（内科学专业论文）小鼠多潜能成体干细胞生物学特性及向树突状细胞分化的研究.pdf

中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 中文摘要 越来越多的研究发现成体干细胞具有跨系甚至跨胚层分化的特性，即成体干细胞 具有可塑性，而对于可塑性的原因和机制，目前更多的学者认为在成体组织中可能存 在着原始的多潜能干细胞，我们命名为胚胎后亚全能干细胞。对于亚全能干细胞的分 离与鉴定不论对于基础研究还是临床应用都具有非常重要的意义和不可低估的价值。 本文的第一部分，是从小鼠胚胎成纤维细胞中成功分离出一群原始的 s c a 1 + c d l l 7 。l i n 。多潜能干细胞，对于其生物学特性进行了全面而细致的研究。发现 该细胞群表达胚胎干细胞相关的转录因子，具有朝三胚层细胞分化的能力，并且拥有 免疫调节性能。在体实验表明该细胞群能够延长异基因来源的皮肤移植物的存活时 间，皮肤烧伤实验证明其能够显著促进皮肤损伤的愈合。我们的实验为胚胎后亚全能 干细胞在体内的存在提供了进一步的支持证据，丰富了成体干细胞可塑性的基本理 论。 第二部分目的是考察s c a - l + c d l l 7 。l i n 多潜能干细胞是否能够在体外朝造血细胞 分化。使用合适的诱导条件，我们诱导s c a - l + c d l1 7 工i 1 1 分化为具有免疫调节功能的 树突状细胞，对于分化而来的树突状细胞我们详细的考察了其生物学特性。进一步发 现，这些树突状细胞通过n o t c h - j a g g e d 信号通路的调节而发挥免疫抑制的效应。提示 这类诱导的树突状细胞有可能在临床上具有治疗免疫相关性疾病的前景。 关键词：多潜能干细胞，间充质干细胞，树突状细胞，分化，j a g g e d 2 英文摘要 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 m o s to ft 1 1 ea d u l ts t e mc e l l sr 1 0 t0 1 1 l yg e n e r a t et h o s em a t u r ec e l lt ) ，p e sc o r r e s p o n d i n gt 0 t 1 1 e i “s s u eo fo r i g i n ，b u ta l s oc r o s st i s s u e ( o rg e ml a y e r ) b o u n d 撕e st 0g e n e r a t ec e l lt ) ，p e s o fd i 丘e r e n tl i n e a g e s ，w 1 1 i c hw 懿i 砌e da sa d u l ts t e mc e l lp l a s t i c i 饥h o 、e v e r ，t l l e e x p l a n a t i o n so fa d u l ts t e mc e up l a s t i c 埘r e m a i nap o i n to fd i s c u s s i o n 锄dc o n t r o v e r s y o n e 、e l la c c e p t e dp o s s i b l em e c h a n i s mf o ro b s e n ，a t i o no fa d u l ts t e mc e l lp l a s t i c i t ) rr e l a t e st ot h e a c t i o no fr a r ep l u r i p o t e n ts t e mc e l l s ( p s c s ) p r e s e n ti nt i l et e s tc e l lp o p u l a t i o n i l lt h ef i r s tp a r t ，w eh a v es u c c e e d e di ni s o l a t i n gs c a - 1 + c d117 - l i n 。埘m i t i 、，ep l u r i p o t e n t s t e mc e l l s 丘。o mm em o u s ee m b r y o i l i cf i b r o b l a s tp o p u l a i t o n t h i sc e up o p u l a t i o np o s s e s s e s t l l em a i nc h a r a c t e r i s t i c so fp r i m i t i v ep l 嘶p o t e ms t e mc e l l s ，i n c l u d i n ge x p r e s s i o no f e m b 驴m cs t e mc e l l s ( e s c s ) m 妇r a b i l 时o f g i v i n gr i s et om u l t i p l e 咖e so f t 1 1 r e eg e 珊 l a y e r sa 1 1 dp o t e n t i a lo fi m m u n o r e g u l a t i o n i nv i v os t u d i e si n d i c a t e dt l l a tn l e c e