（内科学专业论文）白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肾损伤的保护作用.pdf

目录 中文摘要0 00o o i m00 00oio 0000oo oo00 1 英文摘要5 研究论文白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肾损伤的保护作用 前言”一“9刖舌“一”“一“一一“一“一”一“”一”一“”“一“一“”“9 材料与方法lo 结果- 2 4 附图2 8 附表q ooooo 3 8 讨论- 3 9 参考文献4 3 综述- 一4 7 致 身 o ooooo 6 0 个人简历6 l 中文摘要 白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肾损伤的保护作用 摘要 梗阻性黄疸( o b s t r u c t i v e j a u n d i c e ，o j ) 导致肠黏膜屏障功能损伤，从 而产生一系列并发症，如败血症和肾功能衰竭等。o j 引起肾功能损害的 原因未明，可能是由于严重肝功能障碍导致肾脏的血流动力学改变所致， 其肾脏血流动力学改变的特征是：肾内血管收缩，肾脏血流重新分布，血 流自肾皮质向髓质分流，肾皮质缺血，肾小球入球小动脉收缩，肾小球滤 过率下降。另外，o j 时可产生肠源性内毒素血症( e n d o t o x e m i a 。e t m ) ， 胆道梗阻时由于细胞外液及细胞内液的减少以及存在的内毒素血症从而 引起氧自由基增多，导致体内活性氧蓄积并对机体产生损伤作用，机体抗 氧化机制不足以清除过多的氧自由基，产生氧化应激损伤而加重肾功能损 害。 血红素加氧酶( h e m eo x y g e n a s e ，h o ) 是血红素分解起始代谢的限速 酶。h o 在降解血红素的过程中减少活性氧类物质的产生。在这个过程中 它可以产生相同量的一氧化碳和胆绿素，同时释放出铁离子。临床研究表 明血红素的增加可以导致急性肾小管坏死，而h o 系统可以减少肾组织损 害。h o 有三种亚型，h o 1 、h o 2 、h 0 3 ，其中h o 1 为可诱导型。h 0 1 在氧化应激反应的诱导下产生并对抗氧化应激的损伤。血红素的代谢产物 一氧化碳、胆绿素和铁离子均具有抗氧化和抗细胞凋亡的作用。 白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，r e s ) 是一种在桑椹、葡萄和红酒中发现并提 取出来的多聚苯复合物，已经有研究发现白藜芦醇通过诱导h o 1 的表达 表现出广泛的生物作用包括抗氧化、抗癌及抗炎症作用。 目的：本实验通过研究o j 大鼠肾脏h o 1 、z o 1 、o c c l u d i n 表达水平及 其在损伤中的作用，探讨白藜芦醇对b d l 大鼠肾脏h o 1 水平的影响及其 在氧化应激损伤中的保护作用及机制。 方法：采用健康雄性w i s t a r 大鼠，b d l 方法制备动物模型，共6 0 只。 白藜芦醇用1 羧甲基纤维素钠制成白藜芦醇混悬液。随机分为5 组：假 手术组( s h a mo p e r a t i o n ，s o ) ，胆总管结扎组( b d l ) ，胆总管结扎+ 溶剂 组( b d l + v e h i c l e ) ，胆总管结扎+ 不同浓度白藜芦醇组( 1 0m g j k g ，2 0 中文摘要 m g k g ) ( b d l + r e s1 0m g k g ，2 0m g k g ) 。分别于术后1w k 、2w k 留取标 本。采用h e 染色观察肾脏形态学变化；透射电镜观察肾脏的超微结构； 鲎试剂终点显色法检测血浆内毒素( e n d o t o x i n ，e t ) 含量；硫代巴比妥酸 法检测肾组织匀浆中丙二醛( m a l o n a l d e h y d e ，m d a ) 含量、黄嘌呤氧化酶 法测定超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 。s o d ) 的活力；原位缺口 末端标记技术即t u n e l 染色检测肾脏细胞凋亡情况；免疫组织化学( s p ) 法检测h o 。l 及紧密连接蛋白z o 1 、o c c l u d i n 的表达与定位；r e a lt i m ep c r 和w e s t e r nb l o t 方法检测h o 1 在肾脏的表达水平。 结果： ( 1 ) 肝功能结果证明b d l 大鼠模型制作成功。 ( 2 ) 光镜下肾组织病理学显示：b d l 组和b d l + v e h i c l e 组大鼠于胆管 结扎术后1w k 肾近曲小管上皮细胞开始出现轻度肿胀，术后2w k 肾近曲 小管上皮细胞水肿较1w k 时加重。r e s 治疗后肾近曲小管上皮细胞较单 纯b d l 组水肿轻。 ( 3 ) 透射电镜观察肾脏超微结构：b d l 组和b d l + v e h i c l e 组大鼠于胆 管结扎术后1w k 时。肾小球滤过屏障表现为基底膜轻度增生，足突及内皮 细胞轻度增生融合，近曲小管线粒体大部分嵴和膜融合，可见空泡。粗面 内质网有轻度颗粒融合和脱颗粒现象；术后2w k 肾小球滤过膜病变加重， 足细胞和基底膜重度增生，融合成一片，血管内皮细胞重度增生，近曲小 管细胞质内可见大量髓样化致密化的线粒体。r e s 组线粒体正常，但粗面 内质网仍可见融合和脱颗粒现象。 ( 4 ) 大鼠血浆内毒素( e n d o t o x i n ，e t ) ：b d l 组e t 水平在各时段明 显高于s o 组( 氏o 0 1 ) ，r e s1 0m g l ( g ，r e s2 0m g k g 组大鼠术后2w ke t 水平低于同时段b d l 组( 尸 o 0 5 p o 0 1 ) 。 ( 5 ) 内生肌酐清除率( c r e a t i n i n ec l e a r a n c e ，c c r ) 和尿白蛋白排泄率 ( u r i n a r ya l b u m i ne x c r e t o r y ，u a e r ) ：与s o 组比较，b d l 组血清c c r 水平 在术后2w k 时明显下降( 尸 o 0 1 ) ，u a e r 水平于术后1w k 时明显升高 ( 尸 o 0 1 ) ，2w k 时更显著( 尸 o 0 0 1 ) 。b d l + r e s2w k 治疗组c c r 水平 较同时相b d l 组与b d l + v e h i c l e 组升高( 尸 o 0 5 ) ，u a e r 水平下降 ( 尸 o 0 5 ) 。 ( 6 ) 肾组织m d a 、s o d 含量的变化：b d l 组肾组织脂质过氧化产物 中文摘要 m d a 水平在各时段明显高于s o 组( 尸 o 0 1 ) ，s o d 活力明显低于s o 组( 尸 o 0 1 ) ；r e s 组大鼠术后2w km d a 水平低于同时段b d l 组( p o 0 5 ) ， s o d 活力明显高于同时段b d l 组( p o 0 1 ) ，但各治疗组无明显差别 ( 胗o 0 5 ) 。 ( 7 ) 肾组织z o 1 、o c c l u d i n 免疫组织化学检测：b d l 大鼠术后2w k 肾脏z o 1 阳性细胞数减少，光密度( o d ) 值b d l 组( o 1 04 - 0 0 2 ) 明 显低于s o 组( 0 1 74 - 0 0 0 ) ( 尸 o 0 1 ) ，b d l + r e s 组( o 1 24 - 0 0 1 ，0 1 2 4 - o 0 1 ) 较同时段b d l 组增加( 尸 o 0 5 ) ；b d l 大鼠术后2w k 肾脏o c c l u d i n 阳性细胞数减少，o d 值 b d l 组( 0 0 94 - 0 0 2 ) 明显低于s o 组( o 1 44 - 0 0 1 ) ( p o 0 1 ) ，b d l + r e s 组( o 1 24 - 0 0 1 ，0 134 - 0 0 1 ) 较同时段b d l 组增加( 尸 o 0 5 ) 。 ( 8 ) 肾组织h o 1 免疫组织化学检测：b d l 大鼠在术后2w k 大鼠。肾 脏h o 1 阳性细胞数及细胞浆内黄染颗粒增加，o d 值b d l 组( o 1 44 - 0 0 1 ) 明显高于s o 组( 0 0 5 - 4 - 0 0 1 ) ( 尸 o 0 1 ) ，b d l + r e s 组( 0 2 44 - 0 0 3 ，0 1 7 4 - 0 0 1 ) 与b d l 组比较明显升高( p o 0 1 ) ，1 0m g 组好于2 0m g 组。 ( 9 ) w e s t e r nb l o t 印迹半定量检测肾组织h o l 表达：w e s t e r n 印迹分 析显示约相对分子质量3 2 k d a 处可见杂交蛋白条带，2w k 组b d l 组a 值百分比( h o 1 g a p d h ) ( o 6 34 - 0 0 6 ) 高于s 0 组( o 2 54 - 0 0 7 ) ( 尸 o 0 1 ) ， b d l + r e s1 0 m g k g 治疗组( o 8 14 - o 0 5 ) 高于同时段b d l 组( 氏o 0 1 ) ， 1 0m g 组好于2 0m g 组。 ( 1 0 ) r e a lt i m ep c r 分析结果显示：b d l 组大鼠肾组织h o 1m r n a 表达( 3 7 64 - 0 7 7 ) 高于s o 组( 1 0 04 - 0 0 0 ) ( 尸 o 0 5 ) ，b d l + r e s1 0m g & g 组( 6 1 34 - 1 2 9 ) 与同时段b d l 组比较升高( 尸 o 0 5 ) ，1 0m g 组好于2 0m g 组。 结论： ( 1 ) 梗阻性黄疸大鼠存在内毒素血症、。肾脏氧化应激损伤和肾脏细胞凋 亡。 ( 2 ) 梗阻性黄疸大鼠肾脏上皮细胞间紧密连接蛋白表达减少。 ( 3 ) 梗阻性黄疸大鼠肾脏h o 1 蛋白及m r n a 表达增多。 ( 4 ) 白藜芦醇可以通过诱导肾脏h o 1 的表达来达到抗氧化应激、抗凋 3 中文摘要 亡的作用。 关键词：白藜芦醇；梗阻性黄疸；肾脏；血红素加氧酶；紧密连接； 细胞凋亡；氧化应激；内毒素；内生肌酐清除率 英文摘要 t h e p r o t e c t i v ee f f e c to f r e s v e r a t r o l o nr e n a li n j u r yo fr a t sw i t ho b s t r u c t i v ej a u n d i c e a b s t r a c t o b s t r u c t i v e ja u n d i c e ( o j ) r e s u l t s i ni n t e s t i n a lm u c o s a lb a r r i e r d y s f u n c t i o nw i t hc o n s e q u e n tas e r i e so fc o m p l i c a t i o n s ，s u c ha ss e p t i c a e m i a a n df e n a lf a i l u r e h o w e v e r , t h ec a u s e so fr e n a lf u n c t i o ni m p a i r m e n td u r i n go j a r es t i l lu n c l e a r t h ed i s t u r b a n c