（农业昆虫与害虫防治专业论文）昆虫病原线虫steinernema+feltiae液体培养研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 章孝7 k 时间：p 厂年，月，日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：章串 j (时间：) 一帅年月f 忙日 导师签名：时间： p 8 年月f 妒 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 昆虫病原线虫作为一种新型的生物防治因子，其能否人工大量培养在线虫生物防治 应用中起着决定性作用。在前人工作的基础上，本文利用二次正交旋转组合设计，对昆 虫病原线虫液体培养基组分及其配比和培养参数的选择和确定进行了较为系统的研究。 根据二次正交旋转组合设计试验，选用六种培养基组分以不同的组合培养，对 s 跆加e 埘e m 口斥，妇e ( 0 t i o ) 进行产量分析并寻找出六种培养基组分的最佳编码值。根据 培养参数的测定来发挥线虫液体培养的最大潜能。试验结果表明，六种培养基组分的最 佳水平编码值分别为1 ，1 ，1 ，o ，o ，2 ；接菌量、接线虫量和培养时间三个培养参数的 水平编码值分别为0 ，1 ，0 时，线虫产量达到最高值。 经过对两种方式培养出的线虫的比较，活体培养和液体培养线虫对大蜡螟的致死中 浓度分别为2 3 4 i j s m l 和2 5 3 l j s m l ，线虫的酯酶同功酶电泳酶带的迁移率分别为 0 4 3 5 、0 1 5 3 和0 4 2 4 、o 1 4 1 ，说明昆虫病原线虫的生物活性在经过人工液体培养后没 有发生明显的改变。 为了筛选出更多的昆虫病原线虫种质资源来进行人工大量培养，本文选用五种线虫 品系测定对大蜡螟羧酸酯酶活性的影响，同时观察线虫及其共生菌对东北大黑鳃金龟3 龄幼虫的毒杀作用。结果发现，在0 r t i o ，a 2 4 ，1 5 2 ，n c 3 4 和h z 五个线虫品系中，经 n c 3 4 和o t i o 品系线虫处理的大蜡螟n 。n a 羧酸酯酶的活性最高，分别是c k 的2 0 4 7 倍和1 9 6 5 倍；而经o t i o 品系线虫处理的大蜡螟b _ n a 羧酸酯酶活性最高为c k 的1 1 4 9 倍。在对蛴螬生物测定的试验中，线虫的毒杀作用明显高于共生菌单独作用的效果， n c 3 4 品系线虫在浓度为5 0 0 0 u s ，m l 的接虫量时的校正死亡率高达7 3 3 3 。 关键词：昆虫病原线虫；共生菌：二次正交旋转组合设计；液体培养 a b s t r a c t a b s t r a c t a r t i f j c i a lm a s sr e a r i n go fe n t o n l o p a t l l o g e l l i cn e m a t o d e sp l a y sad e c i s i v em l ei nt h e a p p l i c a t i o no fe m o m 叩a t h o g e n i cn e m a t o d ew h i c hi sak i n do fn e w t y p eb i 0 1 0 9 i c a lc o n t r o l a g e n t t h et l e s i ss t u d i e ds y s t e m a t i c a l l yo nt h es e l e c t i o no fl i q u i dc u i t u r ei n g r e d i e n t sa i l d c u l t u r a 】p a r 锄e t e r so fe n t o i n 叩a t 壬l o g e n i cn e m a t o d e su t i l i z i n gq i l a d i 眦i cr c g r c s s i o no n h o g o n a l r o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g n s i xl i q u i dc u l t ei n g r e d i e m sh a db c c ns e l e c t c dw 岫d i 腧r e n tc o m b i n a t i o nb a s e do n q u a d r a t i cr e 伊e s s i o no n h o g o l l a lr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i 鼽n eb e s th o r i z o n t a lc o d ev a l u e w a sf o u n do u td e p e n d i n go nt 1 1 ey i e l d so fs 缸加p ，”e 埘口力胁4 p ( o t i o ) t h er e s u l to ft h et e s t i n d