（作物遗传育种专业论文）水稻和黄瓜TFL2基因表达比较研究.pdf

0 水稻和黄瓜规2 基因表达比较研究 摘要 腮2 是一成花基因。在双子叶模式植物拟南芥中，7 冠2 主要表 达在维管束及植株分生组织，突变体亡f 偿主要表现为早花和顶端花。 7 忍2 基因表达产物是h p l ( h e t e r o c h r 伽a t inp r o t e i n1 ) 的同系物一 l h p l 。h p l 主要位于果蝇、哺乳动物和酵母的异染色质上，参与染 色质形成、包装，并涉及异染色质基因的沉默和基因转录的调节。l h p l 位于拟南芥常染色质上，功能类似h p l 。 ， 水稻是短日照单子叶植物，而黄瓜是日中性双子叶植物。本文采 用r n a 探针原位杂交法，比较研究水稻和黄瓜肫2 基因的表达情况， 旨在进一步揭示其在植物生长发育中的功能。 腮2 原位杂交显示： ( 1 ) 巩? 表达定位于水稻侧根、侧芽、一次和二次枝梗原基、 绒毡层、花粉、胚珠原基等处于旺盛生长和分裂状态的细胞中。在水 稻的茎尖分生组织，我们未观察到艘2 表达，说明水稻花分化与腮2 无关。在水稻分蘖芽中我们观察到7 忍2 表达，推测其功能与细胞分 裂、决定分蘖发育成芽而不是与花( t e r m i n a if l o w e r ) 、l a a 和硫苷 ( g lu c o s in o l a t e ) 等的次生代谢有关。 ( 2 ) 黄瓜7 h 2 的表达模式与拟南芥、大部分相似：在黄瓜雄花的 花粉、绒毡层、花丝及药隔维管束均观察到7 段2 的表达，而雌花中 肫2 表达仅限于子房的维管束和胚珠。在拟南芥雌雄蕊发育过程中， -争j-， 一 口 2 ，冠2 未显示显著差别。 ( 3 ) 水稻不论在长日照还是短日照下，腮2 均表达。黄瓜耽2 在整个生长和分化过程中也一直表达。这些结果说明，7 r 2 存在本 底水平表达，这种组成性表达不依赖光周期的变化。 ( 4 ) 水稻、拟南芥只有一个7 冠2 拷贝，说明在进化过程中多余 的拷贝丢失了。丢失现象暗示过量的7 r 2 对植物生长发育如果不是 有害的，至少是无益的。 关键词：腮2 基因，原位杂交，水稻，黄瓜。 疗 套 e x p r e s s i o np a t t e r no f7 ：砚2i ni u c ea n d c u c u m b e r a b s t r a c t 7 互a 扣，v 爿工凡d 玎7 e r2( 7 兕2 )i saf l o r a lr e l a t e dg e n e i n a r a b i d 叩s i s ，贶2e x p r e s s e dm a i n l y i nm e r i s t e ma 1 1 d v a s c u l a r ，叨 m u t a n ts h o w se a r l yf l o w e r i n ga i l dt e m l i n a ln o w er l h p1 ，t h ep r o d u c t so f 巧z zi sah o m o l o g u eo 仆e t e r o c i l r o m a t i np r o t e i nl ( h p l ) p r e d o m i n a m l y 1 0 c a t i 耐a th e t e r o c h m m a t i ni 1 1d r o s p h i l a ，m a m m a l sa n df i s s i o ny e a s t h p l w 嬲i n v o l v e di nh e t e r o c h r o m a 血lo 玛a n i z a t i o n ，g e n e s i l e n c i n g a n d r e g u l a t i o no fg e n et r a l l s c r i p t i o n l h p l i sm a i n l yl o c a l i z e da te u c l l r o m a t i n a n dp l a y s 廿l es 锄er o l ea si t sc o u i l t 唧a r ti l ld m s p l l i l a ，m a m m a l sa n d f i s s i o nv e a s t r i c ei sas h o r t - d a y ( s d ) m o n o c o t ，w h e r e a sc u c u m b e ri sam i d d a y ( m d ) d i c o t y l e d o n i nt h i sp 印e r ，w ec o m p a r a t i v e l ys t u d i e dt h ee x p r e s s i o n p a t t e mo f 乃琵2i i lr i c ea n dc u c u m b e rr e s p e c t i v e l yt 1 1 r o u g hr n a 加j f 统 h y b r i d i z a t i o ns oa st ou n v e i lm e 觚c t i o no f 舰2 i 1 1p l