eo fr e n a lh e m o d y n a m i c sc a u s e db ys e v e r e l i v e rd y s f u n c t i o nm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e n a lf u n c t i o ni m p a i r m e n t t h ec h a r a c t e r i s t i c so fr e n a lh e m o d y n a m i c sd u r i n go jw e r ea sf o l l o w i n g ： c o n s t r i c t i o no fi n t r a r e n a lb l o o dv e s s e l s ，r e d i s t r i b u t i o n o fr e n a l b l o o d ， d i f | f l u e n c eo fb l o o df l o w e df r o mr e n a lc o r t e xt om e d u l l a ，c o r t e xi s c h e m i a ， c o n s t r i c t i o no fa f f e r e n tg l o m e r u l a ra r t e r i o l ea n dg l o m e r u l a rf i l t r a t i o n r a t e ( g f r ) d e c r e a s e d h e m eo x y g e n a s e ( h o ) p l a y sac r i t i c a lr o l ei na t t e n u a t i n gt h ep r o d u c t i o n o fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e st h r o u g hi t sa b i l i t yt od e g r a d eh e m ei na ne n z y m a t i c p r o c e s st h a tl e a d st ot h ep r o d u c t i o no fe q u i m o l a ra m o u n t s o f c a r b o nm o n o x i d e ( c 0 _ ) a n db i l i v e r d i o f o i l i r u b i na n dt h er e l e a s eo ff r e ei r o n c l i n i c a ls t u d i e sh a v e s h o w nt h a th e m ea d m i n i s t r a t i o nc a l ll ：r e c i p i t a t ea c u t et u b u l a rn e c r o s i sa n dt h a t t h eh o s y s t e mr e d u c e dt i s s u ei n j u r yi nt h ek i d n e y h o 一1i si n d u c e db y o x i d a n t s t r e s s ，a n dar o b u s ti n c r e a s ei nh o 一1e x p r e s s i o np r o v i d e sp r o t e c t i o na g a i n s t o x i d a t i v ei n s u l t s h e m ed e g r a d a t i o np r o d u c t s ，c o ，b i l i v e r d i n b i l i r u b i na n d i r o n f e r r i t i n ，p o s s e s sp o t e n ta n t i o x i d a n tp r o p e r t i e sa n da n t i a p o p t o t i c e f f e c t s r e s v e r a t r o l ( 3 ，4 ，5 - t r i h y d r o x y s t i l b e n e ) ，ap o l y p h e n o l i cc o m p o u n d f o u n d i nm u l b e r r i e s ，g r a p e sa n dr e dw i n eh a sb e e nr e p o r t e dt oe x h i b i taw i d er a n g e o fb i o l o g i c a la c t i o n st h a t i n c l u d ea n t i o x i d a n te f f e c t ，a n t i c a r c i n o g e n e s i s ， a n t i i n f l a m m a t o r y e f f e c t sa n da n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s v i a i n d u c i n g t h e e x p r e s s i o no f r i o 一1 o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c ta n di t sp o s s i b l em e c h a n i s mo f r e s v e r a t r o lo nr e n a li n j u r yi n d u c e