i c a t e dt h a tt h eb e s th o r i z o n t a lc o d ev a l u co fs i xi g r c d i e m sw a sl ，l ，1 ，o ，0 ，a n d2 r e s p c c t i v e l y t h en e m a t o d ey i e l d sc o u l db eu pt om em a ) 【i m 啪y i e l d 、v i t ht h e 锄o u n to f i n o c u i a t i n g b a c t e r i aa n dt h en e m a t o d e sa t l dt l l ec u l n l r et i m ew a s0 ，la n dor e s p e c t i v e l y n os i 弘m c a l l tc h a n g et o o kp l a c ec o m p 耐e d 、v i t hmv 甜dc u l t u r ea n da n i f i c i a l l i q u i d c u l t u r i n go n 血eb i o l o 西c a lc h a r a c t e r i s t i c so fe n t o m o p 融h o g e m cn e m a t o d e s t h el c 5 0w a s 2 3 4 u “m la i l d2 5 _ 3 u s m lr e s p e c t i v e l yt ot 1 1 c1 鼬ti n s t a rl a r v ao fb i gw a xm o t l l ，a n dt h e s p e g t r u mr n o b i l i t yo fn e m a t o d ce s t e r a s ei e n 巧m ew 船o 4 3 5 ，0 1 5 3 强do 4 2 4 ，o 1 4 1 r e s p e c t i v e l yi ne l e c t r o p h o r e s i s f i v es 砌n so fe n t o m o p a t l l o g e n i cn e m a t o d ea n dt h e i rs y m b i o t i cb a c t e r i ah a db e e ns e l e c t e d f o rb i o a s s a y i n gu s i n gg 耶p r 缸m e ，o 聆已，ka 1 1 d 胁，0 护f 如抽硪。唧而口z 蛔n l ec a r b o x y l e s t e r a s e a c t i v i t yo fb i gw a xm o t h f s5i n s t a rl a r v aa n dm ei 砌 e c _ 【i v ea c t i o no fe n t o m o p a 也o g e i l i c n e m a t o d e sa n dm e i rs y m b i o t i cb a c t e r i at o3i n s t a rl a n ，ao f 胁如州幽胁锄7 即 讲砌h a db e c n t e s t e d 1 1 1 er e s u l ts h o w e dt h a ta - n ac a r b o x y l e s t e r a s ea c t i v 时仃e a t e db yn c 3 4s 仃a i nw a st h e 1 1 i g h e s t 黜o n gt h e mt og 口z 把，蛔m 已，d 以e 加i tw a s2 0 4 7t i m e sh j g h e rt h a nt h a to fc k o t i o s t r a i nt o o kt h es e c o n dp l a c e ，t h ee s t e r 勰ea c t i v i 印o ft h a tw a s1 9 6 5t i m e st oc k p _ n a c a r b o x y l e s t e r a s ea c t i v i t yt e s t e db yo t i os t r a i nw a st h eb e s t ，w h i c hw a st h c1 1 4 9t i m e st oc k i nt l l e b i o a s s a y i n gf o r 舫，o 护f 如抽砒删咖口，出，t l l e 仃e a t m e n ti n f e c t i v ea m l i t y o fm e s e e m o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e sw a ss i g n i f i c 蛆t i yh i g h e rt h a l lt l l a to ft h e i rs y m b i o t i cb a c