a n td e v e l o p m e n t t h er e s u l t ss h o wt h a t ： 【l 】 i nr i c e ，刀记2w a se x p r e s s e di nm i t o t i cc e l l s ，s u c ha si nl a t e r a lr o o t ， i a t e r a l b u d ，p a n i c l ep r i m o r d i u m ，s p i k e l e t sp r i m o r d i u m ，t a p e t u m ， p o l l e n ，o v u l ep r i m o r d i u m i n t r i g u i n g l y ，7 ：咒2 d i dn o te x p r e s si n s h o o tm e r i s t e m t h u s w ec a i lc o n c l “et i l a tz 兕2d o e s n te 脆c to n n o r a ld i 虢r e m i a t i o n h o w e v e r ，力吃2 e x p r e s s e d i i lt i l l e r b u d ， l l l 口 盖 s u g g e s t i n gt l l a t 刀咒2w a sr e l 种e dt oc e l ld i v i s i o n ，d e t e m i n a t i o no f t i l l e rd e v e l o p m e mi n t ob u dr a t h e rt h a nt e m l i n a ln o w e r ，a c c u m u l a t i o n o fi a aa 1 1 dg l u c o s i n o l a t e 【2 】t h ee x p r e s s i o np a t t e mo f 力z l 2i 1 1c u c u m b e ri sg e n e r a l l ys i m i l a rt o m a to fa r a b i d o p s i s i nm a l ec u c u m b e rn o w e r 刀琵2w a so b s e r v e d e x p r e s s i n g i n p o l l e n ，t a p e t u m ， a 1 1 m e rf i l a r r l e ma n dc o l l n e c t i v e v a s c u l a rb u n d l e h o w e v e r ， i nf e m a l ec u c u m b e rn o w e r z 兕2 e x p r e s s i o nw 鹤r e s 仃i c t e dt 0o v a r y v a s c u l a ra 1 1 d0 i e d u r i n g m 曲i d o p s i sn o m ld e v e l o p m e n t ，阡z 2e x p r e s s i o np 砒e md o e s n t s h o ws i 鲥f i c a n t l yd i 毹r e n c eb e 锕e e nm a l ea n df e m a l eo 唱m 【3 1c o n s i d e m g 抒z 2e x p r e s s e di r ir i c ei 仃e s p e c t i v ed a yl e n g m ，j u s ta s 廿1 a ti nc u c 啪b e r ，w ep o s t u l a t e dm a t 乃琵2e x p r e s sc o n s t a n t l y ， i n d e p e n d e n to np h o t o p e r i o d 【4 】u pt od a t e ，o n l y o n e贶2c o p yw a sf o u n di n r i c e ，s od i di n 舡a b i d o p s i s ，s u g g e s t i n gt 1 1 a td u p l i c a t e 观2l o s td u 咖ge v o l u t i o n t h u si n d i c a t et h a to v e re x p r e s s i o no f 矾2i sn o tb e n e f i tt op l a n t d e v e l o p m e n t ，i f n o th a r m 如1 k e yw o r d s ：丁：咒2 ，f 胛j 豇“h y b r i d i z a t i o n ，r i c e ，a n dc u c u m b e r l v -l矗：|。lr t t 广西大学硕士学位论文 水稻和黄瓜7 f z 0 基因表达比较研究 1 前言 1 1 植物花发育研究 世界上9 0 以上植物属有花植物。花是高等植物进行有性繁殖的重要器官，也是花 卉植物的观赏器官。早在1 0 0 多年前人们就已开始关注植物开花。