l lp o p u l a t i o n c o u l dp r o l o n gt h es u i v a lo fa l l o g e n e i cs k i i lg r a r s ，a i l ds t r i l ( i n g l yp r o m o t et 1 1 es k i nb 啪 w o u l d h e a l i n g b yd i 疏r e n t i a t i n gi n t om u l t i p l et ) ，p e so fc e l l sm m ed e m a la n de p i d e 肌a l t i s s u e s o u r 咖d yw i l lh e l pu sb e t t e r 吼d e r s t a i l dt h ep r o p e r t i e so fp l a s t i c 时a n dm a y g r e a t l yc o n t r i b u t et ot h eu s eo fs t e mc e l l s 嬲at a 】唱e tf o rc e l lt m s p l a i l t a ：t i o na n dg e n e 1 1 l es e c o n dp a r ti i l d i c a t e dt h a tt 1 1 es c a 1 + c d l l 7 。l i n p l u r i p o t e n ts t e mc e l l sc o u l db e m d u c e dt 0d i 位r e n t i a t ei n t oc d11b h 讪i a l o w c d11c 1 0 wd e n d 矾cc e l l s ( d c s ) 晰t l ls 仃o n g r e g u l a t o 巧缸l c t i o n sc 印a b l eo fs u p p r e s s i n gm i x e dl y m p h o c y t er e a c t i o n ，a l l o g e n e i cd e l a y e d t y p e - h y p e r s e n s i t i v i t ) r a 1 1 dr e j e c t i o no fa l l o g e n e i cs h ng m f t s t h ei i i 】衄u i l er e g u l a t o 巧 缸1 c t i o i l so ft l l e s ed e n d r i t i cc e l l sw e r ef o u l l dt 0b em e d i a t e db yj a g g e d - 2 o u rs t l j d i e s r e v e a l e dt h a te s c l i k ep l u r i p o t e n ts t e mc e l l se x i s ti i l 丘- e s l l l yi s o l a t e dm o u s ee n 】【b r ) r o i l i c f i b r o b l a s tp o p u l a t i o na i l dt h e yc 孤d i 髓r e n t i a t ei m od c s 晰t hs 们n gr e g u l a t o 巧矗m c t i o n s k e yw o r d sp l u r i p o t e n ts t e mc e l l s ( p s c s ) ，m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) ，d e n d r i t i c c e l l s ( d c s ) ，d i f r e r e n t i a t i o i l ，j a g g e d 3 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 缩略语表 1 2 9 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 f g f 4 f i t c f l k 1 g f a p g f p g m c s f g v h d h b s s h e h g f h s c s i f n y i g f i b m x i l 2 i l 4 i l 1 0 i l 1 2 i m d c s i t s l a b s a l p s m a c s m a d c s m a p c s p m e m h c f i b r o b l a s tg r o w t l lf a c t o r - 4 n u o r e s c e i ni s o t i l i o c y a n a t e f e t a l l i v e rb n 嬲e 1 g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n g r e e nn u o r e s c e n tp r o t e m 伊锄u l o c ”e - m a c r o p h a g e c