t e r i a a l o n e ，t h ec o r r e c t e dm o r t a l i t yc o u l db eu pt o7 3 3 3 w i t l lm ec o n c e n t r a t i o n5 0 0 0 i j s m lo f n c 3 4s t r a i n 2 沈阳农业大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e ；s y m b i o t i cb a c t e r i a ；q u a d r a t i cr e g r e s s i o n o n h o g o n a lr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g n ；l i q u i dc u l t l l r e ； 3 前言 刖若 昆虫病原线虫( e n t o m o p a m o g e n j cn e m a t o d e s ) 是奉世纪发展起来的一种有潜能的 生物防治因子。近年来，在昆虫病原线虫的研究及开发利用方面的报道越来越多。它具 有寄主范围广、能主动寻找寄主、对脊椎动物和植物安全、不易产生抗性、并能人工大 量培养等优点( 丛斌等，1 9 9 9 ) ；使用方便( g e o r g i sr ，1 9 9 0 ) 、杀虫速度快、并能 与化学杀虫剂混用( z j m m e l l t l a n r c m s h a w w s ，i 9 9 0 ) 。这类线虫具有天敌昆虫 兼病原微生物的双重特点，不但能像天敌昆虫一样通过化学感受器主动寻找和选择寄 丰，而且它们又都携带共生菌，在侵染寄主体腔的同时，随即释放共生菌，使寄主患败 血症而死亡。故这类线虫被称为昆虫病原线虫。 国内外对昆虫病原线虫的研究应用从上世纪3 0 年代开始，至今已有近8 0 年的历史。 早期昆虫病原线虫的繁殖和培养主要依靠体内活体培养，但繁殖成本过高不宜作大量 生产应用，也一直制约着昆虫病原线虫的实际应用。线虫商品化应用的基础是线虫能够 低成本、有效地大量培养。昆虫病原线虫的培养是在共生细菌的营养作用基础上进行的， 通过在人工培养基中加入线虫及其共生细菌来建立昆虫痛原线虫的单菌体外培养系统； 基于此理论可直接应用到线虫的人工培养中，为线虫更广泛的应用打下了趋好的基础。 在农药污染日益严重、害虫抗药性发展迅速的今天，昆虫病原线虫已成为可持续发 展农业的迫切需要，受到国际生防领域的重视，是继b t 、昆虫病毒之后又一新的生物防 治因子；由于其易于杂交和基因操作改良、变异类型丰富、有深入研究和发展的余地。 因此，在害虫生物防治中昆虫病原线虫具有一定的研究价值和应用潜力。 因此，在害虫生物防治中昆虫病原线虫具有一定的研究价值和应用潜力。 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章昆虫病原线虫研究进展 1 1 昆虫病原线虫生物学特性 昆虫痫原线虫一生可分为卵、幼虫和成虫3 个虫态。幼虫期共4 个龄期，其中只有第 3 龄幼虫可存活于寄主体外，也是唯一具有侵染能力的虫态，又称为侵染期幼虫( i n f c c t i v e j u v e i l i l e ) 。侵染期幼虫一般滞育不取食，体外仍包裹着已经蜕去的第2 龄幼虫的表皮， 对外界不良环境的耐受能力最强，故又称为耐受态幼虫( d 姐c ri u v e l l i l e ) 。侵染期线虫 幼虫肠道细胞内携带有共生菌( b i r d a f & a l ( 1 l u r s t r j ，1 9 8 3 ) ，在遇到合适的寄主 害虫后，线虫便可通过害虫的一些自然开口( 如口腔、肛门、气门、伤口等) 或节间膜 进入昆虫的肠道和血腔，然后在昆虫血腔中释放发出共生菌并快速增殖，造成寄主死亡。 线虫则取食共生菌和液化的寄主组织并发育成熟，完成交配、繁殖，最后又释放出大量 的3 龄幼虫，继续侵染其它寄主。昆虫病原线虫与共生菌之间是一种典型的互惠互利关 系：线虫在寄主问传输共生菌，保护共生菌不受土壤环境的影响，并在抵御寄主防御系 统时保护共生菌；共生菌为线虫繁殖提供所需的基本营养成分，并产生毒素和抑菌物， 为线虫繁殖提供良好的环境条件。a k h u r s t ( 1 9 8 2 ) 研究表明，在无共生菌情况下外来的 细菌可明显地影响到线虫的繁殖能力，使线虫后代的数量显著减少，而且在线虫体内， 线虫的共生细菌也可显著地抑制其它细菌的生长。线虫对共生细菌也是带有明显的选择 性的，a k h u r s t ( 1 9 8 0 ) 报道，将线虫同共生菌和其它细菌混合培养时，线虫只吸收与其 共生的细菌而不吸收其它细菌。甚至在将共生菌的初生型与次生型同线虫混合培养时， 线虫也只吸收并保留初生型共生菌。昆虫病原线虫的共生菌对环境的耐受能力极差，基 本上是不能独立生存于外界环境中的，只有借助于昆虫病原线虫的携带方能进入昆虫体 内，并进行繁殖( m i l s t c a dj e ，1 9 7 9 ；g o t zp g 甜耐，1 9 8 1 ) 。