db yb i l ed u c tl i g a t i o n ( b d l ) i n r a t s 5 英文摘要 m e t h o d s ：o b s t r u c t i v ej a u n d i c er a t sw e r ei n d u c e dw i s t a rr a t sb yb d l k i d n e y si na l lg r o u p sw e r eh a r v e s t e da tf i x e dt i m ep o i n t s ：1w k ，2 w ka f t e r o p e r a t i o no rs h a mo p e r a t i o n s i x t yr a t sw e r er a n d o m i z e dt of i v eg r o u p s ：r a t s w i t hs h a mo p e r a t i o n ，r a t sw i t hb d l ，r a t sw i t hb d la n dt r e a t e dw i t hv e h i c l e ， r a t sw i t hb d la n dt r e a t e dw i t hr e s v e r a t r o l10m g k ga n d2 0m g k g t h er e n a l t i s s u ec h a n g e so fb d lr a tw e r ee x a m i n e db yp a t h o l o g ya n de l e c t r o n m i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n a s s a ye n d o t o x i nl e v e l so fp l a s m ai ne n d p i o i n t c h r o m o g e n i ct a l m e t h o d t h e2 4h o u ru r i n ea n ds e r u mo fr a t sw e r eu s e df o r d e t e r m i n i n gt h ec r e a t i n i n ec l e a r a n c er a t ( c c r ) ，m a l o n a l d e h y d e ( m d a ) a n d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) w e r em e a s u r e d t h er e n a la p o p t o t i ci n d e xw a s d e t e c t e db yt e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dd u t pn i c ke n d - l a b e l i n g ( t u n e l ) h o - 1p r o t e i ne x p r e s s i o ni nt h ek i d n e yw a sd e t e r m i n e db y w e s t e r nb l o t ，h o 一1m r n ae x p r e s s i o ni nt h ek i d n e yw a sd e t e r m i n e db y r e a l t i m ep c r a n dt h ed i s t r i b u t i o no fh o 一1a n dt i g h tj u n c t i o np r o t e i nz o 一1 a n do c c l u d i ni nt h ek i d n e yw a sa s s e s s e di m m u n o h i s t o c h e m i s t i c a l l y r e s u l t s ：( 1 ) s e r u m1 i v e rf u n c t i o n1 e v e l so fr a t se s t a b l i s h e dt h eb d lr a t s ( 2 ) r e n a lp a t h o l o g i c a lc h a n g e ss t a i n i n gb yh es h o w nt h a tt h e r ew a se d e m a t u s i nr e n a lt u b u l ee p i d e r m i si n1w kb d lr a t sa n dw a sw o r s ei n2w k ( 3 ) i r r e g u l a rt h i c k e n i n go fg l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e ，m e s a n g i a le x p a n s i o n a n df u s i o no ff o o tp r o c e s s e sw e r eo b s e r v e da t1w ka n dw a sw o r s em o r ea t2 w kb ye l e c t r o n m i c r o s c o p e ( 4 ) t h ee n d o t o x i nl e v e l s o fp l a s m ai ns h a m o p e r a t i o n ，1w ka n d2w kb d l r a t sw e r e0 1 5 士o 2 9 ，o 4 44 - o 1 4a n d0 5 34 - o 0 3 t h ep l a s m ae n d