（免疫学专业论文）traf1引起线粒体聚集的抗凋亡生物学效应及其机制研究.pdf

华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 3 traf1 引起线粒体聚集的抗凋亡生物学引起线粒体聚集的抗凋亡生物学 效应及其机制研究效应及其机制研究 中文摘要中文摘要 traf1 属于 tnf 受体相关因子(tnfr-associated factor traf)家族。traf 家族 是一类胞内衔接蛋白，能介导 tnf 受体和 il-1 受体超家族的信号转导引起 nf-b 和 jnk 等的活化，从而对细胞的生存与死亡产生影响。traf1 不具有 traf 家族其他 成员所共有的环指和与之相邻的锌指结构，其可募集一些 tnf 受体超家族成员，包 括 tnfr2，cd30，cd27，trance-r 等。据报道，traf1 可抵抗/抑制细胞凋亡： 在转基因动物中过表达 traf1，可抑制抗原诱导的 cd8+细胞的凋亡；traf1 可通过 募集 ciap 以执行其抗凋亡作用。但也有不同研究结果表明 traf1 可促进细胞凋亡。 本室前期工作首次证实高表达 traf1 能与线粒体共定位并引起线粒体聚集，这 一现象具有普遍性。而且转染 traf1 的 hepg2 细胞，其 nf-b 活性增强，能抵抗 tm-tnf-的杀伤。转染 traf1 能上调线粒体融合蛋白 mfn2 的 mrna 水平，提示 traf1 引起的线粒体聚集可能与线粒体融合分子相关。 本课题选取 hela 细胞作为研究对象， 借助 realtime-pcr 观察高表达 traf1 线粒 体融合蛋白 mfn1 转录水平的变化；以化疗药物阿霉素诱导 hela 细胞凋亡为模型，观 察高表达 traf1 对于阿霉素杀伤作用的影响，并通过检测线粒体膜电位的变化、 caspase-9 的活化以及 ib 的降解， 进一步深入探讨 traf1 导致线粒体聚集的生物学 效应及其分子机制。 一一转染转染 traf1 使线粒体融合蛋白使线粒体融合蛋白 mfn1 的的 mrna 水平增高水平增高 以realtime-pcr分别观察hela细胞各实验组： 未转染组、 转染空载体pdsred 组 和转染 pdsred-traf1 重组质粒组中线粒体融合蛋白 mfn1 的 mrna 水平的变化。 转染 traf1 后，mfn1 分子的 mrna 水平明显增高，为未转染组的 2.18 倍(p0.01)， 为转染空载体组的 2.48 倍(p0.01)。 提示 traf1 可能通过上调 mfn1 的表达而导致 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 4 线粒体聚集。 二二转染转染 traf1 可抵抗化疗药物阿霉素的杀伤效应可抵抗化疗药物阿霉素的杀伤效应 以 hela 细胞为靶细胞，设未转染组、转染空载体组和转染 traf1 组，以 1m 阿 霉素分别刺激各组细胞 48 小时，观察 traf1 对阿霉素杀伤 hela 细胞的影响。mtt 结果显示：转染 traf1 组表现为对阿霉素杀伤作用的抵抗，其杀伤率与未转染组和 转染空载组相比，分别下降了 18%和 17.21% (p0.05)。提示转染 traf1 可抵抗阿霉 素对 hela 细胞的杀伤效应。 三三转染转染 traf1 可使可使线粒体线粒体发生发生聚集聚集 以阿霉素未刺激/刺激的 hela 细胞为靶细胞，分别设未转染组，转染空载组和转 染 traf1 组，1m 阿霉素刺激各组细胞 24 小时，在荧光显微镜油镜下观察阿霉素刺 激前后 traf1 转染所导致的线粒体形态变化。 阿霉素未刺激时， 3 组细胞线粒体结构 均呈紧密的管网状结构细胞，而 traf1 转染组与未转染组和转染空载组相比，表现 为线粒体聚集。阿霉素刺激后，未转染组与转染空载组线粒体结构松散紊乱，并有片 段化的线粒体出现，而转染 traf1 组仍能保持聚集状态。 四转染四转染 traf1 可可增强增强线粒体膜电位稳定性线粒体膜电位稳定性 以阿霉素未刺激/刺激的 hela 细胞为靶细胞，分别设未转染组，转染空载组和转 染 traf1 组，1m 阿霉素刺激各组细胞 24 小时，观察阿霉素刺激前后各组细胞线粒 体膜电位的稳定性。结果显示：转染 traf1 组在阿霉素刺激前后，膜电位的稳定性 均比未转染组和转染空载组增强。 阿霉素刺激之前， traf1 组凋亡细胞与对照组和空 载组相比，分别下降了 19.8%和 21.8%；刺激后，traf1 组凋亡细胞与对照组和空载 组相比，分别下降了 16.8%和 14%。提示 traf1 能维持线粒体膜电位的稳定性。 五转染五转染 traf1 可可减少减少 caspase-9 的的活化活化 以阿霉素未刺激/刺激的 hela 细胞为靶细胞，分别设未转染组，转染空载组和转 染 traf1 组，1m 阿霉素刺激各组细胞 24 小时，通过 western blot 观察阿霉素刺激 前后各组细胞胞浆蛋白中 caspase-9 的活化。无论阿霉素刺激前后，转染 traf1 均可 使 caspase-9 的活化明显减少。结合上述膜电位的结果，提示 traf1 可能通过抑制线 粒体凋亡途径，提高线粒体膜电位的稳定性，减少 caspase-9 的活化而发挥其抵抗杀 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 5 伤的作用。 六六转染转染 traf1 可可增增加加 i b 的降解的降解 以阿霉素未刺激/刺激的 hela 细胞为靶细胞，分别设未转染组，转染空载组和转 染 traf1 组，1m 阿霉素刺激各组细胞 24 小时，观察阿霉素刺激前后各组细胞胞浆 蛋白中 ib 的降解。 