同时，在缺少共生菌 存在的情况下，线虫对昆虫的毒力也大大降低( p o i n a r g o j r & 1 1 1 0 m a s g m ，1 9 6 6 ) 。 昆虫病原线虫的栖息环境是影响线虫寻找寄主的重要因素。线虫一般栖息在土壤 中；耕地、森林、草地、沙漠甚至是海滩，都可能成为线虫的栖息地。如e f n p 埘e 聊口 c 卵d c 印船p 生活在土表附近，必然适于寻找这一生境中的寄主；上结胞阳砌口6 砌括 6 口m r 却 d r 口则生活在较深层的土壤中，适于寻找隐蔽较深的地下害虫。当线虫进入合 适的生境后，不同种的线虫有其独特的方式寻找寄主，一般为潜伏式( 锄b u s h ) 和游动 式( c r u i s e ) 。潜伏式线虫，如s c 卵d 唧鲫p ，静止于表土中，不活动，这有利于减少 5 第一章昆虫病原线虫研究进展 体内能量的消耗，静等活跃在表土中的寄主到来。显然，这类线虫对防治深层土壤害虫 如蛴螬等效果不好，而对表土活动力强的害虫如蟋蟀效果就很好。游动式线虫如 s 古船p ，f ，活动能力强，有助于主动搜寻寄主。这类线虫适于防治深层土壤中的不活跃害 虫如蛴螬等( h 鲫了kk a y a ，1 9 9 3 ) 。这类线虫具有敏锐的化感器，对寄主的代谢产物、 粪便、c 0 2 浓度等很敏感，对寻找寄主有利。除此之外，还有一种中问类型。另外，线虫的 活力受体内脂类积累的制约，而影响其寻找寄主的能力。线虫寻找到寄主以后，必须接 触并附着在寄主上，才能完成感染，描述这一习性的报道还很少，i s h i b 删等( 1 9 9 0 ) 曾介绍了潜伏式线虫的“旋绕”( i l i c 诅t i o n ) 习性：在栖息地不断地抬起前半部身体并 左右摇摆，这可能是线虫搜寻和附着寄主的一种方式。线虫附着在寄主体上后，还需识 别是否适于寄生，寄主体表的糖类物质是线虫利用化感器进行识别相应寄主的主要根 据。如果将异小杆线虫的化感器堵塞，它就会失去识别寄主的能力( h a n ykk a y a ， 1 9 9 3 ) ，至于嗅觉器官在识别寄主时的作用尚不清楚。 由于各种昆虫对线虫的敏感程度不同，导致线虫致死寄主的结果差别很大，甚至不 同龄期及不同年龄组的昆虫对线虫的敏感性也不同，寄主的免疫反应是造成敏感性差别 的原因之一。昆虫病原线虫受环境影响较大，其生长、发育、侵染及繁殖均需要一定的温 度和湿度条件，温度在o 4 0 之间均可生活，但不同的线虫对温度的要求不尽相同； 相对湿度超过8 0 施用线虫较为适宜，在有雨、雾和露的情况下，线虫的寄生率高，反 之则低( 丛斌等，1 9 9 9 ) 。太阳辐射对昆虫病原线虫也有很强的杀伤力。多数线虫对水 生、粪食及食叶性昆虫防治效果都差，就是由于这些昆虫的生境不利于线虫侵染。如果 改善环境条件，也可取得满意的效果。如在高湿有遮盖的条件下，或在温室内，可提高 线虫的侵染力。因此，在应用线虫防治害虫时，不但要针对防治对象选择合适的线虫种类， 同时还要考虑适宜线虫存活，生长发育，侵染等的生态条件，才能取得理想的效果。 1 1 1 昆虫病原线虫的分类 长期以来，昆虫病原线虫的分类一直呈现一种混乱的局面。传统的依据形态学特征 对线虫进行分类的方法，主要对线虫的一些典型特征进行分析，如体长，头到神经环的 距离，头到排泄孔的距离，以及雄虫交合刺和引带形态特征等。但实际上由于寄主营养、 培养温度、侵染态线虫收获时间等的不同，往往使得即使同种的不同品系或个体的上述 形态特征也可能产生较大差异，因而很难确定线虫在分类上有价值的特征( m 出u r s tr j ， 1 9 8 7 ；c u m n ，1 9 8 9 ) 。直到a k h u r s t ( 1 9 7 8 ) 提出利用杂交的方法对线虫分类可提供可 6 沈阳农业大学硕士学位论文 靠的依据。并随着线虫分类技术的改进，结合形态学特征，蛋白质、同工酶电泳及d n a 杂交技术、1 6 s r r n a 、随机扩增多态d n a 分析等技术的应用给线虫的分类带来了新的突 破，并对原来的分类系统进行了修正。目前，昆虫病原线虫分成斯氏科( s t e i n e m e m a t i d a e ) 和异小杆科( h e t e r o r h a b d i t i d a e ) ，均隶属于线虫动物门( n e m a t o d e ) 小杆目( r h a b d i t i d a ) ， 斯氏科线虫分为斯氏属( 龇加p 聊p 研口) 和新斯氏属( k o 卿加p m 删d ) ，其中斯氏属含 2 5 个种：异小杆科线虫由p o i i m ( 1 9 7 5 ) 建立，包括一个属即异小杆属( r p f p r o r 蛔6 威出) ， 分9 个种( a n nm b u r n e u & s p 嘶c i as t o c k ，2 0 0 0 ；徐洁莲，1 9 9 8 a ) 。由于异小杆属线 虫在进入寄主体内后即发育成雌雄问体的大母虫，因而不能采用杂交方法鉴定其种类，而 仅以普通的形态特征作为其分类依据又极不可靠。自9 0 年代发展起来的一些新技术越来 越多地应用于线虫的分类，如淀粉酶电泳和特异酶染色、d n a 限制性长度的多态性、 p c r 方法等为异小杆科线虫的分类提供了更有力的依据( 徐洁莲，1 9 9 8 b ) 。 