o t o x i na t1w ka n d2w ks i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t h s h a mo p e r a t i o n ( 尸 o 0 5 ) ( 5 ) t h ec c rw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n2w k g r o u pr a t s ，t h eu r i n a r ya l b u m i ne x c r e t o r yr a t e sw e r ei n c r e a s e di n1w ka n d2 w k g r o u pr a t s ( 6 ) m d ai n1w k a n d2w ks h a mo p e r a t i o n ，1w ka n d2w kb d l r a t sw e r e1 8 34 - 0 7 9 ，2 3 94 - 0 9 6 ，3 8 84 - 0 2 3a n d4 8 24 - 0 1 6 1w ka n d2w k s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t hs h a mo p e r a t i o n ( p 0 0 5 ) ，s o da tlw ka n d2w k s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dw i t hs h a mo p e r a t i o n ( 尸 0 0 5 ) ( 7 ) t h ep r o t e i nz o - 1 a n do c c l u d i ni nk i d n e yo fr a t sb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya s s a y ：e x p r e s s i o no f z o 一1p r o t e i n ( o p t i c a ld e n s i t y , o d ) i ns h a mo p e r a t i o na n d2w kb d lr a t sw e r e 6 英文摘要 o 17 士o 0 0a n d0 104 - o 0 2 ，2w k s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t hs h a mo p e r a t i o n h o w e v e r , t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eo fz o 1p r o t e i nb e t w e e nt h es h a m o p e r a t i o na n d1 w kb d l r a t s ，a n dt h a to ft r e a t e dw i t hr e s v e r a t r o la t2w k i n c r e a s e dw i t hb d la t2w k ；e x p r e s s i o no fo c c l u d i np r o t e i n ( o d ) i ns h a m o p e r a t i o na n d 2w kb d lr a t sw e r e0 1 44 - 0 01a n d0 0 94 - 0 0 2 t h ee x p r e s s i o n o fo c c l u d i na t2w ks i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t hs h a mo p e r a t i o n h o w e v e r , t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eo fo c c l u d i np r o t e i nb e t w e e nt h es h a m o p e r a t i o na n dl w kb d lr a t s ，a n dt h a to ft r e a t e dw i t hr e s v e r a t r o la t2w k i n c r e a s e dw i mb d la t2w k ( 8 ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a la n a l y s i s ：i tw a sf o u n d t h a ti nt h ek i d n e yo ft h e2w kb d l r a t ，t h en u m b e r so fh o 1p o s i t i v ec e l l s w e r ei n c r e a s e d e x p r e s s i o n so fh o - 1 p r o t e i n ( o p t i c a ld e n s i t y ) i ns h a m o p e r a t i o n ，1w ka n d2w kb d l r a t sw e r e ( 0 0 7 士0 o o ) ，( o 0 84 - o 01 ) a n d ( o 1 4 士0 01 ) ，2w ks i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t h1w ko rs h a m o p e r a t i o n h o w e v e r ， t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eo