（农业昆虫与害虫防治专业论文）cad杂合肽基因在毕赤酵母中的表达及活性的检测.pdf

王烈喜l 卜d i 火学! 位论文 c a d 杂合肽基因在毕赤酵母中的表达及活性检测 硕：i 二生：王烈喜 导师：张文庆教授 摘要 天蚕素( c e c r o p i n s ) 是昆虫抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ) 的一种，是 最早被发现的一类抗菌肽，由31 3 9 个氨基酸残基组成，分子量约为4 k d a 左 右，等电点约为8 9 9 5 ，表现出较强的阳离子特征；不含半胱氨酸( c y s ) ，不 能形成分子内二硫桥，抗菌谱主要包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，对病毒、 肿瘤细胞、原虫、真菌也有一一定的抑制作用。而且耐高温，1 0 0 。c 加热仍能保持 一定的活性。 本研究根据家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 成熟肽c e c r o p i n a 和惜古比天蚕 ( h y a l o p h o r ac e c r o p o a ) 成熟肽c e c r o p i n d 的氨基酸序列，构建了杂和肽c a d ， 运用生物学软件d n a s t a r 对其轮状结构进行预测，结果显示c a d 的n 末端具有较强 的亲水性，c 末端具有较强的疏水性，预钡u c a d 具有较强的杀菌活性。通过选用毕 赤酵母偏爱密码子，合成t c a d 的4 个片断，两两重叠互补2 0 个碱基，为便于纯 化表达的c a d ，在c a d 的c 末端加入了6 h i s t a g ，循环式p c r 扩增得到t c a d 的全 序列。克隆到毕赤酵母p p i c 9 表达载体上。构建了酵母分泌型表达载体p p i c 9 一c a d ， 用s a ci 线性化后，电击法转化毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) g s l l 5 宿主菌，经 m m 板和m d 板进行表型筛选结果9 0 以上为h i s + m u t5 ，经p c r 鉴定目的基因己稳定 整合到毕赤酵母基因组上。对p c r 鉴定正确的阳性克隆用甲醇诱导表达后，经 t r i s t r i c i n e s d s p a g e 电泳检测表明，表达产物为5 1 k d a ，与软件分析的一致， 表明c a d 在信引j 太a f a c t o r 的介导下，正确分泌到表达上清中。利用琼脂孔穴平 板扩散法，杀菌效价等方法测定其活性，结果证明c a d 杂合肽基因在酵母中得到 表达，表达产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、和非溶血性弧菌等具 有一定的活性。 关键词：抗菌肽c e c r o p i nc a d 杂合肽p i c h i ap a s t o r i s _ _ i j ：烈喜一i i l 大学学位沦文 e x p r e s s i o no fc e c r o p i n a c e c r o p i n dh y b r i dg e n e i np i c h i a p a s t o r & a n di t sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t y a b s t r a c t m a s t e rc a n d i d a t e ：w a n gl i e - x i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n gw e n q i n g a b s t r a c t t h ec e c r o p i n sa r eaw e l lc h a r a c t e r i z e df a m i l yo fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s m a t u r e c e c r o p i n sa r eh i g h l yb a s i c31 - 3 9a m i n oa c i dr e s i d u ep e p t i d e st h a tc a nf o l di n t ot w o a m p h i p a t h i c u h e l i c s ，s e p a r a t e db yam o r ef l e x i b l eh i