2 0 世纪7 0 年代以前着 重于成花生理的研究：k l e h s ( 1 9 0 4 ) 关于c n 比对开花迟早影响的学说、c h a i l a k h y a i l ( 1 9 3 7 ) 关于开花素的学说和l a n g ( 1 9 6 5 ) 关于春化的概念等为研究植物开花机理提供了大量的 生理学背景知识【l 】0 7 0 年代提出关于植物由营养生长过渡到生殖生长前的感受状态理论， 不仅促进了从植物形态生理学、环境的影响等方面研究开花机理，而且也开创了从遗传 学角度利用植物本身的突变体或人工创造的突变体研究开花机理f 2 i 。根据分生组织的形 态特征，将植物从营养生长到生殖生长的转变分为3 个阶段，即营养分生组织阶段、花 序分生组织发生阶段和花分生组织发生阶段【3 】。8 0 年代后，随着分子生物学技术的不断 完善，尤其是克隆技术和诱变技术的出现，人们陆续从拟南芥( 爿r 口6 坳捃肪甜切研) 、 金鱼草( 4 h 咖砌加跏脚讲驸) 等模式植物中分离克隆出控制开花的基因，为进一步认识 植物开花的内在控制机制以及与外界环境因素的相互作用奠定了基础【4 1 。 1 1 1 植物花器官结构 种子植物的花由枝条变态产生，而花器官由叶片变态产生。花器官发育的基本单位 是同心轮( w h o r l ) 。典型的花器官从外到内由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊( 心皮) 等四轮 结构所组成。形态上，花发育大致分为以下几个阶段：营养分生组织产生花序分生组织、 花序分生组织产生花分生组织、花分生组织产生花器官原基最后发育成花器官。其中花 分生组织可被进一步分为早期花分生组织和晚期花分生组织，早期花分生组织有点类似 营养分生组织，具有无限生长的特点。 1 1 2 控花发育的主要基因 最初的主要开花基因分析始于拟南芥。通过对丌花基因的分析，可为理解控花发育 的分子遗传机制奠定基础。控制花发育的基因分为花分生组织特征基因( n o w e rm e r i s t e m i d e n t 时g e n e s ，或花分生组织决定基因) 和花器官特征基因( n o r a ii d e n t i t yg e n e s ) 。控 制茎端分生组织转变为花序分生组织的基因称为花分生组织决定基因，它的表达影响着 开花的早晚。控制花分生组织产生花原基，进而生成特定形态的花器官基因称为花器官 特征基因。这两类基因都属于同源异型基因( h o m e o t i cg e s ) ，因为当这些基因突变时， 均会出现异常或异位的分生组织或器官。现已从拟南芥中克隆出许多同源异型基因( 表 l 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 1 ) ，这些基因通过几种途径影响植物开花：g a 途径( g ap 甜1 w a y ) 、自主促发途径 ( a u t o n o m o l l spa _ t h w a y ) 、光依赖途径( l i g h td e p e n d e n tpa _ t 1 w a y ) 和春化途径 ( v 毫m a l i z a t i o np a m w a y ) 【5 1 。 表l 拟南芥中影响开花的基因及其可能的功能分析2 舯1 1 h b i elg e n e sa f 托c t e dn o w e r i n gi na n d i d o p s i sa n dt h e i rf u n c t i o n s 1 1 3 花器官发育学说 ( 1 ) 建成论 人们对花的研究经历了一个很长的过程。最早花器官的研究开始于花与叶子之间的 关系。通过观察花器官之间的转变关系，c a s p a r f l - i e 血c h w j l f ( 1 7 6 8 ) 提出建成论：雄 蕊常常转变成花瓣，因此导致第二轮花器官( 花瓣) 加倍：反过来，花瓣也可以转变成 2 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 雄蕊，雄蕊本质上也是叶片。2 0 年之后，g o e n 也通过观察大量异常花，得出的结论 支持建成论。其观点是：不同花器官之间可以相互转化并且是平等的。不仅它们之间是 平等的，与叶子之间也是平等的。它们是同事物的不同变化形式f 9 j 。 ( 2 ) “a b c ”模型 在对拟南芥和金鱼草突变体及花器官特征决定基因功能的研究中，e m y e r o 、i t z 提出了控制花形态发生的“a b c ”模型【2 】。以拟南芥突变体为代表的“a b c ”模型如下 所述：正常花的四轮结构的形成是由三组基因共同作用完成的。每一轮花器官特征决定 分别依赖于a 、b 、c 三组基因中的一组或两组基因的正常表达。如果其中任何一组或 更多的基因发生突变而丧失功能，则花的形态将发生异常。a 类基因包括一尸，和彳凹， b 类基因包括4 朗和，c 类基因包括彳g 。a 基因在第一、二轮花器官中表达。b 基 因在第二三轮花器官中表达，c 基因在第三、四轮花器宫中表达。a 基因本身决定萼 片，a 和b 基因共同决定花瓣，b 与c 基因共同决定雄蕊，c 基因决定心皮。此外，a 与c 基因相互拮抗。