（作物遗传育种专业论文）植物细胞工程在花生育种应用上的基础研究.pdf

植物细胞工程在花生育种应用上的基础研究 摘要 李美芹 1 对花生组织培养进行研究，并建立了其高效植株再生体系( 1 ) 以花生品种8 8 2 3 、 白沙果及河南农家品种成熟种胚发芽7 d 的幼叶为外植体，研究不同激素及其配比对花生 不定芽、体细胞胚、花芽及植株再生的影响。结果表明：从添加n a a 和b a p 的诱导培养 基上，转至添加b a p 和a b a 的再分化培养基上获得了5 0 一1 0 0 的不定芽发生率；当将 不定芽进一步转移至植株再生培养基上时，植株再生率最高可达1 0 0 。在添加2 ，4 一d 和 b a p 的诱导培养基上进行培养，8 9 一l o o 的外植体脱分化形成胚胎发生丛( 一团具有很强 分裂能力的细胞团及发育成体细胞胚的潜力) ，转移至添加b a p 和a b a 的再分化培养基上 时，4 3 一1 0 0 的外植体形成体细胞胚，当将体细胞胚进一步转移至植株再生培养基| = j ， 植株再生率最高可达9 6 。在添加n a a 和b a p 的基础上，添加g a 3 ，有利于花芽的分化， 花芽分化的最高频率为9 6 。对诱导过程中形成的体细胞胚和不定芽进行了组织学观察。 ( 2 ) 通过对不同花生品种及不同外植体进行不定芽的诱导，发现不同花生基因型和不同 的外植体产生不定芽的频率存在较大差异。 2 对花生原生质体分离与培养条件进行研究。以花生品种8 8 2 3 、白沙果的体细胞 胚及野生种a r a c h sc a n n a d a c i i 的嫩茎为供体，用含有p e c t o l y a s ey - 2 3 ( 0 1 ) 和c e l l u l a s e o n o z u k ar s ( 2 0 ) 的酶液处理7 小时左右，获得大量的原生质体。将原生质体培养在添加 l m g ln a a 和6 m g lb a p 的改良m s 液体培养基中，培养约2 3 天后，可观察到细胞分 裂，并形成细胞团。继续培养，形成小愈伤组织。 3 对花生与其近缘野生种间细胞融合及培养方法进行研究。将花生品种8 8 2 3 的体 细胞胚与其近缘野生种a r a c h sc a n n a d a c # 嫩茎分离得到的原生质体用p e g 方法融合， 经筛选培养后，可观察到细胞分裂，并形成小愈伤组织。 关键词花生( a r a c h i sh y p o g a e al ) ；a c a n n a d a c i i 组织培养；原生质体培养；细胞融 合；愈伤组织形成；植株再生 t h e s i si nf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro fa g r o n o m y f u n d a m e n t a ls t u d i e so nt h ea p p l i c a t i o no fp l a n tc e l le n g i n e e r i n g i np e a n u t a r a c h i sh y p o g a e al ) b r e e d i n g a b s t r a c t b y m e i q i nl i m a y2 0 0 4 t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sf o re f f i c i e n tp l a n tr e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e di n t i s s u ec u l t u r eo fp e a n u t ( a r a c h i sh y p o g a e al ) ，a n dt h eh i g hf r e q u e n c yo fp l a n tr e g e n e r a t i o nw a sa c h i e v e d ( 1 ) i m m a t u r e l e a v e sw e r ec u ti n t o1m m x lm m ，a n dc u l t u r e do nt h em s b 5 ( m ss a l t sa n db 5v i t a m i n s ) m e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t hd i f f e r e n th o r m o n e sa n dt h e i rc o m b i n a t i o n s + t h ee f f e c t so n t h ea d v e n t i t i o u s s h o o t sf o r m a t i o n ，s o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dp l a n tr e g e n e m t i o ni ny o u n gl e a ft i s s u ec u l t u r e