o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r 伊a r - v e r s u s - h o s td i s e a s e h a r l l db a l a l l c e ds a l t h e m a t o x y l i n 甜l de o s i ns t a i n i n g h e p a t o c y t eg r o 、矶hf a c t o r h e m a t o p o i e t i cs t e mc e n s i n t e r f e 而y i i 投l l i n 1 i k eg r o w c l lf a c t o r 3 一i s o b u 锣l - l - m e t l l y l x a m l l i n e i n t e r l e u l ( i n 2 i n t e r l e u 虹n - 4 i n t e r l e u k i n l0 i i l t e r l e u l ( i n 12 i n u n 卸【u ：r ed e n d r i t i cc e l l s i i l s u l i n t r a i l s 矗弧证s e l e n i 啪 l i n o l e i ca c i d b o v i n es e n u na l b u m i n l i p o p o l y s a c c h 撕d e m a 印e t i ca c t i v a t e dc e l ls o r t i n g m a t u i ed e n d r i t i cc e l l s m u n i p o t e n ta d u l tp r o g e i l i t o rc e l l s p - m e r c a p t o e t h a i l o l m 句o rh i s t o c o m p a b i l i 够c o m p l e x 成纤维母细胞生长因子4 异硫氰酸荧光素 胎肝激酶一l 神经胶质酸性蛋白 绿色荧光蛋白 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 移植物抗宿主病 h a n k s 平衡盐溶液 苏木素伊红染色 肝细胞生长因子 造血干细胞 干扰素y 胰岛素样生长因子 3 异丁基1 甲基黄嘌呤 白细胞介素2 白细胞介素4 白细胞介素1 0 白细胞介素1 2 不成熟树突状细胞 胰岛素转铁蛋白亚硒酸 亚油酸一牛血清白蛋白 脂多糖 免疫磁珠细胞分选 成熟树突状细胞 多潜能成体干细胞 p 一巯基乙醇 主要组织相容性复合物 1 3 0 中国医学科学院北京协和医学院博+ 研究生学位论文 1 3 l 中国医学科学院北京协和医学院博十研究生学位论文 1 3 2 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 t e mt dp i f a c sf a c sr t p c r f a c s 回 增殖实验 i u - p c ro v a f i t cm l r & a 1 1 0 d t h s k i n 回圈 r n 赴 观察n o t c h 配体下调对免疫学特性影响 4 f a c s & w e s t e mb l o t 检测n o t c h 配体 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 前言 第一部分 小鼠胚胎成纤维细胞来源的多潜能干细胞 的生物学特性研究 胚胎干细胞( e m b r y o i l i cs t e mc e l l s ，e s c s ) 具有强大的自我更新和多向分化能力， 但是伦理学的障碍以及e s c s 移植到动物体内有成为畸胎瘤的可能限制了e s c s 的临床 应用 1 ，2 】。近年来，越来越多的研究发现多种器官和组织中存在着成体干细胞，比 如骨髓【3 】，皮肤 4 】，肌肉【5 】，脂肪 6 】，小肠 7 】，胰腺【8 】，肺脏【9 】，心脏【9 】，脑【l o 】 以及肝脏 1 1 】。这些组织器官内的干细胞不但可以分化产生组织器官本身的细胞类 型，而且可以跨越组织界限或者胚层界限而分化为其他的细胞类型，这种现象被称为 成体干细胞的可塑性 1 2 l 。关于成体干细胞可塑性机制的解释，目前大多数学者接受 的观点是，多种组织器官内存在的成体干细胞其实并非均一的细胞群体，其中包含着 更为原始的多潜能干细胞【1 3 】。我们命名为胚胎后亚全能干细胞，亚全能干细胞在胚 胎发育过程中出现，并且一直可以保留在成体的各种组织中，包括骨髓，皮肤以及胰 腺等器官内 1 4 】，它们在自我更新和分化潜能上低于e s c s ，但是高于普通的多能干细 胞，可以分化产生机体大多数组织器官的细胞类型。显然，亚全能干细胞的分离和鉴 定对于基础研究和临床应用具有非常重要的意义和价值。 来源于中胚层的间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 不但可以生成中 胚层的脂肪细胞，成骨细胞以及骨细胞，而且骨髓来源的m s c 可以分化为胰岛素分泌 细胞 1 5 】和神经元 1 6 】。