转染 traf1 后，ib 的降解增加，提示 traf1 可活化 nf-b， 从而抵抗凋亡。 结论结论：traf1 可能通过增加线粒体融合蛋白 mfn1 的表达而引起线粒体聚集，此 种聚集所导致的生物学效应为抵抗细胞凋亡, 表现为转染 traf1 可抵抗化疗药物阿 霉素对 hela 细胞的杀伤。其抵抗杀伤（凋亡）的机制之一可能是通过抑制凋亡线粒 体途径：提高线粒体膜电位的稳定性、减少 caspase-9 的活化。另一方面，也可能通 过 nf-b 的活化而促进细胞生存。因此，traf1 通过影响细胞的生存和死亡两方面 的共同作用，最终发挥抵抗细胞凋亡的效应。 关键词：关键词：traf1；mfn1；线粒体；阿霉素；凋亡 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 6 the anti-apoptotic biological function and mechanism of traf1 induced aggregation of mitochondria abstract tarf1 is a member of the tumor necrosis factor receptor-associated factor (traf) family. the traf family is a group of adapter proteins that link a wide variety of cell surface receptors, including the tnf and il-1 receptor superfamily and mediate diverse signaling cascades, which ultimately lead to the activation of nf-kb(nuclear factor kb) and jnk(jun n-terminal kinase) and so on. unlike other members of traf family, traf1 does not have a ring finger and the zinc finger domain near the ring finger. traf1 can recruit a number of distinct members of the tnfr superfamily, including tnfr2, cd30, cd27, and trance-r. the overexpression of traf1 in transgenic animals demonstrates the inhibitory role of traf1 on the antigen-induced apoptosis of cd8+ cells. traf1 is also reported to achieve its anti-apoptotic effect via ciap recruitment. our previous work discovered the phenomenon of the aggregation and colocation of mitochondria and traf1 when recombinants of pdsred-traf1 was transfected into cos-7 cells. this phenomenon has a certain universality. and traf1 also has the effect of anti-apoptosis and nf- b activation in hepg2 cell. then, it was found that the overexpression of traf1 can increase mrna level of mitochondria fusion protein mfn2, suggesting that the mitochondria aggregation induced by traf1 may be associated with the fusion mechanism of mitochondria. in order to further study the mechanism and function of traf1 induced mitochondria aggregation, we use realtime-pcr method to detect mrna level changes of another mitochondria fusion protein mfn1 after hela cells being transfected with traf1. we construct a model of apoptosis of hela cell induced by adriamycin. then a cytotocity , mitochondrial membrane potential, caspase-9 and ib activation assay have been studied based on the model. 