n g e t h e ys h o wav e r yb r o a d s p e c t r u mo fa c t i v i t ya g a i n s tb o t hg r a m p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a , m o r e o v e lt h e ya l s oh a v ea na n t i f u n g a la n da n t i v i r u sa c t i v i t y i na d d i t i o n ，t h e ys h a r e c o m m o nf e a t u r e st h a tt h e yh a v ep r o p e r t yo fas m a l lm o l e c u l a rw e i g h t ，ap o s i t i v en e t c h a r g ea tp l a y s i o l o g i c a lp h ，h e a ts t a b i l i t y i nt h i sp r e s e n ts t u d y , t oc l o n ea n dm o d i f y t h eg e n ee n c o d i n gt h ec e c r o p i n ，f o rc o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o r so fc e c r o p i n c a da n di t sm u t a n t s ，f o re x p r e s s i o na n dt h e i rb r o a ds p e c t r u ma c t i v i t ya g a i n s tb a c t e r i a l t h e s es t u d i e sl a yf o u n d a t i o nf o rp r o d u c t i o na n du t i l i z a t i o n o f c e c r o p i n s i nt h i ss t u d y , t h ec e c r o p i n a - c e c r o p i n dh y b r i da n a l o g u ew a s d e s i g n e db a s e do nt h e m a t u r en u c l e o t i d es e q u e n c eo f t h ec e c r o p i n ag e n e sf r o mm u s c ad o m e s t i c aa n d c e e r o p i n dg e n e sf r o mh y a l o p h o r ac e c r o p o a ，w h i c hw e r ea m p l i f i e db yr e c u r s i v ep c r ， u s i n gt h ep r e f e r e n t i a lc o d o no f p i c h i a p a d t o r i sa n d4p r i m e r s i no r d e rt of a c i l i t a t e p u r i f i c a t i o no f t h ee x p r e s s e dc e c r o p i nf r o mt h epp a s t o r i sc u l t u r a lm e d i u m ，ah i s t a g w e r ed e s i g n e dt ol i g a t e di n t ot h ec - t e r m i n a l t h ee n c o d e d g e n ew a sl i g a t e di n t ot h e p l a s m i dp p i c 9a n di tw a si n d i c a t e dt h a tap r o d u c t i v ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 一c a d w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h ep p i c 9 一c a dw a sl i n e a r i z e db ys a cid i g e s t i o na n d t r a n s f o r m e di n t op p a s t o r i sg s i l 5b ye l e c t r o p o r a t i o na n di n t e g r a t e di n t ot h e i r 。 