so f p e a n u t ( a r a c h i sh y p o g a e al ) c u l t i v a rb a i s h a g u o ，8 8 2 3a n d o n eh e n n af o l kc u l t i v a rw e r es t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：y o u n gl e a fe x p l a n t sw e r ec u l t u r e do nt h em s b sm e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h1 - 5 m g ln a aa n d0 - 10 m g lb a rt h r e ew e e k sa f t e rc u l t u r e ，t h ep r o t u b e r a n c e sf o r m a t i o nw a s o b s e r v e d w h e nt h e yw e r et r a n s f e r r e do n t om s b 5m e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0m g lb a p , o r s u p p l e m e n t e dw i t h3 m g lb a pa n dim g la b a ，5 0 t o10 0 o fa d v e n t i t i o u ss h o o t sf o r m e d t h e p l a n t sr e g e n e r a t e df r o ma d v e n t i t i o u ss h o o l sa f t e rt h ea d v e n t i t i o u ss h o o t sb e i n gt r a n s f e r r e d o n t o m s b 5m e d i u ms u p p l e m e n t e db a p ( 3 ，4 ，10 m g l ) a n da b a ( 0 ，lm g l ) t h eh i g h e s tf r e q u e n c yo f p l a n tr e g e n e r a t i o nw a su pt o1 0 0 t h ey o u n gl e a fe x p l a n t sw e r ec u l t u r e d o nm sm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h1 - 3 m g t l2 , 4 一da n d1 - 6 m g lb a ph i g hf r e q u e n c y ( 8 9 t o9 6 ) e m b r y o g e n i c c l u s t e r sd e n v e df r o ml e a fe x p l a n tw e r eo b t a i n e do na l lm e d i au s e dw h e nt h e yw e r et r a n s f e r r e d o n t om sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h10m g lb a p , o rs u p p l e m e n t e dw i t h3 m g t lb a p a n d1m g l a b a 。4 3 t o1 0 0 o fc a l l iw i t he m b r y o g e n i cc l u s t e rf o r m e ds o m a t i ce m b r y o st h ee m b e r y o s g e r m i n a t e da n dd e v e l o p e di n t os h o o t sa f t e rb e i n gt r a n s f e r r e do n t om s b 5m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t hb a p ( 3 ，4 1 0 m g l ) a n da b a ( 0 1m g l ) t h eh i g h e s tf r e n q u e n c yo fp l a n tr e g e n e r a t i o nf r o m s o m a t i c se m b r y o sw a su pt o9 6 b l o s s o mf o r m a t i o nw a so b t a i n e dd e r i v e df r o ml e a fe x p l a n t sa f t e r s o m a t i ce m b r y o sb e i n gt r a n s f e r r e df r o mm s b sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h1m g ln a aa n d4 m g l b a pa n d4 m g l lg a 3o n t om s b 5m e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h4 m g lb a pa n d4 m g lg a 3 ( 2 ) t h e a d v e n t i t i o u ss h o o t sw e r ei n d u c e df m mi m m a t u r el e a v e so f2 0p e a n u tc u l t i v a r sa n dd i f f e r e n te x p l a n t s o fi m m a t u r el e a v e s ，c o t y l e d o n s 。h y p o c o t y l sa n dt h en o d e so fc o t y l e d o n ，t h er e s u l tw a sa sf o l l o w s t h ef r e q u e n c yo fa d v e n t i t i o u ss h o o t sd e p e n d e do ng e n o t y p e sa n de x p l a n t s t h ep r o t o p l a s ti s o l a t i o na n dc u l t u r ec o n d i t i o no fp e a n u tw e r es t u d i e d p r e t o p t a s t sf r o ms o m a t i c e m b r y o so f8 8 2 3a n db a i s h a g u ow e r ei s o l a t e dw i t ht h ee n z y m es o l u t i o nc o n t a i n i n g2o c e l l u l a s e o n o z u k ar sa n d0 1 p e c t o l y a s ey - 2 3 a n dt h e nc u l t u r e di nt h em o d i f i e dl i q u i dm sm e d i u m c o n t a i n e dl m g ln a aa n d6 m g l lb a p t h ef i r s tc e l ld i v i s i o nw a so b s e r v e dw i t h i n3d a y sa f t e r3 w e e k so fi n c u b a t i o n ，s o m eo fp r o t o p l a s t sd e v e l o p e di n t oc a l l i t h ep r o t o p l a s tf u s i o na n dc u l t u r eb e t w e e np e a n u ta n di t sw i l dr e l a t e ds p e c i e sw e r es t u d i e d p r o t o p l a s ti s o l a t e df r o ms o m a t i ce m b r y o so fp e a n u t8 8 2 3a n di m m a t u r es t e mo fa r a c h i sc a n n a d a c i i w e r ef u s e db yp e gm e t h o d a n dt h e nc u l t u r e di nt h em o d i f i e dl i q u i dm sm e d i u mc o n t a i n i n g1m g l n a aa n d6 m g lb a p t h ef i r s td i v i s i o no fc e l lo c c u r e e dw i t h i n3d a y s t h e ns o m eo ft h ec e l l s c o n t i n u e dt od i v i d ea n dd e v e l o pi n t oc a l l i k e yw o r d s ：p e a n u t ( a r a c h i sh y p o g a e al ) ；ac a n n a d a c i i ：t i s s u ec u l t u r e ；p r o t o p l a s tc u l t u r e ；s o m a t i c f u s i o n ；c a l l u sf o r m a t i o n ；p l a n tr e g e n e r a t i o n 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名签萎。丢 。一 签字日期：劢：牟。