当a 基因突变后，导致第一轮花器官中的花萼突变为心皮，第二 轮花器官中的花瓣突变为雄蕊。b 基因突变后，花萼代替了第二轮花器官中的花瓣，第 三轮花器官中的雄蕊变为心皮。若c 基因失活，则第三轮花器官中的雄蕊转变为花瓣， 第四轮花器官中的心皮转变为花瓣。b 基因在第四轮花器官中的表达受到s u p e r m a n 基因的抑制。j 妒突变体的表型为第四抡心皮数大大减少，而雄蕊数大大增加。如前三 轮花器官中的基因表达正常，只有第四轮花器官中的b 基因异位表达，导致该轮花器官 发育为雄蕊【1 0 13 1 。 突变体是研究基表达和功能的良好材料，大量单突变体、双突变体、三突变体以及 基因过量表达的研究结果均在不同程度支持这个模型。“a b c ”模型的提出是近年植物 生物学研究中的一个非常重要的突破，可以解释多个基因在器官特征性发育的作用。 ( 3 ) 发展的“a b c ”模型 新的突变体表型的出现，发展了“a b c ”模型。f l o r a lb i n d i n gp r o t e i n1 1 是形成胚珠的基因，被命名为d 基因。由于d 基因的发现，从而提出了花器官发育的 “a b c d ”模型。后来的研究发现e 类基因，包括s e p a l l a r a l ( s e p l ) 、s e p a l l a 工舵 ( s e p 2 ) 和s e 队l l a r a 3 ( s e p 3 ) 。这些基因对于花瓣、雄蕊和雌蕊的形成不可或缺， “a b c ”模型被扩展为a b c d e ”模型【1 3 】。 3 广西大学硕士学位论文 水稻和黄瓜舰0 基因表达比较研究 1 1 4m a d s b o x 基因 研究发现拟南芥爿g 和金鱼草的d e f 基因与人的职f ( s e m mr e s p o n s e f k t o r ) 及酵母 的m c m ( m i l l i c h r o m o s o m em a i l l t e n a i l c eg e n c ) 具有很高的相似性，即均在n 端含有一个 约1 8 0 b p 的保守区域，由5 6 5 8 个氮基酸组成。这个区域以这四个基因的首字母命名为 m a d s - b o x 区，具有该区域的基因称为m a d s b o x 基因1 2 j 。无论是经典的“a b c ”模型， 还是新提出“a b c d e ”模型，其涉及的基因大多数属于m a d s - b o x 基因家族。花发育 的同源盒基因大多属于m a d s - b o x 基因家族。目前在苔鲜植物、蕨类植物、裸子植物和 被子植物中均发现m a d s _ b o x 基因，说明m a d s _ b o x 基因在植物繁殖器官的进化过程 中发挥了重要的作用【1 4 1 利用基因组图谱可以预测到水稻中大约有7 1 个m a d s - b o x 基 因，拟南芥中约有8 0 个【1 5 】。 1 2 水稻花发育研究 单子叶植物花发育机制的研究远远落后于双子叶植物。水稻是基因组最小的单子叶 植物，其基因组与禾本科类其他作物基因组共线性，并已建成饱和的遗传图谱。水稻的 花在单子叶植物花器官中具有代表性，而研究结果却可能对花发育模型作出重要的补 充。 水稻是世界重要的粮食作物之一，其花器官的发育直接影响稻谷产量和米质，因而 对调控水稻花发育的研究具有十分重要的现实意义。水稻花序分生组织的单位是小穗， 小穗由小花和两个颖片组成。小花从外到内依次由外稃、内稃、两个浆片、六个雄蕊和 一个雌蕊组成。部分观点认为水稻的外稃、内稃是同一器官，相当于双子叶的苞叶，而 部分观点认为内稃相当于双子叶的萼片。并且在其它单子叶植物如大麦中发现外稃和内 稃不是同一器官。因此，单子叶植物和双子叶植物花器官的对应关系尚未有定论。但许 多实验支持水稻的浆片相当于双子叶植物的花瓣这一说法。研究发现，适合双子叶植物 花发育的“a b c ”模型也同样适用于单子叶植物，“a b c ”模型可以扩展到水稻。水稻第 一轮花器官为外稃和内稃，第二轮为浆片，第三轮为雄蕊，第四轮为雌蕊( 心皮) 。 目l j ，人们已在水稻中克隆出许多花发育的基因( 表2 ) 。 4 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜舰2 基因表达比较研究 表2 水稻中花发育的同源域基因及其功能分析“2 “川 t a b l e2h o m e o t i c g e n e sa 仃e c t e dn 呷e 渤g i nr i c ea n dt h e i rf u n c t i o n s 基因表达部位和功能 r f l k n l 卸e 同a 讲， 源基因亿b 抽，) a 功能基因 b 功能基因 o s h 6 o s h 7 | r a p l a r a p l b e 3 1 8 4 6 o s k m d s 2 o s m a d s 4 o s m a d s l 6 c 功能基冈伪 埘n ( 兄4 g ) 是拟南芥盯阮月d 同源的基因，与f y 不完全相似，r 儿在幼嫩的花序 中表达，而不在花分生组织、成熟小花、叶和根中表达 在花序轴和花分生组织的原基中表达，在营养生长和花序分生组织期调控 s a m ( 顶端分生组织) 的形成 在花序轴的原体中表达，而在花分生组织的原体中没有表达，在营养生长和 花序分生组织形成期调控s a m 的形成和发育 在花序分生组织中致表达，从花分生组织到花的过渡期，其表达只局限于 花分生组织与颖片原基之阃与细胞命运的决定和器官定位有关 是拟南芥且_ p ，的同源基因，但表达模式不同。