1 1 2 共生菌的分类 过去，曾认为昆虫病原线虫的共生菌都属肠杆菌科( e m e r o b a c t e r i a c e a e ) 中的同 个属恐丹。砌日6 d 蚶，直到b o e m a n e 和a l l k u r s tr ( 1 9 9 3 ) 通过d n a d n a 杂交试验及细菌生 物学特征的不同，将共生菌分为两个属：嗜线虫杆菌属您n o r 触6 幽s ( 与斯氏属线虫共 生) 和发光杆菌属尸厅d ，o 砌口6 d 如( 与异小杆属线虫共生) ，与新斯氏线虫属共生的细菌 目前尚无报道。这两个属的细菌一般都有两型现象，通常称为i 型( 初生型) 和i i 型 ( 次生型) 。它们在菌落形态上有明显的不同，此外，i 型细菌能产生抗生素，能吸收 染料，分泌蛋白酶和脂酶，产生胞内晶体蛋白、抗生素、色素及荧光素( 荧光素只对发 光杆菌而言) ；而i i 型细菌皆不具备或仅有少量的上述代谢产物产生( 王立霞等，2 0 0 0 a ) 。 通过测定i 、i i 型共生菌胞外产物的杀虫活性，发现i 型菌的胞外产物对昆虫有胃毒活 性和血腔毒性，l i 型菌没有杀虫活性( 王立霞等，2 0 0 0 b ) ，但型菌比i 型菌更能有 效地利用营养物质( a d a m 甜口7 ，1 9 9 4 ) 。有人认为，是由于阻遏物基因不稳定，在i 、 l i 型菌中的结构不同，使其表现出i 、i i 型菌的型态变异，但目前对这一细菌产生不同 型态的机理尚不清楚( s t c v e nf o r s t “订f ，1 9 9 7 ) 。 第一章昆虫病原线虫研究进展 裹i i 昆虫病原线虫及其共生菌种类 t a b l e1 一le n t o m o p 劬o g 朗i cn e m a t o d e s 锄dt h e hs y m b i o t i cb a c t c d a 昆虫病原线虫共生菌 e n t o m o p 砒h o g c n i cn e m a t o d c ss y m b i o t i cb a c t e 订a 强氏蔼s t e i m r m m d s 忙i n e ，w e m 4 曲扫甜i d ，鲫a 一“小( = n h 咖口，口p = _ 口h d 卅d m s 蝴i m ? 4 承n 蛾 矗6 耙0 ，h f “埘 s c 8 r p o c n p 3 d e s c e r d t o p h o r n & c 口“出m 小 丑c h 6 删“，n s 扣l l i a p 岫i 6 i 砷 s g t m e r l s i n 娅r m e d ih m = 抽t e r 册e d o 、 3 k 啪 s 枷w s “ s k m h i d 口i s 1 0 n g i c 如m s 卅d 出口m 朋 sn e d c h l f l n pf 肿o c n h i f l i 曲 sw e 9 0 m m e # o r e g d m m 砩 sp l i e r t o r i c e m ef 叫e r | o r 耙e m 蚺 sr a m m 竹d 衲 s r i o b r 口 ，e 子r i o b r “i n s 。r h e r i ss c 叩t e r i s c i s s l o m 咖试 sf d 卅f ss n 新斯氏属 k 把加p m 删口 n e o s t e i m r m m 口l o n g 妇i c “d n 异小杆属胁埘啪口6 出出 hd r g e m i m m h h b n c l e r i o p l 。mt = h n o t h i d i 曲 h b r e v i c d “d i s h h a w n i 谴船括 hi n d i c o 皆i ，l d i c 嫡 h m d r e l d t u s 卞p 证l 妇砖 hm e g i d i s h0 0 i n t h z e n t n 葩t c 口 x e f o r m b i 出口 x e l 口b d l s 印 王印 x6 d v 扣h “ x 印 x n e m m o d h nu s 置s d xs p x 州t m i i 工脚m “ 置口d 打讶一f x b o v i e n l i 工s p x b 鲫i e n 挂 x j 口p o n i c 4 xs p 上s p x 暑p xs d 置s p 工s p 王w m a f 哪船 工s p 工s p 正s p z 印 x b e d a 魄i i u n d e s c b e d u n d c s c d b c d p h o t o r h o b - 矗惦 p h m l t n e s c e 船 p h m i n e s c e n s p m 哪m p h l m i r 薄s c e 船 p h m i n e s c e m p 1 h m i 啪s c e 陋 p t h m 面t e s c e n s p m 掣，m p t h m i 地s c e m pt e l d e r m n 1 1 3 线虫细菌复合体的生物学 线虫整个发育期中，不是任何时期都有侵染能力的，只有保持带鞘的3 龄幼虫对昆 虫具有侵染力，且抗逆性较强，感染期幼虫肠道内携带有共生菌。