关系，结果认为，a f l p 技术在检测玉米骨干自交系的遗传变异和遗传关系上更 为可靠、高效。 但是，该技术对d n a 质量和内切酶的质量要求严格，基因组不完全酶切将影 响实验结果，并且操作步骤繁琐，使其在作物品种纯度及真实性鉴定中的推广应用难 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢子培养改良自交不亲和系 以实现。另外，a f l p 技术是专利技术，受专利权保护也限制了它在商业及生产上 的应用。 1 1 3 2 4 简单重复序列( s s r ) 在人类及动植物的基因组中，广泛分布着许多由1 5 个碱基对组成的简单重复 序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 又称为微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t e ) 。对s s r 的研究始于动物基因组，h a m a d a 等( 1 9 8 2 ) 最早发现了由二核苷酸c a g t 重复多 次构成的一段d n a 。t a u t z 和r e n z ( 1 9 8 4 ) 证明s s r 在真核生物广泛存在。 由于微卫星d n a 中的重复单位数目是高度变异的，而座位两侧一般是相对保 守的单拷贝d n a 序列，可据此设计引物，利用p c r 技术扩增s s r 序列，然后电泳 分离多态性片断。当利用一对引物扩增不同基因型中的s s r 位点时，通常可检测出 s s r 的多态性称为简单重复序列多态性( s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简 称s s l p ) 。每一扩增片段代表了这一位点上的一个等位基因。其分布频率：平均每 2 3 3k b 有一个s s r ，而每6 2k b 有一a t t a 类型s s r ，单子叶与双子叶植物的s s r 也有差异。所有的单核苷酸及双核苷酸重复类型s s r 均位于非编码区，而5 7 左右 的三核苷酸重复位于编码区。s s r 不仅存在于核d n a 中，在细胞质d n a 中也有分 布，但数量极少( 李汝玉，1 9 9 9 ) 。s s r 序列多态性的出现是由于同一物种中不同 基因型的寡核苷酸重复次数不同以及重复序列在染色体制时的滑动或染色单体的 不等交换造成的，因此微卫星d n a 可用作分子标记。 s s r 标记是建立在p c r 技术上的第二代新型d n a 分子遗传标记，其主要特点是： 1 在真核生物全基因组中广泛分布，数量极为丰富，能代表一定的基因组特征 ( h a y d e n ，s h a r p ；2 0 0 1 ) ：2 以孟德尔方式共显性遗传，遗传信息量高于r a p d 和a f l p ( r u s s e l le ta l ，1 9 9 7 ) ；3 可检测位点的多态性高，s s r 在不同个体、不同种群之间 存在高度变异( w u 等，1 9 9 3 ；s l a v o v ，2 0 0 4 ) ；4 重复性、稳定性好；5 基于p c r 技术，操作简单；6 每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室之间交流、 共享。7 通过复合点样，在一块测序胶上能够同时分离出多个样品，节约成本。同 时，银染技术取代传统的放射性同位素标记法也使微卫星技术的应用更加简单、快 捷。另外，通过荧光染色和高分辨率毛细管电泳，并配以相应软件进行带型分析， 已经使s s r 的检测实现了自动化和数字化，便于大规模分析。 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕一l 学位论文 s s r 标记作为一种有效的基因型鉴定技术，能够产生足够多的等位多态性，已 成为育种系谱分析的有效手段。只要标记选择的体系建立起来后，很容易在育种实 践上应用，特别是在品种纯度和真伪鉴定方面有不可替代的作用。文雁成等( 2 0 0 6 ) 运用s r a p 和s s r 两种方法构建甘蓝型油菜指纹图谱，结果表明：与s r a p 标记相比， s s r 标记以其扩增谱带少、易于识别和统计，而更适合用于引物组合法构建品种指 纹图谱。雷天刚等用从1 0 0 对s s r 弓i 物中筛选出的2 对多态性高的引物构建了含1 9 个 甘蓝型黄耔品种的指纹图谱，只能区分其中5 个品种( 雷天刚等，2 0 0 5 ) 。