月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：、。j j 签字目期：9 0 年、；月? 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字：勿协砸旷 签字日期：，j 年月日 电话 邮编 致谢 本论文是在王晶珊教授的悉心指导下完成的。论文的选题、实验设司和撰写都倾注 了导师的大量心血。三年来导师不仅在科研和学业上对我悉心指导，而且在生活上给r 我无微不至的关心。导师渊博的知识、严谨的治学态度及对科研孜孜不倦的追求精神使 我终身受益。值此论文完成之际，谨向恩师致以最崇高的敬意和最诚挚的谢意! 在本研究的试验进行及论文撰写过程中，承蒙郭宝太教授、孙世盂副教授、盖树鹏 博士的悉心指导，遗传研究室宋希云教授、徐丽娟副教授、乔利仙及樊连梅_ 二位老师的 热情指导和关心，王铭伦教授、辛华副教授在花生生物学知识、显微摄影等方面给予极 大的帮助，郑芝荣教授提供研究所需的花生品种并提供幼胚材料；山东省花生研究所禹 山林研究员提供了花生野生种。在此，谨向各位老师致以最真挚的感谢! 衷心感谢学校、生命科学学院和研究生处各位老师和领导对我的关心和帮助。 感谢全体研究生和作物遗传育种实验室的所有同学们。在我的硕士论文试验过程 中，得到了同年级研究生段方猛、潘启苗、张英吴、杨金艳、冯桂芳、庄丽丽、王红梅 等同学和我的师兄师姐邢道臣、李巧云及师弟妹王相伟、刘华、于涛、黄玲、衣英华、 唐玉海、李雪梅、尼秀媚等同学的热情帮助和大力支持，在此一并致谢。 最后，向一直关怀、理解、支持我学业的爱人李光聚先生及父母家人表示最衷心的 感谢与最美好的祝愿。 李美芹 2 0 0 4 年5 月 植物细胞工程在花生育种应用l 一的箍础研究 一刚 爵 1 花生育种 1 1 花生生产的意义 花生( a r a c h i sh y p o g a e al ) 又称落花生，豆科，蝶形花弧科花生属( a r s c h i sl ) 的一年生草本植物，原产于南美洲。在世界上与人类生活攸关的栽培植物中，按其重要 性来说，花生排列第十三位( m a n g e l s d o rf 等，1 9 6 1 ) 。 中国是世界上花生产量最高、消费量和贸易量最大的国家。花生是我国唯一净出口 的大宗油料作物，一直是我国主要的油料作物和经济作物，栽培面积仪次于油菜，占油 料作物总面积的1 4 ，占总产量的4 0 ( 孙大容，1 9 9 8 ) 。山东省是我国生产花生最多的 省份，花生在山东农业和人民生活中居重要地位。 花生的用途十分广泛。花生籽仁中含有高达4 5 5 5 的脂肪和2 7 3 0 的植物蛋白 ( 王树安，1 9 9 9 ) ，居各作物之冠，具有很高的营养价值。花生油稍具峰果仁( 核桃仁) 香味，油中游离脂肪酸含量仅为0 ，0 2 0 6 ，具有气味清香、滋味纯正等特点，并且富 含不饱和脂肪酸、维生素e 等保健因子，是人们最喜爱的食用油之一。花生的蛋白质含 量高于猪肉，营养价值与动物蛋白相当，不含胆固醇和乳糖，赖氨酸含量比粮食制品高 3 5 倍，能促进儿童脑细胞发育，同时富含增强成人汜忆力的谷氨酸、天门冬氨酸。在 美国它作为人的主要食品，占有独特的位置。在其他国家花生作为食品和蛋白质来源 的地位也在日益提高。 花生可以加工成花生粉、组织蛋白、分离蛋白和浓缩蛋白。花生粉和各种蛋白又可 用来制作面包、面条、饼干及其他糕点等的添加剂，以改善食品品质并增强风味。花生 饼粕含有5 0 左右的蛋白质，高于其他饼粕，且无毒性和异昧，是食品加1 ：= 的优质原料和 农牧业中牲畜和水产养殖的优质饲料。花生的其他副产品综合利用途径也很多，在工业 上，花生果壳呵以制成板材、胶粘剂、酱油以及活性炭、糠醛、醋酸、醋石等化，原料。 植物细胞工程红花生育种应用上的罐6 出研究 在医药上，红皮花生的种皮( 红衣) 是一种中药，有很好的止血作用，可制成“止血宁” 和降低血压的药品。因此，花生是继大豆之后，又一个新兴食品工业原料。 总之。花生在改变人类食品结构，提高人民生活水平方面，将会发挥越来越大的作 用。进一步发展我国花生生产具有非常重要的意义。 1 2 花生育种基础理论研究 在花生品种资源的收集、鉴定基础上开展了有关品种性状、分类、品质等颈的研究， 在新品种选育推广过程中，对性状相关、主要性状的遗传分析以及品种的适应性和稳定 性等进行了研究。为了拓宽花生育种的遗传资源，引进了花生属近缘野生植物，开展了 种间杂交、多倍体以及克服种间杂交不育性等的研究；近年来，在花生组织培养、细胞培 养、d n a 转移及基因工程等方面也相继开展了一些研究工作，丰富并深化了花生育种的研 究内容( 孙大容，1 9 9 8 ) 。 1 3 花生育种研究进展 花生育种的主要i f l 标是选育高产、优质、抗病性强的新品种。花生育种研究进展迅 速，到2 0 0 2 年，全国收集保存的栽培种花生资源6 7 0 0 份，已进行性状鉴定和编目。郑 奕雄( 2 0 0 0 ) 选育出花生新品种汕油7 l ，王国桐( 2 0 0 2 ) 选育出优质高产花生新品种晋 花3 号，陈剑洪等( 2 0 0 3 ) 选育出高产抗青枯病花生新品种泉花l o 号，具有高产、稳 产、抗青枯病、适应广、优质等特点。