小穗发育的早期阶段在花分 生组织的顶端表达，然后局限在花的内稃、外稃及浆片中，在d n a 复制、 重组、修复和转录调控中起重要作用 是拟南芥门的同源基因，在雄蕊原基和浆片原基中表达 是拟南芥的同源基因，在水稻第二三四轮花器官中表达，与在拟南 芥中的表达方式非常相似，突变体第二轮器官浆片变成雄蕊，第三轮器官 雄蕊变成心皮 是拟南芥爿j p j 的同源基因，在水稻第二三轮花器官中表达，与一j d 3 在拟南 芥中的表达方式极其相似 是拟南芥4 g 的同源基因。主要在水稻雄蕊和心皮中表达，与a g 基因表 达相似 d 功能基因 西删d s ， 在发育的胚珠中高水平表达，与胚珠和种子发育有关 e 功能基因 西删d s ， 与拟南芥s e d 表达相似，在花原基，内外稃和雌蕊子房中表达 1 3 咿1 ( h e t e r o c h r o m ti np r o t e i n1 ) h p l 在染色体生物学和基因沉默中起重要作用。它最先在果蝇中被鉴定出来 ( h p l h p l a ，最近又鉴定出h p l b 和h p l c ) ，随后发现几个h p l 的同系物，如裂殖酵 母s 矽小抛的s 、v i 6 ，x e n o p 惦的x h p la 和) n l p ly ，鸡的c h c b l 、c h c b 2 和c h c b 3 ，老鼠 的h p ld 、h p lb 和h p ly ，以及人类的h p l bq 、h p lh 5 b 和h p l b y 。每一种h p l 蛋 白分子都由n 末端结构域( c d ) 、c 末端结构域( c s d ) 及连接两结构域的铰链区构成。 h p l 通过其c d 结构域与组蛋白h 3 的甲基化的赖氨酸9 ( k 9 ) 残基作用【1 8 】，h p l 与染色 5 广西大学硕士学位论文 水稻和黄瓜巩2 基因表达比较研究 质之间的这种相互作用可通过阻止h 3 k 9 甲基化阻断【1 9 1 。c s d 被认为是二聚体形成区域， 它涉及到h p l 相关蛋白的“蛋白一蛋白”相互作用。一些蛋白与h p l 的相互作用要求c s d 的二聚体作用，如转录中间代谢因子( t i f s ) 、核纤层蛋白b 受体( l b r ) 和1 5 0 p 亚单 位染色质集合因子( c a f ) 【2 0 】。 i p 1 主要位于异染色质上，但它也可以位于常染色质上，其功能基本相似。h p l 有 几个功能： 第一，着丝粒和端粒功能。h p l 有助于把充足的粘附素分子定位或卸载于姐妹染色 体上，h p l 与着丝粒处的粘附素连接，从而使同源染色体配对和染色体准确分离。在有 丝分裂过程中，s w i 6 ( h p l 同系物) 变异将提高染色体分离滞后率和丢失率。而高频率 的非同源配对使h 3 k 9 甲基化功能降低或丢失，导致染色体不稳定性提高。h p l 也与端粒 连接，与端粒d n a 相连防止端粒一端粒融合。 第二，核组织功能。h p l 与l b r ( 核纤层蛋白b 受体) 、核纤层蛋白b 及l a p 2 b ( 核 纤层蛋白关联多肽2b ) 等核膜成分之间相互作用，如l b r 可直接或间接地与核心组蛋， 白h 3 、h 4 相互作用。由此推测h p l 可能把异染色质和一些沉默基因栓到核表上，以便 使转录活跃区域更为有效地进入核内转录场。 第三，染色质包装功能。h p l 与一些蛋白联系，在d n a 复制和修复过程中参与染色 质包装。如染色质集合因子( c a f l ) 通过其亚单位成分p 1 5 0 与鼠h p l 、h p lb 及人 h p l ”d 相互作用。果蝇o r c 和h p l h o a p 也与h p l 蛋白联系，h p l 不能识别专门的d n a 序列，因此发育性地调节h p l 至基因组内专门的位置，使核内异染色质集合，需要 o r c h o a p h p l 连接。这些蛋白被认为是异染色质包装的必须。 第四，基因表达的调节功能。几个h p l 相互作用蛋白可以反映h p l 在基因调节中的 活动模式，例如s u v ( v a r ) 3 9 和它的同系物。而且，转录的染色质联合抑制物s u ( z ) 1 2 、t i fq 、t i fb i ( a p l 、b r g l s n f 2b 、a t r x 、t a f ，。1 3 0 和d n a 甲基转移酶等可以与一 个或多个h p l 变体直接连接或以蛋白复合体形式存在。 第血，涉及异染色质上沉默基因。最近研究表明，h p l 与异染色质型结构及基因沉 默有关。此外，h p l 还可以促进基因表达。当h p l 突变时，在m r n a 水平上，主要的异染 色质基因的表达就会降低。h p l 与转录调节因子如t i f s 和b r g l s n f 2b 联系在一起抑制 或促进转剥2 “。 