关于m s c s 具有可塑性的原因，不能忽视一个事实，即目前从 各种组织中分离的m s c s 在分化特性和表型上并非均一【1 7 】，克隆性研究发现从骨髓 中以贴壁方法分离的m s c s 其实包含不同的细胞亚群以及一些未分化的祖细胞或者包 含某些系特异性的前体细胞【1 8 】，因此m s c s 可以表现为跨系甚至跨胚层分化的特点。 但是目前对于m s c s ，仍然缺乏能够鉴别的特异性表面标志，而且不同实验室不同物 种分离的m s c s 的生物学特性也存在很大差异。从各个组织中分离出的m s c s 与亚全能 干细胞的关系还需要进一步研究。 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 j i a n g 等从出生后的人和小鼠的骨髓中分离出一种较原始的干细胞，命名为多潜能 成体干细胞( m u l t i p o t e n ta d u l tp m g e n i t o rc e l l s ，m a p c s ) ，这种细胞群可以在体外长期 培养而不出现衰老，克隆性研究显示它们具有分化为三胚层细胞的能力【3 】。k u c i a 等 也从人类的骨髓以及脐血中分离到一种原始的成体干细胞，名为类胚胎样的小干细 胞，这类细胞表达e s c s 相关标志，比如s s e a 1 ，o c t 4 ，n a n o g 以及r e x 1 ，同时也 可以分化成为三胚层的细胞类型【1 9 】。尽管还有其他研究分离鉴别出具有亚全能性的 原始干细胞 2 0 ，2 1 】，但是目前对于亚全能干细胞的起源，鉴别以及生物学特性仍然 缺乏了解，不同的器官和组织是否都存在着这类具有亚全能生物学性质的干细胞，仍 需要进一步研究。 小鼠胚胎成纤维细胞( m o u s e 锄b r y o i l i c 舢r o b i a s t s ，m e f ) 一般被用于制作滋养 层细胞以维持e s c s 的增殖及保持其未分化状态，m e f 具有这种作用可能是因为其中 含有较为原始的干细胞，这些干细胞通过细胞接触或者分泌某些生长因子和细胞因 子，以维持e s c s 的自我更新和分化潜能。 为了验证这个假设，我们利用干细胞抗原( s t e mc e l l 柚t i g e n 1 ，s c a - 1 ) ，通过磁珠 分选技术，从m e f 中分离出一种干细胞群，表型为s c a 1 + c d l l 7 一l i n - ，这个细胞群在 体外能够连续扩增2 0 代以上而没有任何衰老和分化的趋势，此细胞群具有亚全能干细 胞的基本生物学特性，包括含有疏松聚集的常染色质，具有分化为三胚层细胞的能力， 表达胚胎干细胞相关抗原s o x 2 ，o c t - 4 以及n 锄o g 。与m s c s 类似，s c a 1 + c d l l 7 l i n - 细 胞具有抑制体外淋巴细胞增殖的特性，体内实验显示其可以延长异基因皮肤的存活时 间。皮肤烧伤实验证明s c a 1 + c d l l 7 l i n 细胞可以明显促进皮肤创口的愈合，而且这 种治疗效应显著超过了骨髓来源的m s c s 。因此，本实验证实了m e f 中存在着一种具 有亚全能特性的干细胞，具有强大的多系分化潜能以及免疫调节作用，也许会成为具 有潜在临床应用价值的干细胞群体。 6 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 仪器材料 实验仪器 1 3 7 恒温、5 c 0 2 细胞培养箱( t h e m mf o n n a 电子公司) 2 无菌操作台( 苏净集团安泰公司) 3 1 5 m l 、5 0 m l 离心管( c o m i n g 公司) ，2 5 c m 2 、7 5 c m 2 细胞培养瓶( c o m i n g 公司) 、 6 孔板、2 4 孔板、9 6 孔板( 美国c o s t a r 公司) 4 常温台式离心机( 德国h e m e u ss e p a t e c h ) ，低温台式离心机( 美国s i g m 公司3 k 2 0 型，德国h e r a e u s 公司l a b o 如g e4 5 0 r 型) 5 w h 一2 微型漩涡混合仪( 上海沪西分析仪器厂) 6 倒置显微镜( 日本o l y m p u s 公司) 7 倒置荧光显微镜及照相系统( 日本n i k o n 公司) 8 分析天平( 美国m e t t l e r 公司a e 2 0 0 型) 9 电动移液器( 德国a c c u j e t 公司) 1 0 电热恒温干燥箱( 湖南长沙医用仪器厂) 1 1 流式细胞仪( 美国c o u l t e r 公司f a c s v a m a g e 型) 1 2 g e n e a m pp c rs y s t e m2 4 0 0p c r 扩增仪( 购自美国p e 公司) 1 3 d u 7 0 型紫外分光光度计( 购自美国b e c k m a i l 公司) 1 4 正置荧光显微镜及照相系统( 日本o l y m p u s 公司) 1 5 荧光定量p c r 仪( a b l 7 5 0 0 ；a p p l i e db i o s y s t e m s 公司) 材料 f i c o l l p a q u e 分离液( 比重1 0 7 7 9 m l ；p t 瑚1 i l a c i a 公司) ；细胞培养液：d m e m ； 胎牛血清( h y c