l i 下烈喜 1 1 人学j 位沦文 g e n o m e t h et a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e db yt h ep l a t e so fm d a n di d e n t i f i e dt h e p h e n o t y p e sb ym d a n dm m a f t e rf e r m e n t a t i o na n di n d u c e db ym e t h a n 0 1 t h e e x p r e s s i o np r o d u c tw a st e s t e db yt r i s t d e i n e s d s p a g e ，a g a rp l a t ec a v i t yd i f f u s e t e s ta n db a c t e r i a li n h i b i t i o ne f f e c t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec e e r o p i n a - c e c r o p i n d h y b r i d a n a l o g u e w a sa5 1 k d a p r o t e i na n d h a s b e e ne x p r e s s e d i n t h e g s l l 5s t r a i na n d p r o d u c th a sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u , v p a r a h a e m a l y t i c u s , ya l g i n o l g t i c u s , e s c h e r i c h i ac o i l k e yw o r d s ：a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sc e c r o p i n s c a d h y b r i dp i c h i a p a s t o r & u 下烈喜t i t l i 大学学位论文 第一章前言 自从青霉素问世以来，迄今为止已经发现了许多抗生素，这些抗生素在治疗 感染性疾病中发挥了巨大的作用，大大地延长了人类的预期寿命。但是随着抗生 索的广泛使用，细菌耐药性逐年增加，致使一些抗生素疗效降低，甚至无效。面 对日益严重的细菌耐药性对未来的健康所带来的极大威胁，人们迫切需要找到一 些无公害的新型抗菌剂来代替抗生索在医疗、食品和农业方面的应用。在这样的 背景下，抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i e ) 逐渐引起了大家的注意。 昆虫抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ) 是昆虫遭受外界异物的刺激或病原微生 物的感染而快速产生的一类具有生物活性的短链多肽。具有抗菌谱广、热稳定性 强、良好的溶解性、分子量小及无免疫原性、对较高的离子强度或较大的p h 变 化有较好的耐受性等特点，其杀菌机制独特，不易产生耐药菌，有望发展成为新 一代肽类抗生素( z a s l o f f e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 根据氨基酸组成和结构特征可分为四类( h o f f m a n ne ta 1 ，1 9 9 5 ；陈留存等， 1 9 9 9 ) ：即形成两性分子n 一螺旋的抗细菌肽类天蚕素类( c e c r o p i n s ) 、分子内含 有二硫桥的昆虫抗菌肽类昆虫防御素( i n s e c td e f e n s i n s ) 、富含有脯氨酸的抗菌 肽( p r o l i n e - r i c hp e p t i d e s ) 、富含有甘氨酸的抗菌肽( g l y c i n e r i c hp e p t i d e s ) 。天蚕 素( c e c r o p i n s ) 类抗菌肽广泛存在于动物界中，分子量约为4 k d a ，由3 1 - - 3 9 个 氨基酸残基组成。天蚕素类抗菌肽特征：分子内刁；含半胱氨酸、不形成分子内二 硫桥，但能形成两个两性n 螺旋。n 端和c 端都有a 螺旋结构。