生产上应用的花生品种约3 0 个，其中种植规模较 大的品种有海花1 号、白沙1 0 1 6 、鲁花9 号、鲁花l l 号、鲁花- 1 4 号、豫花7 弓、中花 4 号、天府9 号、粤油2 2 3 、汕油5 2 3 等等，全国优良品种普及率已达9 5 以上。 近年来，科研工作者又将优质与专用型花生品种选育的理念相结合，提出了优质专 用型花生新品种选育的思路，使花生优质育种范围大为拓宽，形成了出口型优质花! l 三品 种选育、加工型优质花生品种选育、油用花生品种选育、高蛋白花生品种选育、保健型 花生品种选育、甜花生品种选育等花生优质育种新思路，使花生育种工作又迈上了一个 植物细胞工程在花生育种应用上的基础 i j f 究 新台阶。 1 4 当前花生育种中存在的问题 目前，花生种质资源存在一些问题，如目前在全国推广的4 8 个花生品种中，9 3 7 5 的品种亲本是伏花生和狮头企，或是含有它们的血缘( 孙大容，1 9 9 8 ) 。由于大量的利用 它们作为杂交亲本，其遗传基础过于狭窄，产生新的变异机会越来越少，育种i = 作难以 有突破性的进展，这就需要通过各种手段进行种质创新，创造出农艺性状优良、适应性 强、配合力高、遗传基础广泛的优异新种质。花生属野生种质资源的利用将为花生育种 工作的突破性进展提供物质基础。 l ，5 花生属近缘野生植物对改良栽培花生的意义 1 5 1 花生属植物的组系划分 花生属( a r a e h i s ) 是一个大属，包括5 0 7 0 多个种，分类单位归属于豆科，蝶形 花亚科，岩黄芪族，柱花亚族。k r a p o v i c k a s 和g r e g o r y ( 1 9 9 4 ) 根据近代分类学研究结 果，将花生属植物划分为九个区组，即花生区组( a r a c h i s ) 、大根区组( c a u l o r r h i z a e ) 、 直立区组( e r e c t o i d e s ) 、围脉区组( e z t r a n e r v o s a e ) 、异形花区组( h e t e r a n t h a e ) 、 匍匐区组( p r o c u m b e n t e s ) 、根茎区组( p h i z o m a t o s a e ) 、三叶区组( t r i e r e c t o i d e s ) 、 三粒籽区组( t r i s e m i n a t a e ) 等。花生区组中只有a r a e h i s m o n t i c o a 和唯一的栽培种 即花生( a r a c h i sh y p o g a e al ) 的染色体为异源四倍体，2 n = 4 x = 4 0 。根茎区组中的真 根系s e t p h z o m a t o s a e2 n = 4 x = 4 0 。其它的花生属植物染色体皆为2 n = 2 x = 2 0 。 1 5 2 花生属野生植物的遗传多样性 花生属野生种大多为二倍体( 2 n = 2 x - 2 0 ) ，仅花生区组和根茎区组有四倍体种 ( 2 n = 4 x - 4 0 ) 。分析研究表明，野生种存在大量的遗传变异。k o c h e r t 等( 1 9 9 1 ) 利用r f l p 标记花生区组材料，并作种群分类研究，发现野生种四倍体与二倍体分离明显。花生属 野生种具有丰富的遗传多态性。h a l w a r d 等( 1 9 9 5 ) 利用二倍体野生种种间杂交( a r a c h i s 植物细胞工程杓：花生爵种应用e 的基础研究 s t e n o s p e r m a x a r a c h i sc a r d e n a s i i ) 后代群体，构建了第一个花生属野生种遗传图谱 表现出1 1 个连锁群。 1 5 3 花生属野生植物所具有的优异种质与应用前景 花生属野生植物由于长期处于野生状态，经历r 各种灾害和不良环境的自然选择 因此抗旱、耐贫瘠、抗病( 叶斑病、锈病、线虫病、斑驳病毒病、丛枝病毒病、矮化病 毒病、轻斑驳病毒病、黄瓜花叶病毒病等) 、抗虫( 蓟马、蚜虫、叶蝉、螨虫、粘虫、螟 虫等) 性强( 孙大容，1 9 9 9 ) ，利用野生种质改赵栽培花生的抗性具有重要的潜在的价值。 另外，花生属野生植物还含有优良品质基因。c h e r r y ( 1 9 9 7 ) 测定含油量为4 6 5 4 9 5 的野生种有围脉区组的爿v i l i o s u l i c a r p a ，异型花区组的a p u s i l l a ，花生区组的a c a r d e n a s i i ，根茎区组的爿b u r k a r t i i 和大根区组的爿p i n t o i ；含油量高达5 9 7 6 3 1 的材料包括直立区组的ab e n t h a m i i 和a p a r a g u a r i e n s i s 以及根茎区组的爿 g l a b r a t a 等。蛋白质古量花生区组为2 5 2 ，大根区组为2 8 2 ，异型花区组为2 7 5 。 唐荣华等( 1 9 8 9 ) 测定部分花生属野生种油酸亚油酸比值较高( 1 6 6 2 9 9 ) 。