l o n e 公司) ；胰蛋白酶( g i b c o b r l 公司) ；谷氨酰胺( g i b c o b i 也公司) ； p 巯基乙醇( p - m e r c a p t o e m a n o l ；m e r c k 公司) ；碱性成纤维细胞生长因子( b a s i c f i b r o b l a s t i cg r 0 蚍hf a c t o r ，b f g f ；r & d 公司) ；内皮细胞生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t h 矗圮t i 叫，v e g f ；b d 公司) ；血小板衍生生长因子( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w c l lf - a c t o r b b ，p d g f b b ；r & d 公司) ；神经生长因子( n e r v eg r o w t l lf a t o r ，n g f ，r & d 公司) ； 肝细胞生长因子( h 印a l o c ”e 黟洲lf a c t o r ，h g f ，r & d 公司) ；成纤维细胞生长因子 7 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 - 4( n b r o b l a s tg r o w hf a c t o 一，f g f 4 ，r & d 公司) ；胰岛素转铁蛋白亚硒酸 ( i i l s u l i n t r a i l s f e r r i n s e l e n i u m ，l t s ：s i g m a 公司) ；亚油酸牛血清白蛋白( 1 i n o l e i c a c i d - b o v i n es e r u ma l b 眦i n ，l a b s a ；s i g m a 公司) ；氢化可的松( h y d r o c o n i s o n e ； s i g m a ) ；皂素( s 印o i l i n ；s i g m a 公司) ；碘化丙锭( p i ：s i g m a 公司) ；流式抗体：c d l 4 、 c d l 9 、c d 2 9 、c d 3 1 、c d 3 4 、c d 4 4 、c d 4 5 、c d l l 7 、f l k 1 及s c a 1 ( 均购自s a n t a c n 圮 公司) ，m h c 类分子h 2 k d 和1 a d ( 均购自m o 硼妇i n e w 公司) ；免疫组化试剂( 福州 迈新生物技术开发公司) ；组织特异抗体：a l b 哪i n ( a b ds e r o t e c 公司) 、v w f 、g f a p 、 c y t o k e r a t i n l 8 ( 均购自s a i l t ac n j z 公司) ；免疫荧光试剂：山羊抗兔i g g f i t c 、山羊抗 兔i g g t t c 、兔抗山羊i g c 招i t c 、兔抗山羊i g g t t c ( 均购自s i g m a 公司) ；逆转 录及p c r 扩增试剂( 天根生化科技有限公司) 。 方法 实验动物 b a l b c 和c 5 7 b l 6 小鼠购于中国医学科学院动物所，所有动物实验均按照中国 医学科学院动物管理条例执行，在无菌条件下饲养。 多潜能干细胞s c a 1 + c d l l 7 l i n - 的分离与培养 取1 2 5 d 一1 4 5 d 的b a l b c 孕鼠，无菌条件下打开子宫，取出胎儿，剥离胎膜， 去除胎盘，用剪刀去除头、四肢以及内脏器官以及血凝块，置于2 m id - h a j l l ( s 液中清 洗后，转入3 0 m m 的培养皿中。用剪刀把组织完全剪碎，加入1 0 倍体积0 2 5 的胰 蛋白酶，在3 7 的环境中消化1 0 m i n ，3 分钟间隔摇动一次。消化完毕后加入血清中 和消化液，用移液器把消化后的组织充分吹打为单细胞悬液，1 2 0 0 转分离心1 0 分钟 后，弃上清液，然后用培养液重悬细胞，接种在7 5 c m 2 的培养瓶中，接种密度为5 0 x 1 0 5 c i n 2 。在3 7 ，5 c 0 2 的培养箱中孵育3 天，换液去除未粘附的细胞，贴壁的 细胞使用0 2 5 的胰蛋白酶消化，收集细胞1 2 0 0 转分离心1 0 m i n ，弃上清，用含1 m m e d l a 和2 f c s 的p b s 重悬细胞。使用s t e m c e l lt e c l l n o l o g i e s 的小鼠s c a - 1 以及c d l l 7 分选磁珠，按照说明书分选出s c a 1 + c d l l 7 细胞群，再使用上述培养液重悬该群细胞， 接种于培养瓶中，接种密度为5 0 x1 0 5 c n l 2 ，于3 7 、5 c 0 2 培养箱培养，2 天后 8 中国医学科学院北京协和医学院博十研究生学位论文 换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3 天半量换液。当细胞密度达7 0 8 0 时，用o 1 2 5 胰酶常规消化，细胞按照1 ：2 进行传代。 小鼠骨髓来源的间充质干细胞的培养 l 、骨髓的取材 1 ) 用颈椎脱臼断颈法处死小鼠。