6 广西大学硕士学位论文 水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 1 4 刃咒( t e 蛐i n a lf l o w e r ) 基因 7 兕基因与花序发育有关，可间接负调控卢k 月用，且7 慰基因在营养时期也起作 用。7 兕j 和耽2 是花序分生组织特性的抑制基因，对成花的抑制是在光周期途径起作 用。 眦，的主要作用是在茎端分生组织中抑制花的形成。乃琵j 在分生组织中表达，不 在幼花原基中表达圆。陋【j 在早期少量表达延迟营养型分生组织向生殖型分生组织转 变，在后期大量表达维持花序分生组织特性】。坍突变体表现为开花提前，初级花序 分枝转变成末端花，缺少侧枝，花的数量大大减少，花序态从正常的无限花序变成有限 花序。l f 黝j p ，朋工抑制乃琵j 在花序分生组织周边产生的花分生组织中表达。矾j 和工f i 铂p 肌翻工的相对活动影响开花时间及花序大小剐。够j 突变体和抄突变体的表 型相反，由此推测z 咒j 和上n 7 两基因是相互拮抗的。 7 兕2 比7 兕具有更强的调节作用。它的双重作用之一是调节分生组织，使其对影 响植物发育的光信号作出反应；二是维持花序分生组织特性。7 咒2 影响脚控制的发育 过程，而不影响护r 调节的发育过程。 订2 突变体被认为是f 仃j 突变体表型的加强型， 它除了具有 硝的表型外，还出现植株小、叶卷、低育性及根生长率低等现象【2 5 1 。说 明舰2 基因本身调控着许多发育过程，如减数分裂、成花、种子成熟等。耽2 在开花 光周期途径f 7 ( 开花位点基因) 上游起作用，而7 兄2 在( 促花因子) 的下游，并不 影响的表达。力2 突变体中，刀表达增加。说明7 慰? 基因作用于阿位点，f 仃2 促进f 7 基因的异位表达。 胞? 基因的产物是h p l ( h e t e r o c h r o i i i a t i np r o t e i n1 ) 的一个同系物，在植物中 被称为l h p l 。哺乳动物的h p l 和裂殖酵母的s w i 6 位于异染色质区，它通过与组蛋白h 3 的甲基化赖氨酸作用，调节染色质装配，使染色质上的基因沉默。在f 彤? 突变体中， 位于常染色质上的，一4 服磁珊基因被激活，说明l h p l 的功能类似于h p l 【2 6 】。 但与 h p l 不同的是，h p l 主要分御于异染色质上，而l h p l 分布于常染色质上【2 7 】。 1 5 存在问题 成花基因中7 冠2 的表达研究很少，仅局限在双子叶模式植物拟南芥中，未见有在 其它植物中表达情况的报道。现存在的主要问题是： ( 1 )肥2 基因在其他植物中的相似性程度如何? 如不同物种间的7 兕2 基因与 7 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 拟南芥相似性程度如何? 不同物种或同一物种间不同砒2 拷贝c d s 之间的 相似性? ( 2 )脱2 基因在单子叶植物中如何表达? 作用是否与拟南芥相同? 如代表植 物水稻。 ( 3 ) 舰2 基因在单子叶植物与双子叶植物中的表达是否相同? 1 6r n a 原位杂交技术 原位杂交技术最先由美国耶鲁大学g a l l 和p a r d u e ( 1 9 6 9 ) 创立。最初的应用是动 物染色体上的基因物理定位【2 8 】年口特定m r n a 在组织中的空间定位【2 9 】，后来又作为诊断工 具检测感染病毒的细胞【3 0 】。8 0 年代后期，原位杂交开始用于植物基因表达调控的研究。 植物基因的时空表达研究是探讨植物生长发育机制的重要手段【3 。 原位杂交技术是由n o r t h e r n 和s 0 u t h e r n 杂交技术衍生而来的，可分为染色体原位杂 交和r n a 原位杂交。染色体原位杂交是用标记的d n a 或寡核苷酸等探针来确定目标基因在 染色体上的位置。j i n a 原位杂交是用同位素( 如3 h ，和”p 等) 或非同位素( 如地高辛( d i g ) 和生物素( b i o ) ) 等标记的双链d n a 或单链反义r n a 探针，对组织切片或装片的不同细胞 中基因表达产物m r n a ( 或r r n a ) 进行原位定位。其优点是r n a 探针的标记效率高、通透性 强、结合稳定、杂交信号强等。r n a 原位杂交的操作流程为( 以组织切片和d i g 标记r n a 探针为例) ：材料固定与包埋一制片一d i g 标记的体外转录一预杂交一杂交一杂交后处 理一免疫反应一显色反应一封片观察p “。 由于r n a 原位杂交技术能够精确确定基因表达的时空分布，从而得到了越来越广 泛的应用。r n a 原位杂交技术可用于植物特异基因表达的空间定位、非特异基因的组织 细胞定位、功能基因的研究分析、外源基因的表达定位和功能分析、基因家族的功能差 异研究以及基因的诱导表达研究等【3 3 1 ，涉及植物营养器官生长发育、生殖器官生长发育、 胚胎发生、果实和种子发育等多方面的研究。原位杂交还可为植物生长代谢、成花过程 育性转换、受精与胚胎发生等生命活动中的基因表达调控机制提供直接的资料。