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 7 1. the overexpression of traf1 can increase mrna level of mfn1 transfect respectively hela cell with pdsred-traf1 and pdsred, non-transfected cells for the negative control, the rt-pcr results show that mfn1 expression have a certain degree of increase in the transfected pdsred-traf1 group, compared with the transfected pdsred group and control group respectively, which increased 2.48 times, 2.18 times (p0.01). it is indicated that traf1 induce the mitochondria aggregation by increasing the expression of mfn1. 2. the overexpression of traf1 can resist the injury of adriamycin treating the traf1 transfected cell and non-transfected cell by adriamycin 1m for 48 hour, using the mtt assay to detect the different cytotocity to the cells, we find that traf1 transfected cell can resist the killing of adriamycin. 3. the overexpression of traf1 (before or after adriamycin stimulation) induce mitochondria aggregation treating the traf1 transfected cell and non-transfected cell by adriamycin 1m for 24 hour, using the fluorescence microscope to observe the morphology of mitochondria, we find that the mitochondria of traf1 transfected cell is still aggregated before or after adriamycin stimulation. 4. the overexpression of traf1 (before or after adriamycin stimulation) can maitain the stability of mitochondrial membrane. treating the traf1 transfected cell and non-transfected cell by adriamycin 1m for 24 hour, using the mitochondrial membrane potential detection kit, we find that traf1 can increase the mitochondrial membrane potential before or after adriamycin stimulation. 5. the overexpression of traf1 (before or after adriamycin stimulation) can decrease the activation of caspase-9 treating the traf1 transfected cell and non-transfected cell by adriamycin 1m for 24 hour, using western blot to detect the activation of caspase-9, we find that the activation of caspase-9 was decreased in traf1 transfected cell before or after adriamycin stimulation. 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 8 6. the overexpression of traf1 (before or after adriamycin stimulation) can decrease the degradation of ib treating the traf1 transfected cell and non-transfected cell by adriamycin 1m for 24 hour, using western blot to detect the activation of caspase-9, we find that the degradation of ib was decreased in traf1 transfected cell, suggesting that the activation of nf-kb was increased before or after adriamycin stimulation. conclusion: traf1 can induce the mitochondria aggregation by increasing the expression of mitochondria fusion protein mfn1. and, traf1 may resist apoptosis by maitaining the stability of the mitochondrial membrane, decreasing the activation of caspase-9 and increasing the activation of nf-kb. all these results make a basis for a thoroughly study about the function of traf1 and the relationships of traf1 and mitochondria. key words: traf1; mfn1; mitochondria; adriamycin; apoptosis 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1 英文缩略词表英文缩略词表 adm adriamycin apaf-1 apoptotic protease activating factor-1 bsa bovine serum albumin card caspase recruitment domain cdna complementary dna ciap-1 inhibit apoptosis protein-1 depc diethyl pyrocarbonate dmso dimethyl sulfoxide h hour ib- inhibitor of nuclear factor b- lb luria-bertani mg miligram min minute mfn mitofusin mmp mitochondrial membrane potential nf-b nuclear factor kappa b pbs phosphate buffered saline pmsf pheylmethyl sulfonyl fluoride rt-pcr real time polymerase chain reaction rpm revolutions per minute stnf- secreted tumor necrosis factor- 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 2 tm-tnf- membrane associated tumor necrosis factor- tnfr tumor necrosis factor receptor traf tnf receptor associated factor tris 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1.3-aminomethane u unit 独创性声明独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 9 前前 言言 traf1 属于 tnf 受体相关因子(tnfr-associated factor traf)家族。traf 家 族是一类胞内衔接蛋白， 能介导 tnf 受体和 il-1 受体超家族的信号转导， 引起 nf-b 和 jnk 等的活化1， 从而对细胞的生存与死亡产生影响。 现已发现 7 种哺乳动物 traf 蛋白2。除 traf7 外，其他 trafs 在羧基端都有一个高度保守的 traf 结构域。根 据同源性的不同，traf 结构域可以分成氨基端和羧基端两段，分别称为 traf-n 和 traf-c。traf-n 同源性较低，长度变化较大。traf-c 同源性较高，约 50%，是 traf 分子与 tnfr 超家族成员的结合部位3。traf 分子通过 traf-c 结构域识别 tnfr 超家族成员胞浆区羧基端尾部的一小段序列，形成受体-信号分子复合物，籍此 在胞内与其他信号分子相互作用, 最终激活转录因子 nf-b 和 jnk 信号通路4, 从而 影响细胞的生存与死亡。 traf1 与 traf 家族其他成员结构迥异，其不具有其他家族成员所共有的环指 和与之相邻的锌指结构3。有研究报道，环指和锌指结构在 traf 分子活化 nf-b 的 作用中是十分重要的，其缺失和突变均可影响 nf-b 的活化5，故 traf1 可提高细 胞对凋亡的敏感性。 然而也有证据表明， traf1 作为家族中唯一不具有环指和锌指结 构的成员，亦可激活 nf-b, 表现为对凋亡的抵抗。研究发现，s-tnf-与 tnf 受体 结合后， 可募集 traf1 与 traf2， 活化下游一系列激酶， 而诱导 nf-b 活化6。 speiser 等发现转基因动物中过表达 traf1 能抑制抗原诱导的 cd8+细胞的凋亡7。也有报道 认为，traf1 能通过募集 ciap 来执行其抗凋亡作用4。 细胞凋亡信号转导途径主要包括死亡受体介导的信号途径、线粒体途径以及内质 网途径。其中线粒体途径的机制为：某些外源性因素（如化疗、紫外线照射等）可导 致线粒体膜电位去极化，膜通透性增加，内膜中细胞色素 c（cytochrome c，cyto-c） 释放入胞浆， 并与凋亡蛋白酶激活因子 1 （apoptotic protease activating factor-1， apaf-1） 和 procaspase-9、atp 在胞浆内形成多蛋白复合物，即凋亡体（apoptosome）8。