在无菌条件下取股骨和胫骨，除去骨表面附着的 肌肉组织，用d h a n k 液浸泡( 添加青霉素1 0 0 i u “，链霉素1 0 0ug i i l l ) 。 2 ) 用器械去除股骨近端和胫骨远端，暴露骨髓腔。然后除去股骨，胫骨另一端的 骨骺，并用1 m l 注射器在骨端的生长面上开一个小孔。 3 ) 用注射器吸1 m l 含血清的基础培养液，将针头从上述小孔插入骨髓腔中，注入 培养液，从骨的另一端收集冲洗出来的骨髓。 4 ) 将收获的全部骨髓用注射器轻柔抽吸，以打散组织成为细胞悬液。 5 ) 收集细胞悬液，离心( 1 2 0 0 转分钟，1 0 分钟) 。用细胞培养液重悬沉淀的细胞。 6 ) 取少量细胞悬液与等量4 乙酸混合以溶解红细胞。然后计数有核细胞。 2 、接种及培养 1 ) 用细胞培养液调节细胞密度，每6 1 0 7 个骨髓有核细胞接种到一个t 7 5 的塑料 培养瓶中。在3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度的细胞培养箱中培养。 2 ) 原代接种后2 4 小时，除去未贴壁的造血细胞，用d h a l l l ( 液洗l 遍，半量换液。 以后每隔1 2 天换液1 次。 3 ) 5 7 天后，当形成一些较大的细胞克隆时，用d h a n k 液将培养的细胞洗2 遍。 加入0 2 5 胰酶( 含0 0 1 e d t a ) 消化液，室温消化2 分钟。用牛血清终止胰 蛋白酶的作用。 4 ) 用吸管轻轻吹打培养瓶的细胞贴附面，使细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细 胞悬液。 5 ) 将细胞悬液接种到新的培养瓶中，于3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培 养。待传代的细胞生长密度达到8 0 9 0 时，即再次传代。 9 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 透射电子显微镜分析 o 2 5 的胰蛋白酶消化s c a 1 + c d l l 7 l i n 一细胞，1 2 0 0 转分离心1 0 m i n 后，弃上清， 1 m lp b s 重悬细胞，转移细胞悬液到1 5 m le p 管中，1 2 0 0 转分离心1 0 m i n 后，弃上 清，沿着管壁缓缓加入3 戊二醛预固定( 勿吹散细胞) ，4 固定l o 小时后，使用四 氧化锇后固定，丙酮逐级脱水，之后用e p o n 8 1 2 包埋液进行浸透包埋，制作8 0 0 a o 的超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，在j e m 1 0 l o 透射电子显微镜下观察。 细胞生长曲线及倍增时间测定( d o u b l i n gt i m e ，t d ) 的测定 取第5 代细胞，消化计数，接种于2 4 孔板内( 5 1 0 3 细胞孔) ，每天取3 个 复孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲线。在指数生长期细胞生长 t d = o 3 0 1 t l o g n t 1 0 9 n o ，t 为细胞培养时间( ”，n o 及n t 分别代表接种时及培养t 小 时的细胞数。 细胞周期测定 l 1 0 6 细胞用7 0 的冰乙醇4 固定2 4 h 。p b s 洗2 遍，0 5m lp b s 重悬细胞， 加r n a s e a 终浓度5 0p m l o 置3 7 恒温水浴箱，温浴3 0 m i n 。测定前3 0m i n 加碘 化丙锭终浓度5 0 i i l l 染色，流式细胞仪用b df a c s c a i l ( b e c t o nd i c k i i l s o n ) ，汞灯 4 8 8 n m 波长激发光激发。以m o d i f i t 软件( b e c t o nd i c l ( i n s o n ) 分析细胞周期。 免疫表型分析 0 2 5 胰酶消化细胞，每管细胞2 1 0 5 ，用含有0 1 叠氮钠和o 5 b s a 的p b s 洗两遍，用p b s 重悬细胞，加入异硫氰酸荧光素( n u o r e s c e i ni s o t l l i o c y a l l a ：i e ，f i t c ) 或藻红蛋白( p h y c o e r y t n ，p e ) 标记的抗小鼠i g g 抗体，4 固定4 5 m i n ，p b s 洗 2 遍，用不含b s a 的p b s 重悬细胞，流式细胞仪检测c d l 4 、c d l 9 、c d 2 9 、c d 3 1 、 c d 3 4 、c d 4 4 、c d 4 5 、c d l l 7 、f l k 1 、s c a - l 、h 2 k d 以及i a o 的表达。因f l k - l 抗体 为抗胞内段抗体，细胞需要用4 多聚甲醛4 固定1 5 m i n ，o 1 皂素室温破膜1 h ， 其余步骤与其他免疫表型分析方法相同。相同物种相同i g g 亚类f i t c 或p e 标记的 抗体做阴性对照 l o 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 三胚层多系分化 脂肪分化： s c a - 1 + c d l1 7 l i n 细胞，接种密度为2 1 0 4 c m 2 在含有1 0 。