fh o 1p r o t e i nb e t w e e nt h es h a mo p e r a t i o n a n d1w kb d lr a t s 怍o 18 ) ( 9 ) w 色s t e r nb l o ta n a l y s i s ：h o 1e x p r e s s i o ni n s h a mo p e r a t i o n ，a n d2w kb d lr a t sw e r e ( o 2 5 0 0 7 ) a n d ( o 6 3 + 0 0 6 ) ，t h e e x p r e s s i o no fh o la t2w ks i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t hlw ko rs h a m o p e r a t i o n h o w e v e r , t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eo fh o 1p r o t e i n b e t w e e nt h es h a mo p e r a t i o na n d1w kb d l r a t s ( e = - o 611 ( 1 0 ) r e a l t i m ep c r a n a l y s i s ：h o 一1m r n ae x p r e s s i o ni ns h a mo p e r a t i o n ，1w ka n d2w kb d lr a t s w e r e ( 1 o o4 - 0 0 0 ) ，( 1 0 54 - 0 0 3 ) a n d ( 3 7 64 - o 7 7 ) ，t h ee x p r e s s i o no fh o 1 m r n aa t2w k s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw i t h1w ko rs h a mo p e r a t i o n h o w e v e r , t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eo fh o 1m r n ab e t w e e nt h es h a mo p e r a t i o n a n d1w kb d l r a t s ( p = o 9 7 ) c o n c l u s i o n s ： ( 1 ) t h em e c h a n i s mo fr e n a li n j u r yi n d u c e db vb d li nr a t si n c l u d e s e n d o t o x e m i a ，o x i d a t i v es t r e s s ，a p o p t o s i s ( 2 ) t h ep r o t e i nz o 1 ，o c c l u d i no ft h er e n a le p i t h e l i a lc e l la r ed e c r e a s e d i nt h eo b s t r u c t i v ej a u n d i c er a t s ( 3 ) t h ep r o t e i na n dm r n ao fr i o 1i nt h ek i n d e yo fo b s t r u c t i v ei a u n d i c e r a t si si n c r e a s e d 7 英文摘要 ( 4 ) r e s v e r a t r o lh a st h eb e n e f i c i a le f f e c to nr e n a li n j u r yb yb d li nr a t s v i ai n d u c i n gt h ee x p r e s s i o no fr i o - 1 k e yw o r d s ：r e s v e r a t r o l ；o b s t r u c t i v ej a u n d i c e ；k i d n e y ；h o 一1 ；t i g h t j u n c t i o n ；a p o p t o s i s ；o x i d a t i v es t r e s s ；e n d o t o x i n ；c c r 8 研究论文 白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肾损伤的保护作用 - 上- 一 刖舌 梗阻性黄疸( o b s t r u c t i v ej a u n d i c e ，0 j ) 是一种主要由胆道结石、胆管 狭窄、胆管癌、壶腹周围癌等引起的临床征象。o j 导致肠黏膜屏障功能 损伤，从而产生一系列并发症，如败血症和肾功能衰竭等。急性肾衰竭 ( a c u t er e n a lf a i l u r e ，a r f ) 是梗阻性黄疸患者常见的死亡原因之一。 o j 引起肾功能损害的原因未明，可能是由于严重肝功能障碍导致。肾 脏的血流动力学改变所致，其肾脏血流动力学改变的特征是：肾内血管收 缩，肾血流重新分布，血流自肾皮质向髓质分流，肾皮质缺血，肾小球入 球小动脉收缩，肾小球滤过率下降。o j 时可产生肠源性内毒素血 ( e n d o t o x e m i a ，e t m ) ，o j 时由于细胞外液及细胞内液的减少以及存在的 内毒素血症从而引起氧自由基增多，导致体内活性氧蓄积并对机体产生损 伤作用，机体抗氧化机制不足以清除过多的氧自由基，产生氧化应激损伤 而加重肾功能损害。肾脏氧化应激时导致a t p 缺乏，由此导致肌动蛋白细 胞骨架的改变，从而导致紧密连接破坏，肾小管通透性改变。 