在凋 亡体内，procaspase-9 的 card（caspase recruitment domain）与 apaf-1 的 card 结合 而被活化为 caspase-9，继而激活效应 caspases，最终导致细胞凋亡。 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 10 线粒体是高度动态、呈网络结构状的细胞器，其在细胞内进行着频繁的融合与分 裂。线粒体的融合致其连接为网络状，利于能量在其中的传递和信息沟通，包括膜电 位快速传递以及线粒体内容物的交换。介导线粒体融合与分裂的分子机制对于维持线 粒体的完整性是至关重要的9。在凋亡早期，线粒体的网络状结构会发生断裂，其发 生时相早于 caspases 的活化，为凋亡早期的重要指标9。 近期研究表明，线粒体融合、分裂蛋白与细胞凋亡密切相关，超表达介导线粒体 分裂分子 drp1 或 fis1 可以促进线粒体分裂，诱导细胞凋亡10；而抑制 drp1 或 fis1 则可以抑制凋亡11。而超表达介导线粒体融合分子 mfn1/2 可以促进线粒体融合，同 时抑制凋亡，而抑制 mfn1/2 则可以促进凋亡12。 线粒体融合蛋白 mfn1/2 （mitofusin 1 及 mitofusin 2） 是线粒体融合所必需的蛋白， 两者都均定位于线粒体外膜3, 13，其酵母同源物为 fzo1。抑制 fzo1 或（人）mfn1/2 的表达，可导致细胞线粒体的断裂，并促进凋亡。而过表达 fzo1 可促进线粒体的管 网状延伸，抑制细胞色素 c 的释放和促凋亡分子 bax/bak 的活性14。mfn1/2 都具有 gtp 酶活性。其中，mfn1 具有更高的 gtp 酶活性，能更有效地促使线粒体融合成管 网状结构，并抑制凋亡15。 本室的有关前期工作如下： 1. 将红色荧光蛋白 pdsred-traf1 重组质粒瞬时转 染 cos-7 细胞以表达 traf1 融合蛋白， 对转染重组体的 cos-7 细胞进行各种细胞器 （胞核，内质网，溶酶体，线粒体，高尔基体）的染色，并通过激光扫描共聚焦显微 镜观察 traf1 在 cos-7 中的定位，发现 traf1 仅定位于线粒体。而且，traf1 在 cos-7 细胞中的高表达可以导致线粒体聚集16。2. 选取若干种肿瘤细胞及非肿瘤细 胞株：293 (人胚肾细胞)、hela (人宫颈癌细胞)、hepg2 (人肝癌细胞)、 mcf-7 (人乳 腺癌细胞)、 huvec (人脐静脉上皮细胞)等进行了与cos-7细胞相同的pdsred-traf1 重组质粒的转染，通过激光扫描共聚焦显微镜检测，证实 traf1 转染不同的细胞株， 可导致线粒体聚集，且 traf1 与线粒体发生共定位。从而确定了 traf1 分子与线粒 体聚集及共定位现象的普遍性。3. 以 pdsred-traf1 转染的 hepg2 作为靶细胞，观 察高表达 tm-tnf-的效应细胞 raji 对其杀伤的影响，结果显示，转染 traf1 的 hepg2 具有明显的抵抗杀伤的作用（p0.01） ，且其 nf-b 活性明显增强。 提示高表 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 11 达 traf1 的 hepg2 可活化 nf-b， 抵抗 tm-tnf-的杀伤。 4. 通过 realtime-pcr 证实，转染 traf1 之后线粒体融合蛋白 mfn2 的 mrna 水平明显增高，提示过表达 traf1 引起的线粒体聚集可能与线粒体的融合相关。 据此，我们提出以下科学问题：高表达 traf1 导致线粒体聚集，其生物学效应 是否表现为对细胞凋亡的抵抗。如确为抵抗，其分子机制如何？是否通过线粒体融合 分子和凋亡的线粒体途径（如线粒体途径相关的线粒体膜电位、caspase-9 的变化） 、 以及 nf-b 的活化等机制影响凋亡？ 本课题拟借助 realtime-pcr 观察高表达 traf1 对另一线粒体融合蛋白 mfn1 转 录水平的影响，并以化疗药物阿霉素诱导 hela 细胞凋亡为模型，观察高表达 traf1 对于阿霉素杀伤作用的影响及其分子机制：转染 traf1，以 mtt 法检测其是否促进 或抵抗阿霉素诱导 hela 细胞的凋亡，在正置荧光显微镜的油镜下更为直观地观察转 染 traf1 前后胞内线粒体的形态改变， 观察高表达 traf1 是否导致胞内与凋亡和生 存相关分子的变化：检测凋亡线粒体通路中线粒体膜电位的变化、caspase-9 的活化， 以 western blot 检测 nf-b 活化。本研究旨在阐明 traf1 引起线粒体聚集这一现象 所导致的影响细胞凋亡的生物学效应，并深入探讨其分子机制。 材料和方法材料和方法 一材料一材料 1. 主要主要试剂：试剂： dmem、rpmi-1640 培养基(gibco 公司)；胎牛血清(四季青公司)；质粒小量快 速抽提试剂盒(博大泰克公司)；kana，lipofectinmane2000 细胞转染试剂(invitrogen 公 司)，氯化钠、葡萄糖、氯化钾、氯化钙（国产 ar 级）、hepes；trizol；无水乙醇； 氯仿； revert aid first strand cdna synthesis kit （fermentas） ;dntp 混合物 （toyobo） ， pcr 引物（上海生工）,lc taq dna polymerase(fermentas), sybr greeni(深圳百维信 生物技术有限公司)， 细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)(南京凯基生物科技发展 有限公司)，mtt (fluka switzerland)。 