6m 地塞 米松、o 5 m m3 i s o b u t y l 1 m e t h y l x 锄t l l i n e ( i b m x ) 、0 1 m m 抗坏血酸和1 0 f c s 的 d m e m 培养基中诱导3 周。每3 天半量换液一次。倒置显微镜下观察脂肪滴的形成， 采用半定量r t - p c r 检测脂肪细胞特异性基因a d i p s i n 的表达，同时油红o 染色检测 脂肪滴：细胞以中性甲醛固定l o m i n 后，蒸馏水冲洗，油红o 染色5 r n j n ，蒸馏水冲 洗，甘油明胶封片，显微镜下观察并照相。对照细胞为在扩增培养基中培养的 s c a - l + c d l l 7 l i n 细胞。 成骨分化：接种密度为2 1 0 4 c m 2 的s c a - l + c d l l 7 。l i n 细胞在含有10 7m 地塞米 松、l o m mb 磷酸甘油、o 0 5 m m 抗坏血酸和1 0 f c s 的d m d m 中诱导培养，每3 天半量换液一次。诱导3 周后，半定量i m p c r 检测成骨细胞特异性基因o s t e o c a l c i n 的表达，同时用v o nk o s s a 染色检测钙化基质沉淀：中性甲醛溶液固定1 h ，去离子水 洗净后，加入2 硝酸银溶液，3 7 避光反应l o m i n ，去离子水冲洗后曝光2 0 血n ， 光镜下观察钙化基质沉淀。对照细胞为在扩增培养基中培养的s c a 1 + c d l l 7 。l i n 一细胞。 内皮诱导：s c a - l + c d l l 7 l i i l 。细胞，5 1 0 3 孔，接种于1 的m a t r i g e l ( f a c t o r 小e d u c e d ，b db i o s c i e n c e ) 包被的9 6 孔培养板上，内皮诱导液为d m e m 、2 f c s 、2 0 n 咖1 v e g f 和1 0 0 u m l 青霉素及1 0 0 “g m l 硫酸链霉素。同时以l 1 0 4 c m 2 的细胞密度接 种s c a l + c d l l 7 。l i n 。细胞于6 孔板中的盖玻片上，培养在内皮诱导液中。细胞持续诱 导2 周，光学显微镜下记录s c a 一1 + c d l l 7 。l i n 。细胞的细胞形态变化过程，并以半定量 i m p c r 和免疫荧光方法检测血管内皮型钙粘素( v e c a d h e r i n ) 和v w f 的表达以鉴 定分化结果。 神经外胚层诱导：培养的s c a 1 + c d l l 7 l i n - 细胞，以2 1 0 4 c m 2 的密度接种于6 孔板中预先放置的盖玻片上，使用神经细胞诱导液进行诱导，诱导液包含：r p m l l 6 4 0 ， 1 0 f c s ，2 m m 谷氨酰胺，o 1 m m 非必须氨基酸，1 m m 丙酮酸钠，2 0 n g m l 神经生 长因子( n e eg r o w t l lf a c t o r ，n g f ) 以及碱性成纤维细胞生长因子( b a s i c 肋r o b l a s t g r o 、砒f a c t b f g f ) 。诱导2 1 天后，使用半定量i m p c r 和免疫细胞荧光方法检测神 经胶质酸性蛋白( g l i a l 助r i l l a d ，a c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) 的表达。 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 肝脏细胞诱导：以2 1 0 4 c m 2 的密度接种s c a - l + c d l l 7 l i n 一细胞于6 孔板中预先 放置的盖玻片上，使用神经细胞诱导液进行诱导，诱导液包含r p m l l 6 4 0 ，1 0 f c s ， 2 m m 谷氨酰胺，0 1 m m 非必须氨基酸，l m m 丙酮酸钠，2 0 n 咖1 肝细胞生长因子 ( h e p a t o c y t eg r o w t l lf a c t o r ，h g f ) 以及2 0 n g “成纤维细胞生长因子4 ( 邱r o b l a s t g r o w t h 矗l c t o r ，f g f - 4 ) 。诱导2 1 天后，使用半定量i 弭p c r 和免疫细胞荧光方法检测 诱导的肝脏细胞中白蛋白( a l b 眦氓a l b ) 以及细胞角蛋白1 8 ( c ”o k e r a t i n l 8 ，c k l 8 ) 的表达。 细胞免疫荧光 在成肝脏，成内皮以及成神经进行诱导后，用p b s 冲洗2 次，然后使用4 的多 聚甲醛固定3 0 分钟，0 1 的皂素破膜1 小时，再使用与二抗同一种属的血清封闭3 0 分钟，然后加入抗a l b ( s e r o t e c1 ：1 0 0 ) ，c k l 8 ( s 锄妇c r u z ，1 ：1 0 0 ) ，v w f ( s 锄t ac m z ， l ：1 0 0 ) 以及g f ”( s 锄忱c 嗽l ：l o o ) 的抗体在室温孵育l 小时，之后用p b s 洗3 次，加入f i t c 和1 砌t c 标记的二抗在室温孵育l 小时，p b s 洗后用h o e c h s t3 3 3 4 2 ( s i g m a ) 复染细胞核1 分钟，在共聚焦荧光显微镜下观察( o l y n 叩u s ) 。 