如w e b e r 等关于蔗糖运载体基因( v f s u t l ) 和己锫运载体基因( v f t p l ) 在蚕豆( 儿c 妇，盆6 a ) 种子发育过程中的表达特征研究，p e r a t a 等关于大麦胚胎受外源赤霉素刺激引起q 淀粉 酶m r n a 表达的研究，c o e n 等关于金鱼草控花特异基因订d 在花发育中的表达研究，h u a 等关于拟南芥5 个乙烯受体基因表达的功能差异研究，以及水稻雄蕊中磷酸化酶基因的 非特异表达等等【3 4 1 。 8 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 摹因表达比较研究 r n a 原位杂交技术经过不断的改进和优化，其应用领域得到不断扩大。尤其是在基 因分析和诊断方面可作定性、定位和相对定量分析，成为最有效的分子病理学技术。原 位杂交技术还可与其它分子生物学技术、显微操作技术、免疫学技术等相结合，研究基 因的结构、功能和表达的调控机制。发育调控基因的分离与功能分析可能会成为最热门 的课题。在这方面，国内工作起步较迟，需要进一步加以应用。 1 7 本研究目的及意义 成花过程是从植物营养生长到生殖生长的重要转折时期，成花的迟早直接影响到农 作物产量。7 慰2 基因在拟南芥中表达主要表现为延迟开花时间，其突变体则主要表现为 早花。若能清楚了解观2 基因在其他植物的表达情况，将具有重要的现实意义。在作 物繁育应用上，诱导植物早花，可缩短子代发育时间，加速育种进程。在农业生产上， 或延迟作物开花，使其维持在营养生长状态，以利于收获营养器官；或诱导作物早花， 以利于收获果实。在花卉园林种植上，诱导植物早花或延迟开花，使植物按照预定的时 间开花，达到一定的观赏效果。 一 本文以水稻和黄瓜作材料，利用r n a 探针原位杂交法，比较研究7 ) 吃? 基因在两种 植物中的表达情况，有利于进一步揭示其在植物生长发育中的功能。 2 材料与方法 2 1 材料 水稻在长日照( 1 6 小时天，2 5 ) 条件下生长9 0 天，再转入短日照条件下( 8 小时 诱导开花) 。黄瓜播种后在自然条件下生长。室温里，长日照培养5 0 天后，每7 天取样。 长日照培养9 0 天，取样，再转入短日照下培养，每7 天取样。 2 2t f l 2 蛋白质序列及相应的c d s 序列的获得及处理使用的网页： h 笪2 1 盘n q ! ：! 坠q 塾q ! ：q ! g 凸型3 1 s 墼型i p 坠：! ! 垒旦! ! 也e ；1 0 型n b i ：n ! 皿：n i h ：g q ! ! ! 丛p ；型i 妇：b i q ：p 坠：d 型匹：b i 型! 套p n 堑旦型i 娶d 基：g i 利用信息生物学方法对已报道的不同物种间刀咒2 基因的拷贝数及其与拟南芥中该 基因的相似性，以及同一物种不同刀吃2 拷贝c d s 间的相似性比较、不同物种间刀让2 c d s 相似性比较，研究植物乃琵2 基因的同源性、相似性( 文中3 1 、3 2 、3 3 部分) 。 9 广西大学硕士学位论文 水稻和黄瓜砰”基因表达比较研究 2 3 原位杂交 。 用p r o m e g a 的r n a 提取试剂盒分别提取水稻和黄瓜叶片的r n a ，o l i g ad t 反转录。 用以下引物p c r 扩增阡z 2 基因。p c r 程序：9 4 预变性3 分钟：9 4 变性3 0 秒，5 5 退火3 0 秒，7 2 延伸4 5 秒，共4 0 个循环；7 2 延伸l o 分钟。p c r 产物直接经转录 酶转录，转录产物作探针直接用于原位杂交。 采用垃：也i q 垃q ! ：i 亟d 塑：q 型，卫互堡! g 鲨型敛筮往遮让返僮盘銮拯钍鲍i i 物： 水稻原位杂交引物： t n 2 o s c d n af ：a t c c g a g a a a g a g a g g a g t a g c c a t n 2 o s c d n ar ： t a a t a c g a c t c a c t a ! r a g g g t g c a g g t c a c g a c g a t c c c a a a t a 黄瓜原位杂交引物： t f l 2 c s a 2 f ：a a c g t c t g c c c t c t g c t c c t t l l a t f l 2 c s a 2 r ：t aa t a c g a c t c a c t a t a g g g a g c c a t t g t t c t c t g t t g c c c t 2 4 原位杂交实验程序 1 、固定 ( 1 ) 准备新鲜的4 多聚甲醛固定液：4 9 多聚甲醛溶于9 0 m l 双蒸水中，再滴加入 5 滴左右的1 0 m n a 0 h ，在微波下加热至6 5 ，间或搅拌，直到多聚甲醛全 部溶解。溶液冷却至室温，加入1 0 m l1 0 p b s ，用h 2 s 0 4 调节p h 为7 0 。 ( 2 ) 在冰上冷却固定液：把植物组织切成小片放入冷的固定剂中，然后再移至盛 有1 0m l 固定剂的2 0 i i l l 玻璃闪烁管内。在管内缓陧抽真空，再缓慢释放， 约l o 分钟，使固定液渗入组织。根据材料，重复抽真空这一步的次数。把 管保存在冰箱过夜。 ( 3 ) 倒掉固定液，用冷的0 8 5 n a c l 或p b s 冲洗两次，每次3 0 分钟。 