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 12 2. 细胞，菌株及质粒细胞，菌株及质粒 1) 细胞：hela（本室保存） 。 2) 菌株及质粒： pdsred-c1， pdsred-traf1， pcdna3.1c， pcdna 3.1c-traf1 （本室保存） 。 3. 主要设备主要设备 台式高速离心机（上海医用分析仪器厂） ； axiovert 40 cfl 荧光显微镜（蔡司光学仪器厂） ； 激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope） （olympus） ； 恒温振荡培养摇床（上海智域分析仪器制造有限公司） ； 超净工作台（苏州净化设备公司） ； dna 定量测定仪（瑞典，pharmacia biotech） ； 凝胶图像分析系统（上海培清科技有限公司） ； 4800 型 pcr 扩增仪（perkin elmer，usa） 恒压电泳仪（北京东方仪器厂） ； 低温高速离心机（eppendorf，germany） ； rotor-gene 3000a -80低温冰箱(德国 nuaire)； 正置荧光显微镜(日本 olympus)； 倒置显微镜(日本 nikon)； 二实验方法二实验方法 1.细胞复苏、培养及冻存细胞复苏、培养及冻存 1.1 培养基配制培养基配制 1) rpmi1640 培养基 rpmi 1640 干粉 10.4g 谷胺酰氨 0.15g 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 13 nahco3 2.0g hepes 3.0g 将上述各成分用四蒸水溶解，调 ph 至 7.2，定容 1000ml。正压过滤除菌，分 装后-20c 冻存。在配好的 rpmi1640 培养基中加入小牛血清，使其终浓度为 10%15%，即为完全培养基，可用于悬浮细胞的培养。 2) dmem 培养基 dmem 干粉 10.4g 谷胺酰氨 0.15g nahco3 2.0g hepes 3.0g 将上述各成分用四蒸水溶解，调 ph 至 7.0，定容 1000ml。正压过滤除菌，分 装后-20c冻存。 在配好的dmem培养基中加入小牛血清， 使其终浓度为10%15%， 即为完全培养基，可用于贴壁细胞的培养。 3) 胰蛋白酶消化液 胰蛋白酶 2.5g edta-na 0.3g nacl 8.0g kcl 0.4g 葡萄糖 1.0g nahco3 0.5g 酚红 0.003g 调 ph 值至 7.4, 定容至 1000ml, 正压过滤除菌，分装后，-20c 保存。 1.2 细胞复苏细胞复苏 于-80c 冰箱中取出冻存细胞迅速放入 37水浴箱中， 摇动冻存管使之在 1min 内解冻；在超净工作台内用 70%酒精棉球擦拭冻存管外周，旋开管盖，用无菌玻璃 吸管吸出细胞悬液，转至已加好预温的无血清培养基的无菌离心管中，洗涤细胞； 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 14 低速(800rpm)离心 5min，弃去上清，重复洗涤一次，沉淀的细胞用完全培养基重悬 后转入无菌培养瓶中，加入适量完全培养基，置 5%co2培养箱中 37c 培养，次日 更换一次培养液。 1.3 细胞培养细胞培养 在 37c，含有 5%co2的培养箱中，以含有 10%胎牛血清的 dmem 培养 hela 细胞。也可根据细胞种类和状态选择合适的血清浓度的培养基，随时观察细胞的状 态和数量，及时换液和传代。待细胞进入对数生长期后，用于实验。 1.4 细胞冻存细胞冻存 待细胞增殖进入对数生长期时，可收集冻存。在冻存前 24h 进行换液；贴壁细 胞用 0.25%的胰酶消化液解黏附，继而用无菌玻璃吸管轻轻吹打，使细胞完全悬浮， 离心收集细胞，用含 10%dmso，30%血清的完全培养基重悬，并调整细胞浓度为 5 106/ml，按每管 1ml 的体积分装入无菌冻存管中，先于 4c 放置 30min， 然后于 -80c 冰箱保存。 2. 正置正置荧光显微镜荧光显微镜检测检测 traf1 及线粒体的分布及线粒体的分布 2.1 pdsred-c1，pdsred-traf1 质粒的质粒的小量制备小量制备 2.1.1 试剂 博大泰克质粒小提试剂盒 lb 液体培养基的制备： 在 450ml 去离子水中加入蛋白胨 5g，酵母提取物 2.5g，nacl 5g， 振荡容器使溶质完全溶解，加入去离子水至总体积 500ml。高压蒸汽灭菌 20min，储存于 4。 普通 lb 固体培养基制备： 在 lb 液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为 1.5， 高压灭菌后倒入灭菌玻 璃平皿中，待完全冷却凝固后，37放置 6h 后，4保存备用。 选择性固体培养基制备： 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 15 按上述普通固体培养基的配制方法配制并高压灭菌，冷却至 50时加入 抗生素，摇匀后按上述方法铺制平板。 2.1.2 实验方法 1) 将单菌落分别接种到 3ml 卡那霉素（50g/ml）的 lb 培养液中，于 37振 荡培养过夜。 2) 取菌液置 1.5ml 的 eppendorf（ep）管中，12,000rpm 离心 30s，弃上清，并 吸干管壁上的液体。 