n 端通常呈碱性， 带正电荷，亲水；c 端酰胺化，中性或微酸性，不带电或带少量负电荷，疏水。 ( h o f f a n ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 抗菌肽在应用上往往受本身一些结构或者性质所限制。例如蜂毒素m e l l i t i n s 具有强烈的细胞毒素，防御素( i n s e c t sd e f e n s i n s ) 只对革兰氏阳性菌有杀伤作用， 人们希望能够找到结合抗菌肽的优点而摒弃其缺点的有效抗菌肽，这时抗菌肽的 改造就成为解决这个问题的一个非常好的方式! 目前通过分子剪接的方法来设计 杂合抗菌肽的方法式研究和改造抗菌肽的一个常用方法。b o m a n 等( 1 9 8 9 ) 设 计合成的c a m 是由c e c r o p i n a 的n 端1 1 3 片段和蜂毒素( m e l i t t i n ) 的n 端1 1 3 王烈甚i | i 大学学位沦文 片段构成的2 6 肽；a n d r e u 等( 1 9 8 8 ) 设计合成了一系列c e c r o p i na m e l i t t i n 杂 合肽，如c a ( 1 7 ) m ( 2 9 ) 、c a ( 1 - 7 ) m ( 4 1 1 ) 、c a ( 1 - 7 ) m ( 5 - 1 2 ) 。研 究结果发现，这些杂合肽具有与c e c r o p i n a 相似或更强的抗菌活性和抗菌谱。抗 菌肽有效的改造为抗菌肽的研究和开发应用提供了一个很好的基础。 尽管抗菌肽有着众多的优点，但是天然抗菌肽在昆虫中的含量很少，直接从 昆虫血淋巴中纯化蛋白或者化学合成抗菌肽需要花费高昂的成本。这些都不利于 抗苗肽的大量应用，目前主要是通过基因工程技术将不同来源的抗菌肽基因拼接 或将抗菌肽基因与其他小分子蛋白融合后在原核细胞中表达( 陈海旭等，2 0 0 1 ： 邱定红等，2 0 0 2 ；朱嘉明等，2 0 0 2 ：周霞等，2 0 0 3 ) 。但是，由于融合表达产物 存在难以分离、表达量少或者抗菌活性较低等诸多问题，这些依然是抗菌肽应用 方面亟需解决的问题。毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统作为近几年新兴的外源 蛋白表达系统，已表现出相当大的潜力。毕赤酵母表达系统有许多优点：( 1 ) 利 用受甲醇诱导的醇氧化酶( a l c o h o l o x i d a s e l ，a o x l ) 启动子，可严格控制外源基因 的表达；( 2 ) 毕赤酵母作为一种真核细胞生物，可以进行翻译后的蛋白加工，以 使外源蛋白得到正确的折叠和修饰；样品不必象原核系统那样要经过复杂的变性 和复性后期加工( 3 ) 毕赤酵母生长快速，培养条件简单，适合高密度培养，发酵 后每升培养液中细胞湿重可达4 5 0 克，有利于提高目的蛋白产量( l i ne ta l ， 2 0 0 1 ) 。这些优点显示了毕氏酵母在生产有用的蛋白质和多肽类物质具有良好的 前景。 本文在对家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 成熟肽c e c r o p i n a 和惜古比天蚕 ( h y a l o p h o r ac e c r o p o a ) 成熟肽c e c r o p i n d 蛋白序列分析的基础之上，通过分析 其功能，构建一个c e i 1 1 c m l 2 - - 3 7 的杂和成熟肽目的基因片断，并在c 一端融 合了一个6 h i s 接头，利用毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统在体外进行 表达，并进行活性检测，初步探索家蝇c e c r o p f n 活性部位改造对其活性的影响， 为日后获得抗菌活性更高、抗菌谱更广的抗菌肽打下一定的基础。同时，也为抗 菌肽蛋白的分离纯化提供材料。 下烈喜小i i i 大学学位沦文 第二章昆虫抗菌肽的研究进展 昆虫作为动物中数目最大的一个种群，在长期的进化过程中形成复杂而高效 的免疫体系。目前认为昆虫抵御外来病菌是依靠三道相互连接的反应来实现的， 其主要过程如下：( 1 ) 当昆虫受到创伤时，会使酚氧化酶原在酚氧化酶原激活系 统作用下形成酚氧化酶，酚氧化酶激活黑色素在伤口处沉淀形成结节。这种情况 即使是刁i 存在潜在的有害的微生物时也会发生。( 2 ) 细胞的防御反应，主要是以 细胞对入侵的微生物的吞噬作用和( 或) 形成包囊为主( 3 ) 在脂肪体中瞬间快 速地诱导合成一系列的具有抗菌活性的多肽和抗菌蛋白。在第三个过程中产生的 抗菌多肽或者蛋白，几乎都是阳离子和小蛋白，但是对细菌或者真菌都有广谱的 抑菌作用。