当遇到合适的寄主时， 游离于土壤中的侵染期线虫可通过寄主的自然孔道( 口、肛门或气门) 或伤口侵入寄主 8 鲨堕查些查堂堡主堂垡笙塞 体腔；异小杆线虫还具有“背齿”，用以刺破寄主表皮的薄弱部分( 如节间膜) 赢接进入 寄主体腔( a i l n m b t l n l e h & s p a 研c i a s t o c k ，2 0 0 0 ) 。线虫进入寄主体腔后，立刻排放 共生菌，由于细菌的大量繁殖，2 4 4 8 h 内寄主就会患败血病而死亡。然后，线虫就利用 死亡的寄主组织和细菌为营养，发育和增殖，一般2 3 代后，营养物质已被耗尽，再 以游离态侵染期幼虫的形式，重新寻找新寄主。线虫和细菌之间的关系是互惠共生，故 称为线虫一细菌复合体( a l ( 1 1 l l r s tr j 甜讲，1 9 9 2 ) 。在这个复合体中，线虫作为细菌 的载体，保护细菌免受不良环境的破坏和干扰，使之顺利进入寄主体腔，并保护细菌免受 寄主体内产生的抗菌物质的破坏。相对于共生菌可在寄主昆虫体内繁殖，产生毒索，使 寄主患败血症死亡，分解营养物质，为线虫生长发育繁殖提供营养来源，其分泌的抗菌 素还能控制腐败细菌的继发感染，为线虫的生长发育创造良好的环境。在自然条件下， 感染期线虫只携带i 型细菌，i i 型菌则出现在i 型菌的体外培养物中( 王立霞，2 0 0 0 b ) 。 1 2 致病机理 1 2 l 线虫对寄主昆虫的侵染过程 昆虫病原线虫在潮湿环境中可借助水膜做垂直运动和水平运动并自主地寻找合适 寄主，能通过寄主的一些自然孔口( 如口、肛门和气门) 、伤口或节间膜等进入寄主血 腔中。大量的研究观察表明，昆虫病原线虫主动寻找寄主是由来自寄主本身的特定物质 或其它化学物质刺激的刺激而激发的( 杨秀芬杨怀文，1 9 9 8 ；g a u g l e r r 甜口，1 9 8 0 ) 。 另外，已有研究表明，线虫入侵寄主的侵入途径也可能会因不同寄主昆虫而异。昆虫的体 壁结构、气门结构的不同也可能是影响线虫侵入途径的主要原因，如n o b v y o s l l i i 砬过组 织学和扫描电镜观察指出，夜蛾斯氏线虫口e f 船朋e 懈角z 疗船可通过气门侵染大蜡螟幼虫、 蛹及成虫，但不能通过此途径侵染斜纹夜蛾的幼虫和蛹( 杨秀芬杨怀文，1 9 9 8 ) 。适 宜的外界环境因素，如环境的湿度、温度、p h 等，则应是线虫侵染得以实现的主要因素。 侵染期线虫在环境中的定居、搜寻寄主能力除了与环境的温、湿度及土壤质地有关外， 还与寄主的行为、形态、机械防御行为有关。g a u g l c r ( 1 9 8 8 ) 认为寄主的行为防御包括 多种多样：隔离已被侵染的昆虫个体以防群体被感染( 如白蚁) ；肛门频繁排便以减少 线虫侵染机会( 如蛴螬) ：g a u g l e r 等( 1 9 8 0 ) 研究表明寄主粪便散发出的气味或寄主呼 吸产生的c 0 2 可能对线虫具有引诱作用；减少c 0 2 排放量以减少化学诱饵作用( 如鳞翅目 昆虫的蛹) ；钻入植物根部以躲避线虫侵染；用胸前足将线虫与体表分开( 蛴螬) 等。 机械防御包括昆虫对侵入线虫的包裹作用，寄主的体液反应等，这些防御行为直接或间 9 第一章昆虫病原线虫研究进展 接影响着线虫对寄主的致病能力。s c h e i l i d t 等( 1 9 7 9 ) 发现昆虫排泄物中的尿酸、黄嘌 呤、尿囊素、氨和精氯酸等对线虫有引诱作用。另外一些杀虫杀螨剂及植物汁液可能对 线虫也有引诱作用( p y ea e & b u m 柚m ，1 9 8 1 ) 。此外，培养温度、线虫本身的共生 菌都对吸引线虫有影响。 1 2 2 线虫与共生菌对寄主的致病机理 昆虫病原线虫侵入寄主体内后，即可在寄主体内大量繁殖。引起各种组织不同程度 的崩解、细微结构的改变与降解。早在1 9 6 7 年p o i n a r 等人研究d d 2 1 3 6 线虫对大蜡螟的毒 力时就发现，从大蜡螟幼虫口腔进入的侵染期线虫穿过中肠肠壁细胞，并从其肛门释放 共生菌于血腔中，引起寄主患败血症而死亡。在寄主死亡前，线虫可进入脂肪组织、马 氏管、丝腺和肌肉组织，所有这些组织和消化道都显示出被破坏的迹象。研究发现( 肖 猛，1 9 9 0 ) ，小卷蛾线虫a g r i o t o s 侵入大蜡螟8 h 后可进入寄主的马氏管腔、后肠及中肠 上皮细胞，侵染1 6 h 后进入脂肪体组织，随后进入肌肉及丝腺中，引起这些组织的变形， 组织呈解离状态。2 4 h 后，中肠组织细胞被破坏，细胞分离，肠壁细胞解离。伴随着共 生菌的大量增殖，昆虫被破坏程度逐渐加剧，最后使组织崩溃，导致寄主死亡。由于不 同昆虫对线虫侵入的防御策略及忍耐极限不同，其死亡的速度存在差别。从组织解剖学 看，同种线虫对不同昆虫组织的破坏进程也存在明显差异。不同昆虫组织的被破坏程度 及寄主死亡速度的差异，可能是不同昆虫对线虫敏感性差异的机制之一。