3) 再加入菌液置 1.5ml 的 eppendorf（ep）管中，12,000rpm 离心 30s，弃上清， 并吸干管壁上的液体。 4) 按照博大泰克质粒小提试剂盒说明书加入溶液，振荡混匀，置冰上。 5) 加入溶液，上下颠倒几次，轻柔混匀后置于冰上 2min。 6) 加入溶液，上下颠倒几次，轻柔混匀后置于冰上 5min。 7) 12,000rpm 离心 5min，取上清至另一 eppendorf 管中。 8) 将上一步的上清 12,000rpm 离心 10min。 9) 将上清转入离心吸附柱中，并加入 420 l 的结合缓冲液，低速离心直至液体 离下去，弃去废液。 10) 75乙醇洗涤 750 l 加入柱内，8000rpm，1min，重复一次。 11) 12,000rpm，2min，彻底弃去残留乙醇。 12) 取出新的 eppendorf 管做标记，取出柱子插到 eppendorf 管中，对准柱子的 中央加入 50 l 灭菌后的超纯水，静置 5min 后，12,000rpm 离心 2min，取出 内芯扔掉。 13) 收集离心液，于20保存。 14) 取 3 l 质粒与 1 l 6dna 上样缓冲液混合，通过 1%琼脂糖凝胶电泳， 鉴定质粒的大小和浓度。 2.2 traf1 目的基因目的基因的的瞬瞬时时转染转染 2.2.1 试剂： 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 16 lipofectamine 2000 reagent(invitriogen 公司),dmem 液体培养基,小牛 血清(四季青),胰酶，optiment 无血清培养基 2.2.2 方法： (1) hela 细胞的复苏及培养 。 (2) 1ml 胰酶消化贴壁的 hela 细胞 1min,在显微镜下观察细胞变圆后迅速加入 10%fcs dmem，镜下观察细胞密度。 (3) 将细胞小心转入 24 孔板， 置 37， 5%co2继续培养 8 小时， 待细胞充分贴壁。 (4) 小心延孔壁边缘吸出预先加入的 10%fcs dmem，然后取无血清 dmem 培养 基冲洗三次，最后每孔加入 500l 无血清 dmem 培养基。 (5) 将 1g 质粒加入 50l optiment 无血清培养基中稀释，同时取 1l 脂质体加 入另外 50loptiment 中，并室温放置 5min。 (6) 将用 optiment 稀释好的质粒和脂质体混匀，并于室温放置 20min。将混合 物小心加入铺有 hela 的 24 孔板中，置 37，5%co2温箱培养 46h 后更换培 养基，继续培养 2448h。 (7) 置荧光倒置显微镜下观察转染结果或于流式细胞仪分析。 2.2.3 实验分组 未刺激组：未转染 hela 组，转染空载 pdsred-c1 组，转染 pdsred- traf1 组 阿霉素刺激组：未转染 hela组，转染空载pdsred-c1组，转染pdsred- traf1组 3. 流式细胞术检测瞬时转染的转染效率流式细胞术检测瞬时转染的转染效率 3.1 试剂 磷酸盐缓冲液（pbs） 将 8.0g nacl,0.2gkcl,1.44g na2hpo4,0.24g kh2po4, 溶于 800ml 蒸馏水中，将 ph 值调整至 7.4，补充蒸馏水至 1l,分装，高压灭菌，室温保存。 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 17 3.2 实验方法 1) 将孔板中 pdsred-c1，traf1-pdsred 转染时间约 24-48 h 细胞收集起来， 1000rpm/min,离心 5min，弃去上清。 2) 加 pbs 洗涤，1000rpm/min,离心 5min，弃去上清，用残留的 pbs 将细胞重悬。 3) 以未转染 hela 细胞为阴性对照， 检测 pdsred-c1， traf1-pdsred 质粒转染 hela 细胞的效率。 4. 实时荧光定量实时荧光定量 pcr 法检测法检测 mfn1 基因的表达基因的表达 4.1 pdsred-c1，pdsred- traf1 质粒的小量制备质粒的小量制备 实验试剂及方法如 2.1 所述。 4.2 目的基因瞬目的基因瞬时时转染转染 试剂及方法同 2.2 所述。 4.3 trizol 法提取细胞总法提取细胞总 rna 4.3.1 试剂 trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，revert aid first strand cdna synthesis kit （fermentas） 4.3.2 实验方法 1) 将 pdsred-c1，pdsred- traf1 转染后的及未转染细胞分别收集起来，每 1 106个细胞，加 1ml trizol，枪头反复吹打混匀。 2) 按照 200 l/ml trizol，每管加入氯仿后漩涡振荡器上高速剧烈震荡 1min，然 后静置 5min。 3) 于 4 12000g 离心 15min。 4) 吸取上层水相至另一离心管中，注意不要吸到中间界面。 5) 按 0.5ml 异丙醇/ml trizol 加入异丙醇，混匀，于-20放置 5-10min。 6) 4 12000g 离心 10min，弃上清。 7) 按 1ml 75%乙醇/ml trizo 加入 75%乙醇，轻弹管底，使 rna 悬浮。 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 18 8) 4 8000g 离心 5min，尽量去上清，室温晾干。 9) 用 depc 处理过的水溶解 rna 样品。