a m o n t i c o l a 蛋白质含量虽低( 1 7 9 9 ) ，但苏氨酸、赖氨酸和色氨酸含量较高，超过一般 栽培种和f a o 标准。还有些野生种( 一s t e n o s p e r m a ，a c o r r e n t i n a ，a d u r a n e n s i s ， 彳c h a c 。e ，7 s e ，a m o n t i c o l a ，a c a r d e n a s i i 和a h e l o d e s 等) 的多聚不饱和脂肪酸 饱和脂肪酸比值高于花生栽培种。因此，利用野生种质改良栽培花生的营养品质亦具有 潜在的价值和应用前景。花生属野生植物对于改良栽培花生的性状非常重要，是花牛f i 种潜在的理想基因源。 1 5 4 花生属野生种在花生育种上的利用 由于野生种花生与栽培种花生的亲缘关系较远，它们直接进行有性杂交多数不亲和。 花生属这种种问杂交不亲和性的存在，限制了花生属野生种质资源的广泛利用，尤其是 限制了同时具有抗多种病虫害等优良性状的野生种质资源的利用。国内外学者乖在试图 植物细胞工程在托生育种应用上的基础研究 以常规杂交以外的途径来转移和利用花生野生种的诸多有益基凶。这些方法包括桥交法、 植物生长调节物质处理、花粉管通道法导入外源d n a 、杂种胚营救技术、体细胞杂交法等 其中，体细胞杂交法是植物细胞工程的重要内容，而体细胞杂交法的成功应用又以相应 原生质体培养及组织培养为基础。 2 植物细胞工程的研究进展及其在花生育种上应用 2 1 花生组织培养的研究进展 细胞或组织培养是细胞工程的核心技术。植物组织培养的依据是植物细胞的全能性。 1 9 0 2 年，德国著名植物学家g h a b e r l a n c l t 根据细胞学理论，大胆地提出高等植物的器官 和组织可不断分割，直至分到单个细胞，即植物体细胞，在适当的条件下，具有不断分 裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力的观点。到1 9 4 3 年，美国w h i t e 在烟草愈伤组织 培养中，偶然发现形成了一个芽，证实了g h a b e r l a n c l t 的观点。1 9 5 8 年，首次以胡萝卜 根为外植体获得再生植株。之后，组织培养技术慢慢成熟起来。 花生组织培养研究至今已有4 0 多年的历史，有关花生组织培养的研究报道已有不 少。最初m a r t i n ( 1 9 7 0 ) 用m s 大量元素、h e l l e r 培养基的微量元素及d e l i e u 培养基的氨基 酸、维生素和水解酪蛋白( c h ) 等构成的培养基，培养花生栽培种气生果针内的胚珠( 大 约0 + 3 m m ) 获得了植株。但s a s t r i ，d c e ta l ( 1 9 8 0 ) 未能重复此实验。s t a l k e r , h t ( 1 9 8 6 ) 培养 了9 个不同基因型的花生栽培种的8 7 0 个胚珠，其中有7 0 的胚珠膨大变绿，但只有1 4 9 的胚珠达到了5 m m ，3 个胚珠获得了再生植株。罗葆兴( 1 9 8 7 ) 等报道：从花生栽培种的2 3 c m 长的果针中取出胚珠( o _ 3 0 4 r a m ) 在m s + 0 5 琼脂+ 3 蔗糖( p h 5 8 ) 的培养基上 培养1 2 周，胚珠原位萌发长出2 片小子叶，再转入m s + 0 5 m g l2 , 4 一d + o 5 琼脂+ 3 蔗 糖+ o 5 碳粉( p h 5 8 ) 培养2 0 日，形成具2 3 片复叶的花生幼苗。b a j a j ，y e s ( 1 9 8 2 ) 等 在m s + 4 m g li a a + 2 m g lk t 培养基上培养花生栽培种和a v i l l o s a 各个不同发育时期的 胚，获得了完整植株。同时他们还利用同种培养基培养亲和性杂交组合爿h y p o g a e a l 堕塑塑堕三堡垄垄生塑! 壁塑圭塑苎! ! 婴塑 a v f 肋j 授粉后3 0 5 0 目的杂种胚，获得了杂种植株。z i v 和z 锄s k i ( 1 9 7 5 ) 报道：取2 4 c m 和4 t 2 c m 的果针尖端( 约3 4 m m ) ，在m s + 0 5 m g i 。k f + o 5 2 0m g ln a a 或 m s + 0 5 m g l k i 的培养基上连续培养导致子房膨大，最终形成了荚果。封海胜等( 1 9 8 0 ) 报道：在b 5 + 6 蔗糖+ o 1 琼脂+ 2 m g ，l 赤霉素+ 3 0 0 m g l 干酪素( p h60 ) 的培养基上连 续暗培养果针尖端3 个月，形成了荚果。 近年来，花生组织培养的研究越来越系统化，分别利用小同的外植体，通过不同的 再生途径获得了再生植株。 2 1 。1 通过胚胎发生的再生途径。 s h a z r ae ta 1 ( 1 9 8 9 ) 等报道以含3 m g l2 ，4d 的m s 培养基，诱导3 6 m m 长的未 成熟种胚直接形成体细胞胚，每个外植体形成8 1 5 个体细胞胚，而n a a 没有诱导效果， b a k e re ta 1 ( 1 9 0 4 。