这些多肽或者蛋白分布到血淋巴中一起协助杀死入侵的微生物。 ( h o f f m a n ne l a l ，1 9 9 5 ) 最初人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“a n t i b a c t e r i a l p e p t i d e s ”，中文译为“抗菌肽”，其原意应为“抗细菌肽”。后来发现有些“抗细 菌肽”还具有抗真菌等其它微生物的功能，便称之为“a n t i m i c r o b i a lp e p r i d e s ”。 但是随着研究的深入，人们相继发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌细胞等 功能，但是由于几乎所有的多肽抗生素都具有抗细菌的功能，“抗菌肽”作为一 个约定俗成的名称，在国内依然被广泛采用。 1 9 7 2 年，瑞典科学家b o m a n 等人用蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 诱导惜 古比天蚕( h y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 后产生了抗菌多肽物质。随后发现了世界上第 一个抗菌肽一天蚕素( c e c r o p i n s ) 。( f a y ee ta 1 ，1 9 7 5 ) 。此后许多抗菌肽相继被分 离、纯化。这类小分子多肽对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌、某些病毒、原虫和发 生病变的真核细胞具有很强的抑制效果。在昆虫的体内抗菌肽属于非专一性免疫 应答产物，可被细菌或糖蛋白脂蛋白等细菌的细胞壁成分诱导产生( b o m ae t a 1 ，2 0 0 3 ) 。由于其广谱的抗菌性和独特的杀菌作用机制，引起了人们的广泛关注。 特别是由于抗生素的滥用而导致耐药菌株的不断产生，人们开始筛选新型的抗菌 药物来代替传统的抗生素，抗菌肽的研究引起了人们极大的兴趣。本文就昆虫抗 菌肽的分类、作用机制、抗菌肽的基因工程、抗菌肽的应用及存在的问题等作一 个系统的综述。 王烈喜中i h 大学# o 似沦文 2 1 昆虫抗菌肽的分类 昆虫物种在自然界广泛分布，刁i 同的昆虫中存在的抗菌物质有所卅i 同，所以 昆虫的抗菌肽来源众多。主要集中在鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、半翅目、 等翅目、同翅目、蜻蜒目等8 目3 0 多种昆虫中。迄今为止在昆虫中发现的抗菌 物质有2 0 0 多种( l a m b e r t ye ta 1 ，2 0 0 1 ；b o m ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 最早对抗菌肽的分类主要是依据是抗菌肽的来源，如在什么生物体分离鉴定 即命名为某某抗菌肽，如柞蚕抗菌肽。随着越来越多的抗菌肽被发现，又根据其 化学组成、二级或三级空间结构以及其功能进行分类。有学者将抗菌肽根据抗菌 肽空间结构简单地分为线肽和环肽两大类( h o f f m a n ne t a l ，1 9 9 6 ) 。b o m a n n l 9 9 8 年根据抗菌肽的基因研究的最新成果，对抗菌肽进行了重新的分类。( 王可州等， 2 0 0 5 ) 目前更倾向于根据其序列、结构和抗菌特性等，将动物来源的阳离子抗菌 肽分为以下四类。即：( 1 ) 4 i 含半胱氨酸的线肽例如天蚕素( c e c r o p i n s ) 和马盖 宁( m a g a i n i n s ) ；( 2 ) 含等量半胱氨酸的抗菌肽如昆虫防御素( i n s e c td e f e n s i n s ) 等； ( 3 ) 富含( 1 2 ) 种氨基酸的线肽，主要是富含脯氨酸抗菌肽如意大利蜜蜂素 ( a p i d a e c i n ) 蜂毒素( m e l i t t i n ) 和富含甘氨酸的抗菌肽如袭击素( a t t a c i n s ) 等。( 宋家 清等，2 0 0 4 ；宫霞等，2 0 0 2 ；耿华等，2 0 0 4 ；b r o g d e n e t a l ，2 0 0 3 ；h o f f m a n ，1 9 9 5 ； c h r i s t e n s e n ，1 9 8 8 ；b o m a n ne t a l ，1 9 9 8 ) 也有人将第三类抗菌肽分为富含脯氨酸 抗菌肽和富含甘氨酸的抗菌肽( 陈留存等，1 9 9 9 ) 。 