总之，昆虫病 原线虫的致病机理是复杂的，由多方面决定的，有许多问题尚待进一步明确：( 1 ) 共 生茵细胞表面特性与寄主防御反应的关系： ( 2 ) 在寄主防御反应中线虫及其共生菌是 如何生存的； ( 3 ) 毒素的分子性质和作用方式。利用遗传和分子手段可能是解决昆虫 病原线虫致病机理的有效途径。 1 2 3 线虫及其共生菌对寄主血淋巴的破坏 昆虫病原线虫菇生菌，1 1 1 0 m a s 等( 19 7 9 ) 鉴定为肠杆菌科( e n t o b a c t 耐a d a e ) 嗜线 虫杆菌属( 皿盯d 砌口6 d 撕) 。不同线虫的共生菌在肠腔内存在的位置不同，斯氏线虫科 ( s t e i n e m 锄撕d a e ) 的共生菌存在于肠腔内的一种特殊泡囊中，异小杆线虫科 ( h e t e r o r h a b d i 削a e ) 的共生菌分布于线虫整个肠道内。这可能与不同线虫携带共生菌 的机制有关。线虫对寄主昆虫的致病作用是线虫和共生菌两者共同作用的结果。p o i n a r 和n l o m a s ( 1 9 6 6 ) 年发现使分离了共生菌后的线虫感染寄主，其致死寄主的速度大大降 低，并且线虫繁殖的后代数量也大大减少，而蓟船e 一线虫则可能不能单独杀死寄主。 】0 沈阳农业大学硕士学位论文 a 曲i l r s t ( 1 9 8 6 ) 等进行了线虫共生菌对寄主的致死作用试验，发现单独的共生菌侵入寄 主血腔后，也可致死寄主，但对不同寄主的毒力差异非常大( a l 【1 1 l l r s t r j ，1 9 8 6 ) 。线 虫共生菌不能独立进入寄主血腔中，必须借助于线虫的携带。线虫携带共生菌进入寄主 血淋巴后，便释放出共生菌，并借助寄主营养大量繁殖。通过研究表明，线虫共生菌通常 对寄主有很高的致病力，其l d 5 0 通常少于5 0 个细胞( 杨秀芬，1 9 9 8 ) 。共生菌对寄主 的杀伤作用主要靠大量繁殖以破坏寄主的血淋巴造成寄主患败血症而死亡。据报道( 肖 猛，1 9 9 0 ) ，被昆虫病原线虫侵染的昆虫，血细胞数目大大减少。在线虫共生菌大量繁 殖、寄主濒于死亡时每毫升血淋巴中可见细菌超过1 0 0 0 万，而血细胞则减少9 0 以上， 这使得寄主的营养被大量消耗，最后死亡。 1 2 4 昆虫病原线虫对寄主防御机制的破坏 有效的昆虫病原线虫必须能躲避或破坏昆虫的各种防御机制( 内部的和外部的) 。 当线虫侵入寄主后，寄主的血淋巴对外界异物的侵入有各种不同的防御反应，主要是寄 主吞噬细胞和其它血细胞对共生菌初期产生的抵抗作用。m 砒m 在1 9 8 4 年报道，大蜡螟 老熟幼虫强制食下斯氏线虫后，其血腔内血细胞数比对照减少2 0 ，4 h 后，线虫从消化 道进入血腔，其自由血细胞增殖到1 6 0 ，随后数小时内，血细胞逐渐减少，在1 4 1 6 h 内又出现一个较大的血细胞上升峰，在2 4 h 后寄主即将死亡之前，其血细胞仅为对照的 1 2 。这种变化进一步表明，寄主对线虫共生菌的侵入有一定的防御能力。血细胞 数目的暂时上升是由于共生菌线虫的刺激，引起虫体各功能体系作出的相应反应，其 中有可能是些附着的血细胞补偿到循环血细胞中来，使血细胞总数达到一个高峰值， 但随着时间的推移，线虫共生菌破坏了寄主的防御系统开始大量繁殖或线虫对寄主组 织器官破坏的加剧使寄主的一些组织系统发生功能障碍，引起体内环境的变化，致使血 细胞变形、转化、崩解，最后使血细胞数降至最低。线虫共生菌对不同寄主的血淋巴 有不同的免疫反应，有关这方面的研究近几年才开始，归纳有以下几类：( 1 ) 共生菌能 忍受或破坏寄主的体液包被。如在大蜡螟和飞蝗( 三o c 埘埘埘堙阳如r 扭) 中，线虫能避开 寄主血细胞的识别而不被其所包被，而共生菌最初未能避免，但随后能分泌一些酶使血 细胞失去活性，并在血淋巴中迅速繁殖，使寄主很快死亡( d u n p h y 盯甜，1 9 8 5 ) 。共 生菌能忍受或逃避寄主的防御反应是因为其细胞壁的脂多糖( l p s ) 能阻止寄主昆虫酚 氧化酶的形成，而酚氧化酶参与了昆虫血细胞的黑化过程( d u n p h y & w 曲s t e r j m ， 1 9 8 8 ) 。经化学诱变获得的低毒突变菌株，其细胞表面性质发生了很大的变化，如疏水 第一章昆虫病原线虫研究进展 性和脂多糖含量增加、阳离子电荷和膜蛋白含量减少，这些似乎说明卫h p m 口彻咖淞的细 胞表面含有抗血细胞的物质以免受寄主防御反应的影响。( 2 1 线虫产生诱导酶抑制因子， 该因子具有保护共生菌的作用( g o b t ze ，口，1 9 8 1 ) ，这种相互作用的重要性在格氏线 虫( 鲥船p “) 及其共生菌( x 即f 玎口一f ) 中表现最为突出，注射1 1 5 0 个共生菌细胞并不 能致死大蜡螟幼虫，但同时注射1 1 5 个细胞和一条侵染期线虫即可致死7 5 的大蜡螟幼 虫( 趾曲r s t ，1 9 8 6 ) 。( 3 ) 线虫被寄主血细胞包被前，释放共生菌使寄主患败血症而死 亡。