细胞l 州a 分析 一、半定量i m p c r 法检测成脂肪、成骨、成肝脏、成内皮以及成神经诱导后细胞的相 关基因表达。操作步骤简述如下： 1 ) 细胞总i a 提取 按t r i z o l 总i 矾a 分离试剂盒说明书进行。弃去诱导培养基，用p b s 缓冲液清洗 培养板2 次。加入1 “的t h z o l ( i n v i n d g e n ) ，不断振摇使细胞裂解，并用枪头反复 吹打几次，吸出液体至1 5 l i l le p 管。每l i i l l 液体加0 2 m l 氯仿，充分颠倒混匀，静 置3 分钟。1 2 ，0 0 0 9 4 离心1 5 分钟，小心吸取上层水相，转入新的无r n a 酶污染 的e p 管中，加o 5 m l 异丙醇，颠倒混匀，室温静置1 0 分钟，1 2 ，0 0 0 g ，4 离心 1 0 分钟。弃上清，加l m l7 5 乙醇( d e p c 水配制) 洗涤沉淀，8 5 0 0 g4 离心l o 分钟，弃上清，离心机中转动数秒，沉淀液体到管底，吸取剩余液体弃去，敞开管盖， 空气中干燥，加入2 0 “l 无i a 酶，d n a 酶的水，置5 5 水浴中，助溶i a1 0 分 1 2 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 钟，取l “l 所提r n a 溶液进行紫外分光光度仪分析( a 2 6 0 儿墟8 0 1 8 ) 和定量，剩 余的i a 8 0 储存。 2 ) c d n a 的合成 按照m m l v 逆转录酶产品说明书推荐的条件：在无i a 酶的e p 管中加入2 肛l 5 0 0 “g m l 随机引物，l g 总r n a ，以无i a 酶的h 2 0 水补至1 7 l ，6 5 加热5 分 钟，立即冰浴1 分钟，稍加离心去除挂壁，按顺序加入下列成分： 5 m m n r 逆转录酶缓冲液6 m 栅( 1 0 湖旧2 p l r n a s i l l ( 4 0 u l l )1 m m - m l v 逆转录酶( 1 0 u 舡，)l p l 0 。l m d t t 3 m 混匀后4 2 反转录1 小时，7 5 灭活1 5 分钟，2 0 贮存备用。 3 ) p c r 扩增 我们应用t i a n g e n 公司提供的p c rm a s t e rm i x 试剂盒进行p c r 扩增反应。向 o 2 m 1e p 管中依次加入下列成分，配成2 5 “l 反应体系。 去离子水 8 5 耻l p c r m a s t e r m i 】【1 2 5p l 上游引物 1 0 “l 下游引物 1 0 l l 模板c d n a 2 oh l p c r 按照以下程序扩增( 引物序列见附表) ：9 5o c 预变性5 分钟，9 5o c 变性3 0 秒，5 5o c 退火3 0 秒，7 2o c 延伸4 0 秒，循环3 0 次后，7 2 0 c 延伸8 分钟。p c r 产物 以1 5 的琼脂糖凝胶进行分离，g o l d e n v i e w 染色后在紫外凝胶成像系统( k o d a k ) 下分析产物条带。 s c a 1 + c d l l 7 l i n 细胞的免疫特性研究 1 小鼠脾细胞的制备： ( 1 ) 用颈椎脱臼断颈法处死小鼠。在无菌条件下取小鼠脾脏，用d - h a i l b 液浸泡( 添 1 3 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 加青霉素1 0 0 i u m l ，链霉素1 0 0u m 1 ) 。 ( 2 ) 用注射器将脾脏分离成小细胞团后，用l m l 注射器反复抽吸，以打散成为单细 胞悬液。 ( 3 ) 1 0 0 0 转分离心1 0 分钟，去除上清后，加e d l a n h 4 c l ，混匀，放置2 分钟，加 入大量的d h a n k s 液，1 0 0 0 转分离心1 0 分钟，去除上清。 ( 4 ) 用d h a r 她液洗两遍，计数，用含1 0 胎牛血清的蹦p i l 6 4 0 培养液重悬细胞， 制备成2 1 0 6 m l 浓度，待用。 2 s c a 1 + c d l l 7 。l i n 细胞的准备 ( 1 ) 将生长密度达到8 0 左右的s c a - 1 + c d l l 7 l i n - 细胞消化。 ( 2 ) 调整s c a - l + c d l l 7 。l i n 细胞浓度为每1 0 0ul 细胞数分别5 1 0 5 ，1x1 0 5 ，5 1 0 4 ， 加入到u 型底9 6 孔板中，每个组设6 个复孔，在3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度的c 0 2 培养箱中培养2 个小时以上，使s c a 1 + c d l l 7 。l i n 细胞贴壁。 ( 3 ) 照射3 0 g y 。 ( 4 ) 去除上清，加入效应细胞( 小鼠脾细胞) ，进行混合淋巴细胞反应和有丝分裂 原