2 1 1 不含半胱氨酸的抗茵肽：天蚕素类( c e c r o p i n s ) b o m a n 等( 1 9 8 1 ) 首先从诱导的惜古比天蚕中分离出c e c r o p i n ，随后在果蝇、 烟角天蛾中分离出此类抗菌肽。目前已经从鳞翅目和双翅目昆虫中分离出2 0 多 种c e c r o p i n s 类似物( h o f f a n ne t a l ，1 9 9 4 ) 。其一级结构具有以下特征：由3 1 3 9 个氨基酸残基组成，分子量约为4 k d a 左右，等电点约为8 9 - - 9 5 ，表现出较 强的阳离子特征：不含半胱氨酸( c y s ) ，不能形成分子内二硫桥；n 一端呈强碱 性，带正电荷，亲水；c 一末端酰胺化，中性或微酸性，不带电或带少量负电荷， 疏水；n 一端和c 一端都能形成a 螺旋结构。在肽的许多特定位置有较保守的残 基，如2 位上的色氨酸，5 、8 和9 位有1 个或2 个赖氨酸( l y s ) ，1 l 位是天冬 6 下烈喜1 1 【1 1 人学学位论文 氨酸( a s n ) ，1 2 位是精氨酸( a r g ) 。有些位置尽管残基不同，但仍为保守替换。 对抗菌肽二级结构的理论预测及c d 谱和二维核磁共振数据表明，其分子机构含 有2 个c c 一螺旋：5 、2 1 位为第一个螺旋，该螺旋种极性和非极性氨基酸含量相当， 因而对水和脂均具有亲和性，为两亲性旺一螺旋；2 5 3 7 为第二个螺旋，其疏 水氨基酸含量高，故该a 螺旋疏水性强。两个一螺旋间由2 2 2 4 位的丙氨酸一 甘氨酸脯氨酸( a l a g l y p r o ) 组成的铰链区连接( 叶星等，2 0 0 0 ) 。c e e r o p i n s 的抗菌谱主要包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，对病毒、肿瘤细胞、原虫、真 菌也有一定的抑制作用。而且耐高温，1 0 0 加热仍能保持一定的活性。不易被 胰蛋白酶和胃蛋白酶水解。 2 1 2 富含半胱氨酸抗菌肽：防御素类( i n s e c t sd e f e n s i n s ) 这类昆虫抗菌肽又称为昆虫防御素，是昆虫抗菌肽种分布最广泛的一族，首 先从肉蝇( p h o r m i a t e r r a n o v a e ) 中分离出来，后来从麻蝇( s a r c o p h a g a p e r e g r i n e ) 中也分离到防御素的家族成员( o k a d a ，1 9 8 4 ) 。目前已经在半翅目、双翅目、鞘 翅目、膜翅目、蜻蜒目种发现了1 5 大类，4 0 多种该类抗菌肽。其主要对革兰氏 阳性菌起作用，对革兰氏阴性菌、真菌和原核细胞几何没有什么效果。 此类抗菌肽与c e c r o p i n s 类似，在分子中也形成两性分子的n 螺旋结构，但 在分子中含有半胱氨酸，并形成分子内环状结构。昆虫的d e f e n s i n s 分子为疏水 性分子，一般含3 6 4 6 个氨基酸( 从蜜蜂中分离的d e f e n s i n s 为5 1 个氨基酸) ( h o t f i n a n ne ta 1 ，1 9 9 8 ) ，由6 个半胱氨酸形成3 个二硫键c y s l c ，s 4 ，c y s 2 - - c y s 5 ，c y s 3 - - c y s 6 。在三维结构上是一个紧密折叠的球形结构，含有1 个末 端氨基化的环形结构，1 个居于中部的旺一螺旋和1 个双链的c 一末端b 片层结构。 b 片层结构的第一链通过c y s l - - c y s 4 这对二硫键与末端氨基化的环相连；第2 链通过c y s 2 - - c y s 5 、c y s 3 - - c y s 6 两对二硫键与中部的位一螺旋结构相连，共同构 成邮b 的空间结构( p h i l i p eb u l e t ，2 0 0 3 ；j o nn i s s e n m e y e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。昆虫的 d e f e n s i n s 分子在特异的细胞中表达的初期产物以前体分子形式存在。其合成前体 含有1 个2 3 个氨基酸残基的信号序列，1 个3 4 个氨基酸残基的前导序列和一个 d e f e n s i n s 序列。经氨基酸序列比对，从不同种类昆虫中分离得到的d e f e n s i n s 具 有5 8 9 5 相似性( p h i l i p eb u l e te ta 1 ，1 9 9 9 ) 。