如线虫侵入双翅目的水生幼虫后，很快被包被在一种多酶蛋白酶中( d u n p h y & t h l l r s t o n ，1 9 9 0 ) ，但这种包被过程并不能避免寄主( 爿e d 缸s p p 和c k k x 陀卵”们苫) 的死 亡，因为在线虫被包被前已释放了共生菌，共生菌不受防御机制的影响，能迅速增殖并 杀死寄主( w e l c hh e & b r o n s h ljf ，1 9 6 2 ) 。但由于不同昆虫对线虫的抵御反应和 能力不同，共生菌对不同昆虫的致病力存在差异。研究表明：注射l 3 个共生菌细胞就 能致死大蜡螟，但对鳞翅目昆虫a 如砷d 伽p 盯e 阳的蛹致病较差，其l d 5 0 为5 0 0 个细胞， 对双翅目昆虫的有些属( c 诒打d 疗。卅螂) 并非都有致病力：而x ，印伽妇对斜纹夜蛾 ( 印洲印把，口，池陀) 没有致病力( y 锄眦a k as a ，1 9 9 2 ) 。有关麸生菌对不同昆虫的 致病力还没有详细报道，但可以认为共生菌对昆虫具有极强的致病力。 1 2 5 线虫和共生菌产生的毒素和次级代谢物 有些线虫共生菌复合体，如小卷蛾线虫和z 玎p m 疗阳四 盯螂；夜蛾斯氏线虫和 z 6 d v 缸胛f f 都能产生毒素( b o e m a r en & a l d l u r s tr j ，1 9 8 8 ) ，线虫共生菌的侵入除了 影响寄主血细胞数目外，寄主血淋巴的生理生化指标都表现出明显的病理学变化，如血 蛋白含量和血糖含量减少，脂酶活性增强( 肖猛，1 9 9 0 ) ，这些都导致了寄主组织功能 障碍或被直接破坏，过度消耗寄主营养，导致寄主的快速死亡。虽然至今还没有异小杆 线虫产生毒素的报道，但有些斯氏线虫是可以通过产生毒素来影响寄主的习性和活动， 甚至杀死寄主的。例如新线虫0 印p c m 舳唧o c q p 阳b 在培养过程中，能周期性产生毒 素( b a r r n 趾m ，1 9 8 2 ) ，以4 龄幼虫和成虫混合期产生的毒素最多。线虫共生菌 x e m 口f 嘞f 胁在生长过程中能产生内毒索脂多糖，刺激寄主赢淋巴的降解( d 1 h l p h y g b & w e b s t e r j m ，1 9 8 8 ) 。和许多其它革兰氏阴性细菌一样，线虫共生菌在生长过程中 能产生内毒素和外毒素( k a l l l i o n e k ，1 9 7 5 ) 。共生菌x 玎p 珊讲砌f ，淞的内毒素是细胞壁 的脂多糖，能刺激寄主血淋巴的降解，对大蜡螟的血细胞有毒性( d u n p h yg b & w 曲g 时 j m ，1 9 8 8 ) 。b o w e n 等( 1 9 8 8 ) 等通过注射共生菌培养液上清液证实了丑，“研f p i 船珊、 1 2 垫塑查些查堂堡主堂垡堕兰 置聊挣嘏f 咖f 船和x6 d w 明f 矽 毒索的活性。c l e r k c 等( 1 9 9 5 ) 研究发现砌。细砌6 加s d 的分泌物酯酶与大蜡螟的致病性有关。外毒素是细胞产生的胞外酶，外毒素的活性 可能与线虫共生菌胞外酶( 蛋白酶，卵磷酯酶，酯酶) 的功能有关，尽管这些酶在其他 细菌中被看作毒素，但在共生菌中还没有证实对昆虫有毒性( b o 锄a r en a k h u r s t j ，1 9 8 8 ) 。e n s i 弘( 1 9 9 0 ) 等，在共生菌x 砌f 愀口珊中发现了具有高毒性的胞外蛋 白，这种毒蛋白能在1 2 2 4 h 内杀死烟草天蛾( 缸疗础c 船“船) 5 龄幼虫。它由许多蛋 白亚基组成，注射毫微克的毒素，即可有效杀死幼虫( b o w d ，1 9 9 5 ) 。有些昆虫可 能被外毒素杀死而其它昆虫可能对内毒素和线虫毒索更敏感。 线虫共生菌在代谢过程中还可以产生多种抑菌物质，以阻止来自肠道和土壤环境中 的微生物对虫尸的二次降解，保证了线虫生长和繁殖所需要的足够营养。有试验证明， 有些共生菌的次级代谢产物也直接影响了寄主血细胞的正常功能，如m c i n e m e y ( 1 9 9 1 ) 等从z 6 。v 把门f f 的t 3 1 9 菌株代谢物中分离出了6 种二硫吡咯类衍生物，并通过试验发现， 其组分i i 在1 5 0 峙c m 2 的剂量下对月j ，f o 蛹缸p 姗c f f e r 口的致死作用为1 0 0 ( 杨秀芬杨 怀文，1 9 9 8 ；m c i n e m e y b v g r e g s o n r ，1 9 9 1 ) ，在3 7 5 肛g ，c m 2 下，死亡率为1 8 8 ， 但未死亡的昆虫有6 4 7 的个体与对照比较，体重明显减轻，说明这种组分以某种方式 阻碍着幼虫的取食。共生菌次级代谢物对昆虫幼虫的拒食和杀死作用说明，共生菌代谢 物可能与杀虫机理有关，尽管这种杀虫作用比一般的杀虫剂弱，但它可能参与了与其它 致病因子的共同作用。尽管线虫及其共生菌产生的毒素对寄主真正破坏和致死作用的机 理还未清楚。但可以肯定，线虫和共生菌产生的毒素能直接或间接地破坏寄主对线虫的 防御能力，有利于线虫一共生菌复合体对寄主的致病作用，并有待进一步研究。 1 _ 3 遗传基础 杨秀芬( 1 9 9 8 ) 等认为，遗传和分子生物学手段可能为进一步解释线虫致病机理提 供有效途径。如在共生菌方面，x u 等1 9 9 1 年用转