1 9 9 5 ) 报道2 0 m g l2 ，4 - - d 效果最好，随浓度的提高，胚性愈伤形成 比例下降，光和暗培养对体细胞胚形成效率没有影响，但对体细胞胚性状影响很大。光 照条件下形成的体细胞胚粗糙，木质化，难以分离：暗培养形成的体细胞胚光滑，易于 分离，由于未成熟种胚取材受季节限制，r b i f f , 土的荚果和胚不易消毒，极易污染，及 胚性愈伤长期保存易出现变异等缺点。所以b a k e r ，c h e n g a l r a y a n 等分别以成熟种子为 材料建立通过体细胞胚发生再生植株的体系。c h e n g a l r a y a ne la l ( 1 9 9 4 ) 以胚小叶为外 植体，在添加2 0 m g l 的2 ，4 - - d 的m s 培养基上诱导胚性愈伤组织，转到添加3 m g l2 ，4 一d 的m s 培养基上2 0 天内有9 0 的愈伤产生体细胞胚，但其植株再生率为2 4 7 ：b a k e r e ta l ( 1 9 9 5 ) 人用成熟种胚作外植体诱导胚性愈伤和体细胞胚，在添加1 3 6 u m2 ，4 - 9 和 0 9 3 u mk t 的聃s 培养基上、暗培养，6 7 的外植体产生体细胞胚；l i v i i n g s t o n ee la l ( 1 9 9 5 ) 为进一步完善诱导条件，在添加5 m g lp i c l o r a m 的m s 培养基七暗培养6 周，珍珠豆 型品种6 a j a h 每个种胚平均产生6 3 个体细胞胚，普通型品种n c 一7 平均产生1 4 3 个体 细胞胚，并应用渗透剂干燥处理，使得体细胞胚萌发长出枝条百分率提高到6 0 ； 6 植物细胞工程在托生育种应用i ：的基础研究 c h e n g a l r a y a ne ta l ( 1 9 9 7 ) 人用添加2 ，4 - d 的m s 诱导培养基，转移到添加8 9 u mb a p 和1 4 u mk i n 或添加2 2 7 u mt d z 的m s 培养基上，使体细胞胚的植株再生率分别提高到 8 6 和9 2 。另外，o z i a s a k i n s ( 1 9 8 9 ) ：d u r h a m p a r r o t t ( 1 9 9 2 ) 以花生未成熟胚为外植 体、h a z r ae ta l ( 1 9 8 9 ) 以花生胚轴为外植体、b a k e r w e t z s t e i n ( 1 9 9 2 ) 以花生小叶 为外植体，均通过体细胞胚发生获得了再生植株；b a k e re ta l ( 1 9 9 4 ) 以花牛未成胚轴 和子叶为外植体，系统研究了光周期和培养基的组成对体细胞胚发生的影响：v b m h a s k e 等( 1 9 9 8 ) 研究了a b a 对体细胞胚发生的影响：c m b a k e r 等( 1 9 9 8 ) 系统研 究了小叶的叶龄和培养基对体细胞胚发生的影响。国内翟桢( 1 9 9 3 ) 及徐平丽( 2 0 0 0 ) 利用花生幼胚培养诱导体细胞胚胎发生进而获得了再生植株，董金铎( 1 9 8 9 ) 、夏连胜 ( 1 9 9 0 ) 、徐平丽( 1 9 9 9 ) 、晏立英( 2 0 0 0 ) 、周蓉( 1 9 9 9 ，2 0 0 1 ) 及张书标( 1 9 9 8 ，2 0 0 1 ) 分别通过胚轴培养、胚根培养、子叶培养、幼叶培养等诱导胚状体形成、愈伤组织形成 及植株再生也已经陆续获得成功。 2 1 2 以幼叶或胚小叶为外植体，通过器官发生的再生途径。 方小平等( 1 9 9 6 ) 以鄂花四号、中花四号等三个品种的4 天幼叶为外植体，应用 l i n g s t o n e 方法，外植体愈伤组织和芽诱导率提高到8 6 一1 0 0 ，外植体产芽数在5 个以 上：m c k e n t l y 等以花生品种f l o r i g i a n t8 d 苗龄幼叶为外植体，比较了l 、3 、5 、1 0 的 b a 浓度，得出添加5 m g lb a p 和l m g ln a a 的m s 培养基最优，9 0 以上的外植体长出愈 伤组织，其中3 8 长出芽点，转至添加5 m g lb a p 的m s 培养基上，8 4 长出枝条，参试 2 0 个品种再生效率差异明显；e a p e n 等( 1 9 9 3 ) 以1 01 2 d 的幼叶叶盘为外植体，在添 加l o u mb a p 和0 5 u mi a a 的m s 培养基上，约1 3 外植体长出枝条，平均每个外植长出 7 个；l i n g s t o n e 等( 1 9 9 5 ) 以成熟种子胚小叶为外植体，在添加3 m g lb a p 和l m g i ，n a a 的m s 培养基上培养6 周，参试两品种分别为3 0 和6 0 步b 植体长出愈伤和芽点，转到添 加5 m g lb a p 的在分化培养基上，有助于芽点伸长；方小平等人( 1 9 9 6 ) 在实验中发现 植物细胞t 程在花生育种应用上的基础研究 在添加l m g ln a a 和3 m g lb a p 的m s 培养基上，小叶经2 l 天培养形成带绿色芽点的愈 伤，转至添加5 m g l 的m s 培养基上，有利于芽点的伸长，且在培养基中添加5 0 0 m g l 羧 苄青霉素和l m g la g n o ，不但能有效抑制愈伤组织褐化坏死，且对芽分化也有一定的促 进作用：张书标等( 1 9 9 8 ) 用花生幼苗叶节为外植体，诱导产生大量的丛生芽。