刘平武等 ( 2 0 0 5 ) 利用1 6 个s s r 三j i 物构建包含3 9 个杂交油菜亲本的指纹图谱，也仅仅是将各 材料区分，并不是真正意义上引物组合的指纹图谱。马晓峰( 2 0 0 6 ) 从油菜选取1 9 条染色体上的1 0 0 对s s r 弓i 物，用筛选得到的2 2 对引物分析贵州省部分主要甘蓝型油 菜杂交种及其亲本，可以将各个材料区分开来，但是引物分布情况、材料的代表性 不明。 1 2 甘蓝型菜遗传图谱 高质量的遗传连锁图谱是进行基因定位、基因克隆、辅助选择、作物设计育种 的技术平台。传统的遗传连锁图谱是利用形态学和同工酶标记建立起来的，信息不 够丰富，很难在育种中得到应用。近年来，分子标记技术的迅速发展极大地促进了 遗传连锁图谱的构建。利用分子标记构建遗传图谱的理论基础是染色体的交换与重 组，两点测验和三点测验是其基本程序。 i ! i m c c o u c h 等( 1 9 8 8 ) 建立第一张水稻的r f l p 标记连锁图( 1 3 5 个标记) 以来， 各主要作物的r f l p 连锁图构建己基本完成。第一张甘蓝型油菜的分子标记连锁图由 l a n d r y ( 1 9 9 1 ) 完成。他们n w e s t e r 和t o p a s 杂交产生的f 2 群体为试材，用苗期特异 表达的c d n a 克隆为探针，构建了覆盖基因组总长1 4 1 3c m 的连锁图。该连锁图中 r f l p 标记大多分布在1 9 b 连锁群上。1 9 9 5 年，p a r k i n 等利用r f l p 标记构建了能明确 区分a 、c 基因组的甘蓝型油菜遗传图谱，其中n 1 - n 1 0 、n 1 l - n 1 9 分别是a 、c 基因 组所在的连锁群，前者与白菜的1 0 条染色体对应，而后者则与甘蓝的9 条染色体对应。 近年来，l y d i a t e 等( 2 0 0 3 ) 、l o w e 等( 2 0 0 4 ) 以及p i q u e m a l 等( 2 0 0 5 ) 将他们各自开 发的s s r 标记都定位到了该图谱上。 l o m b a r d 和d e l o u r m e ( 2 0 0 1 ) 采用同工酶、r f l p 、r a p d 、a f l p 四种标记将来 7 甘蓝型油菜s s r 指纹库的构建及小孢子培养改良自交不亲和系 自不同d h 群体的3 张遗传连锁图进行整合，整合后的连锁图包含5 4 0 个标记，其中有 2 5 3 个标记至少在2 个作图群体上是一致的，分布在1 9 个连锁群，覆盖的遗传图距为 2 4 2 9c m ，各标记位点间的平均距离仅4 5c m 。李媛嫒等人( 2 0 0 6 ) 构建了与国际上 公共图谱对应的图谱，图谱总长为2 0 5 4 5 1c m ，标记密度为3 5 3c m 个。该图谱包 含s s r 、a f l p 、s r a p 年i 功能分子标记4 种分子标记。 1 3 本研究的目的、意义及研究内容 在油菜杂交种的生产和销售中，对种子质量最主要的要求之一就是种子的纯度 和真实性。随着我国加入w t o 和市场经济体制的建立，防止伪劣种子流入市场、控 制种子质量显的尤为重要。此外，随着目前新品种数目的急剧增加，但是品种间差 异的不断缩小，仅仅利用传统的生物学性状进行新品种测验己不适应现代育种的要 求。为保护育种者的品种权和农民的利益，建立一种快速、准确的品种鉴定方法犹 为重要。 s s r 标记具有遗传稳定、信息量大、分辨率高共显性遗传及在基因组中广泛分 布等特点，本研究均匀选取甘蓝型油菜遗传图谱上的s s r 标记来反映品种的特征指 纹，构建了含有1 9 2 个全国冬油菜区试新材料的s s r 指纹库，并初步确立构建指纹库 的核心引物。对随机挑选的一个品种用形态学a n s s r 标记方法进行纯度鉴定，探讨 利用s s r 标记构建国家区试新材料的指纹库在品种纯度鉴定工作中的可行性。研究 得到的结果，一方面可以为油菜品种审定和品种保护提供依据，另一方面，可为油 菜育种研究提供丰富的信息。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 材料和方法 2 1 材料及其来源 本研究所用的材料：2 0 0 5 2 0 0 6 年度国家区试冬油菜参试材料1 0 4 份( 原始 编号由中国农科院油料所刘风兰老师提供，实验室编号为l 1 0 4 ，详细信息见表 1 1 ) ；2 0 0 6 2 0 0 7 年度国家区试冬油菜参试材料8 8 份，实验室编号为1 0 5