血红素加氧酶( h e m eo x y g e n a s e ，h 0 ) 是血红素分解起始代谢的限速 酶，通过降解血红素产生一氧化碳( c 0 ) 、胆绿素( b i l i v e r d i n ) 和铁离 子( i r o n ) 。胆绿素进一步经胆绿素还原酶作用生成胆红素，而铁离子诱 导铁蛋白的合成。h o 是目前发现的生物体内最易被诱导产生的抗氧化酶 类，其抗氧化作用与它的降解产物c o 、胆红素、铁离子有关。 白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，r e s ) 即3 ，5 ，8 三羟基二苯乙烯，属于黄酮 类化合物，是一种重要的植物抗毒素和抗氧化剂，可以抵御活性氧介质对 d n a 的损伤并且防止细胞膜发生脂质过氧化反应，可以抗炎、抗过敏和 抗诱变。近年来，越来越多的研究表明白藜芦醇对许多器官、组织、细胞 都具有保护作用，白藜芦醇作为一种抗氧化剂，具有清除氧自由基抑制 n f k b 激活作用。实验证实r e s 部分药理作用是通过诱导h 0 1 的表达发挥 细胞保护作用及抗炎症、抗氧化效应，从而达到抗癌或其他保护作用。 本试验通过对胆总管结扎大鼠梗阻性黄疸模型的建立，鲎试剂终点显 色法检测血浆内毒素( e n d o t o x i n ，e t ) 含量，硫代巴比妥酸法测定丙二醛 研究论文 ( m a l o n a l d e h y d e ，m d a ) 的含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 活力，光镜及电镜观察梗阻性黄疸大鼠肾 脏形态学及超微结构的改变，t u - n e l 染色检测肾脏细胞凋亡情况，用免 疫组织化学( s p ) 法检测h o 1 及紧密连接蛋白z o 1 、o c c l u d i n 的表达与定 位，r e a lt i m ep c r 和w e s t e r nb l o t 方法检测h o 1 在肾脏的表达水平。旨在 探讨梗阻性黄疸大鼠肾脏h o 1 、z o 1 、o c c l u d i n 表达水平及其在损伤中的 作用，并探讨白藜芦醇对b d l 大鼠肾脏h o 1 水平的影响及其在氧化应激 损伤中的保护作用及机制。 材料与方法 l 材料 1 1 实验动物：选用选用清洁级成年健康雄性w i s t a r 大鼠，体重2 5 0 - 士2 5 9 克，由河北医科大学实验动物中心提供( 合格证编号：9 0 3 1 9 4 ) 。全部动 物均在同一实验室按清洁级大鼠要求专人饲养，自由进食水。实验过程符 合中华人民共和国的实验动物管理条例及伦理要求。 1 2 仪器 a p 2 5 0 d o 电子天平 h z y - c 1 0 0 0 型电子天平 a l 2 0 4 型电子天平 d e u 阪3 2 0 型p h 计 d y 8 9 1 无机调速电动匀浆机 l q p b 4 颗粒制冰机 t s 1 脱色摇床 h q 6 0 漩涡混合器 b c f c o 电热恒温水浴箱 h h 1 型恒温水浴锅 海尔l c 1 5 9 冰箱 海尔b c d 2 5 9 幻a 冰箱 美国o h a u s 公司 福州华志科学仪器有限公司 m e t t l e rt o l e d o ( 上海) 公 司 m e t t l e rt o l e d o ( 上海) 公 司 浙江省宁波新字医疗仪器厂 上海世义精密仪器有限公司 江苏海门市麒麟医用仪器厂 北方同正生物技术有限公司 北京市长风仪器仪表厂 江苏省金坛市宏华仪器厂 青岛海尔集团 青岛海尔集团 研究论文 负8 0 度超低温冰箱 y b l 2 生物组织包埋机 y t 6 生物组织摊烤机 h m p 1 1 0 组织脱水机 h m 3 1 5 组织切片机 c h k 2 f g s 显微镜 o l y m p u sb x 5 1 显微镜 7 2 1 分光光度计 u v 2 0 0 0 型分光光度计 d y y - 8 c 型双稳定时电泳仪电源 d y y - 7 c 型转印电泳仪电源 d y c z 2 4 d n 型双垂直电泳仪 d y c z 4 0 d 型迷你转印槽 s f 2 0 0 型塑料封接机 d l p 1 4 a 型自动洗片机 u n i v e r s a l 1 6 r 高速台式 冷冻离心机 a l l e g r a6 4 r a n da v a n t i3 0c o m p a c t 高速台式冷冻离心机 1 3 试剂 白藜芦醇 多克隆兔抗z o 1 抗体 多克隆兔抗o c c l u d i n 抗体 多克隆兔抗h o 1 抗体 兔抗g a p d h 多克隆抗体 鲎试剂盒 s p 试剂盒 d a b 显色试剂盒 e c l 发光试剂盒 p v d f 膜 考马斯亮蓝g 2 5 0 日本s a n y o 公司 孝感亚光医用电子技术研究所 孝感亚光医用电子技术研究所 德国w a l l d o r f 公司 德国w a l l d o r f 公司 日本o l y m p u s 公司 日本o l y m p u s 公司 上海第三分析仪器厂 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 中国江苏连云港微波电器厂 苏州德力影像设备科技有限公司 德国h e t t i c he n t r i f v g e n 公司 美国b e c k m a n 公司 美国s i g m a 公司 z y m e dl a b o r a t o r i e s 公司 z y m e dl a b o r a t o r i e s 公司 加拿大s t r e s s g e n 公司 美国s a n t ac r u z 公司 湛江安度斯生物有限公司 北京中山生