2 、脱水 ( 1 ) 5 0 酒精+ o 8 5 n a c l ，6 0 分钟 ( 2 ) 7 0 酒精+ o 8 5 n a c l ，6 0 分钟 ( 3 ) 8 5 酒精+ 0 8 5 n a c l ，6 0 分钟 ( 4 ) 9 0 酒精，6 0 分钟 ( 5 ) 无水酒精，6 0 分钟 1 0 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 ( 6 ) 无水酒精+ o 1 曙红y ( 已过滤) 过夜 3 、透明( 室温) ( 1 ) 无水酒精，两次，6 0 分钟次 ( 2 ) 7 5 无水酒精+ 2 5 二甲苯( v ，v ) ，6 0 分钟 ( 3 ) 5 0 无水酒精+ 5 0 二甲苯( v ) ，6 0 分钟 ( 4 ) 2 5 无水酒精+ 7 5 二甲苯( v ，v ) ，6 0 分钟 ( 5 ) l o o 二甲苯( v ) ，6 0 分钟 ( 6 ) 1 0 0 二甲苯( v 厂v ) ，过夜 4 、渗透( 6 0 干燥箱) ( 1 ) 1 0 0 二甲苯( v ) ，6 0 分钟 ( 2 ) 2 5 石蜡+ 7 5 二甲苯( w ) ，3 5 小时 ( 3 ) 5 0 石蜡+ 5 0 二甲苯( w ) ，3 5 小时 ( 4 ) 7 5 石蜡+ 2 5 二甲苯( w ) ，3 5 小时 ( 5 ) 1 0 0 石蜡3 1 0 天( 根据材料而定) 5 、包埋，包埋块保存在4 下) 6 、切片 把样品块切成1 0pm ，在载片上滴d e p c 双蒸水( 浮载剂) ，蜡带浮展开来( 4 5 ) 。吸去载片上多余的浮载剂，然后在4 5 烘箱内干燥过夜，再装入盒中4 保存。 7 、利用p c r ，在体外转录产生模板。 ( 1 ) 引物设计和p c r 程序 1 ) d n a 模板的p c r 引物设计：为了保证产物大约在1 5 0 一3 5 0 b p 之间， 在反引物( 为了生成反义探针) 或正引物前加上t 7 启动子 ( t a 芦l t a c g a c t c a c t a l t a g g g ) 。 2 ) 准备至少5 0 l ( 在d e p c 一双蒸水中) 的p c r 反应混合液，运行4 0 个p c r 循环。然后取1 5ul 在l 一2 琼脂糖凝胶上电泳，检测产物的 纯度并计算其浓度( 根据对照) 。 ( 2 ) 体外转录 1 )用p c r 产物提纯仪或酚氯仿抽提两次进行产物纯化。在2 8 0 啪紫 外分光仪下计算产物浓度。 2 )用lug 模板于d i g - r n a 标记仪上转录。 l i 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 3 )取1pl 产物进行电泳跑胶( o 8 1 琼脂糖，1 0 0 v 不超过3 0 分钟) ， 检测产物。产物可直接用作r n a 探针或是保存在一2 0 下。 ( 3 ) 切片预处理 去蜡的方法是：将粘贴有蜡带的载片浸泡在二甲苯中，使蜡溶解，再用 酒精溶剂处理。所有的溶液均需保证无i 斟a 酶。 1 )去蜡( 室温，r t ) 纯二甲苯，两次，1 0 分钟次 无水酒精，两次，2 分钟次 9 5 酒精，2 分钟 8 0 酒精，2 分钟 6 0 酒精，2 分钟 3 0 酒精，2 分钟 双蒸水 2 分钟 2 ) 0 2 5 m h c l5 分钟 3 )双蒸水5 分钟 4 )2 s s c1 5 分钟( s t a i l d a r ds a l i n ec i 仃a t e ，s s c ) 5 )双蒸水2 分钟 6 )蛋白酶k 处理 预热缓冲液( 1 0 0 m m o mt d s 5 0 i m 0 1 几e d t a ，p h 8 0 缓冲液中) 至3 7 ，迅速加入蛋白酶k ( 加入后浓度为l 一2 u i i l l ) 。在3 7 下 孵育3 0 分钟。 7 )1 p b s 清洗载片2 分钟，r t 8 )在p b s 配制的甘氨酸溶液中孵育2 分钟，r t 9 )p b s 清洗载片，两次，2 分钟次，r t 1 0 ) 切片在含有p b s 的4 多聚甲醛内固定1 0 分钟，r t 1 1 ) p b s 清洗载片，两次，5 分钟次，r t 1 2 ) 乙酰化 准备0 1 m 的三乙醇胺溶液 7 5 9 或6 7 m l 三乙醇胺液体溶于5 0 0 “双蒸水中。用h c l 调 节p h 至8 0 。 1 2 广西大学硕士学位论文水稻和黄瓜矾2 基因表达比较研究 把载片放入o 1 m 三乙醇胺醋酸酐溶液中1 0 分钟，搅拌。( 减低 静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色) 1 3 ) p b s 清洗载片，两次，5 分钟次。载片留放p b s 中4 直到预杂交。 8 、预杂交 ( 1 ) 准备预杂交杂交溶液 预杂交杂交溶液组成 1 0 i i l l 1 ，2 m l 2 o m l 2 on l l o 3n l l 4 om l 0 5 “ 甲酰胺 5 m n a c l 1 0 t ep h 7 5 ( 1 0 t e = 1 0 0 m mt r i s h c i ，l o m me d t a ) l o b m b 在t r i s h c l 缓冲液