庄东红 等( 2 0 0 0 ) 从萌发9 d 的花生幼叶上切取中段做外植体，芽诱导率为7 8 9 ；陈由强等 ( 2 0 0 0 ) 以花生成熟胚培养成的无菌苗叶节为外植体，在高浓度的6 一队的培养基中先 诱导丛生芽，然后将诱导丛生芽转至新丛生芽诱导培养基中，诱导率为9 8 7 ：庄振宏 等( 2 0 0 1 ) 以4 d 龄的泉花1 0 号花生小叶为外植体，7 5 以上的小叶为外植体长芽点。 周敏等( 2 0 0 2 ) 研究了谷氨酰胺和硝酸银对花生幼叶芽诱导的促进作用，得知两者同时 添加时的效果最明显，芽诱导率提高到9 0 2 ，并能有效防治褐变。林荣双等( 2 0 0 3 ) 以花生实生苗幼叶为外植体，研究了t d z 对不定芽和体细胞胚的诱导，并作了组织学观 察。m c l e n t ye ta l ( 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ) ：c h e n ge la l ( 1 9 9 2 ) 分别以花生子叶、小1 - + 、叶柄、 上胚轴为外植体，通过器官发生的途径，分别获得了再生植株。 花生作为一种大粒豆科植物，通过组织培养再生植株存在很多困难。尽管近年来有 关的研究报道日益增多，通过器官发生和体细胞胚发生途径均已获得再生植株，但多数试 验集中在诱导体细胞胚或不定芽阶段，并且仍存在植株再生频率低、体细胞胚畸形等困扰； 晏立英等( 2 0 0 0 ) 报道，花生的再生与其基因型关系密切。为了使植物细胞工程成功应用 于花生育种工作，还必须对多种基因型进行研究，建立多个品种的高频率植株再生体系 为花生的遗传转化工作和植物细胞工程在花生育种上的应用奠定基础。 需要指出的是，以花生的幼芽、胚芽、叶节、茎节等存在分生组织的部位作外植体 诱导不定芽发生，可用于基因工程中建立植株再生体系，但对于去掉细胞壁后的原生质 体的培养，上述植株再生体系不适宜。通过体细胞胚胎发生途径或者由叶片、子叶等不 含分生组织的部位作外植体诱导不定芽发生获得的植株再生体系，被认为对原生质体培 植物细胞工程在花生育种应用上的摹础研究 养有重要的参考意义。所以，要想使细胞工程在花生育种上的应用成为可能，必须首先 摸索出一套适合原生质体培养的花生组织培养的有效再生体系。 2 2 原生质体培养的研究进展及其在花生育种上的应用 原生质体培养是细胞工程的一项重要内容。1 9 6 0 年c o c k i n g 首次用从j 4 v r o t h e c i u m v e r r u c a r i a 中提取的c e ll u l a s e 酶分离出大量的西红柿原生质体，为原生质体的培养开辟 了道路。1 9 7 1 年，闩本的t a k e b e 和n a g a t a 首次利用烟草叶片原生质体获得再生植株。到 1 9 7 6 年，有1 2 种植物的原生质体获得再生植株，到1 9 8 3 年增2 n n 7 0 种，1 9 8 6 年8 0 多种 n 9 0 年代初期达n l o o 种以l 较为典型的是在土豆( s h e p a r de ta l ，1 9 7 7 ) 、油菜和紫 花苜蓿( x ue ta l ，1 9 8 2 ) 、生菜( b e r r ye ta l ，1 9 8 2 ) 、菜花( v a t s y aa n db h a s k a r a h ，1 9 8 2 ) 西红柿( m o r g a na n dc o c k i n g ，1 9 8 2 ) 、玉米( f u j i m u r ae ta l ，1 9 8 5 ) 等上相继获得成功。 我国获得了3 0 个以上的植物原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经 济作物油菜( x u ，1 9 8 2 ) 、马铃薯( 李更光等，1 9 8 8 ) 、大豆( w e ia n dx u ，1 9 8 8 ；罗希明 等，1 9 9 0 ：s a r w a n ，k d 等1 9 9 1 ，1 9 9 2 ：王连铮等，1 9 9 2 ；张贤泽等，1 9 9 3 ；肖文言等 1 9 9 4 ) 、水稻( w a n g 等，1 9 8 9 ) 、玉米( 蔡起贵等，1 9 8 7 ；r h o d e s ，c a ，等，1 9 8 8 ；s h i l l i t o ，r ，d 等，1 9 8 9 ：p r i o l i ，l m 等，1 9 8 9 ；孙敬三等，1 9 8 9 ：施介村等，1 9 9 1 ；p e t e r s e n ，w 【。 等，1 9 9 1 ；张宏等，1 9 9 8 ) 、小麦( 王海波等，1 9 8 9 ：任延国等，1 9 8 9 ：郭光沁等，1 9 9 0 d u p u i s 等，1 9 9 0 ；v a s i