最近有研究发现，从双翅目昆 虫s t o m o x y sc a l c i t r a n s 中分离得到的d e f e n s i n s 与大部分昆虫d e f e n s i n s 相比n - 末端延伸出6 个氨基酸残基( l e h a n ee ta 1 ，19 9 8 ) ；从双膜翅目昆虫a p i s m e l l i f e r a 和b o m b u sp a s c u o r u m 中分离得到的d e f e n s i n s 与大部分昆虫d e f e n s i n s 才h 比c 一末 端延伸出1 2 个氨基酸残基，而且这1 2 个氨基酸残基可折叠形成甜螺旋结构( 耿 华等，2 0 0 4 ：r e e se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 2 1 3 富含脯氨酸类抗菌肽( p r o l i n e - r i c hp e p t i d e s ) 目前已经在膜翅目、双翅目、半翅目、鳞翅目昆虫中分离得到，他们在氨基 酸组成和序列上具有高度的很高的相似性。富含脯氨酸的昆虫抗菌肽分子为1 5 - 3 9 个氨基酸长，分子中脯氨酸含量大于2 5 ，并日，分子中常同时含有精氨酸 ( a r g ) 和赖氨酸( l y e ) ( p h i l i p eb u l e te ta 1 ，1 9 9 9 ) 。主要抑制革兰氏阴性菌。 到目前为止主要包括a p i d a e c i n 、a b a e c i n 、d r o s o c i n 、p y r r h o c o r i c i n 、m e t a l n i k o n i n s 、 d i p t e r i c i n 。富含脯氨酸的抗菌肽可分为两类，类：是不具有取代基，包括 a p i d a e c i n s 、m e t a l n i k a w i n s ；另一类：o 一糖基化，包括d r o s o c i n 、p y r r h o c i o r i c i n ， 它们都带有一个n 乙酰半乳糖胺一半乳糖与其中的苏氨酸( t 相连。 这两类抗菌肽高度同源，结构上的区别在于第二类有的苏氨酸( t h r ) 羟基上发 生糖基化。有人推测富含p r o 的抗菌肽可能原来都带有取代基，在进化过程中， 由于编码t h r 的密码子发生突变，使某些抗菌肽一级结构中缺少t l r ，因而失去 取代基，如第一类。但取代基对抗菌活性有一定影响，有研究表明珥i 含取代基的 抗菌肽或原来带取代基的的抗菌肽分子在失去取代基之后，他们的活性都明显下 降。另一些则保留t h r ，就形成第二类抗菌肽。富含脯氨酸的抗菌肽一级结构中 有多个特征性的p m a 嚷一p r o 基序( p h i l i p e b u l e te l a l ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ；h e t r ue t a l ， 1 9 9 3 ：o t v o se t a l ，2 0 0 2 ) 。 2 1 4 富含甘氨酸类抗菌肽( g l y c i n e r i c hp e p t i d e s ) 这是近几年才从天蚕、麻蝇中发现的一类抗菌肽，其共同特点是一级结构中 富含g l y ，有些是全序中富含g l y ，如鞘翅肽( c o l e o p t e r i c i n ) 、半翅肽( h e m i p t e r i c i n ) ， 有些是某一结构域中富含g l y ，如双翅肽( d i p t e r i c i n s ) 、肉蝇毒素i i ( s a r c o t o x i n i i ) 、 王烈喜小1 1 1 人学学位论文 樗蚕素( a t t a c i n ) 等，它们都含有一个g 结构域。分子量约为8 3 0 k d a ，有的可 发生o 一糖基化( p h i l i p eb u l e te t a l ，1 9 9 3 ) 。这类抗菌肽多为阳离子，剥革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌性。其中在鳞翅目昆虫的免疫血淋巴中分离 得到的g l o v e r i n s ，分子量为1 4 k d a ，其中含1 8 的甘氨酸残基，而且其氨基酸 序列与其他昆虫抗菌肽无较大相似性( m a c k i n t o s he ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 2 2 抗菌肽的作用机制 昆虫的抗菌肽的作用范围及其广泛，已经发现对细菌、真菌、病毒、癌细胞、 寄生虫等都有杀死或者抑制作用。人们研究发现其对各种作用物的机制是不完全 一样的。即使是对同一类作用目的物，由于来源和分类不一样，其作用的机制也 可能不完全一样，这已经引起人们的广泛关注。 2 2 1 抗菌肽的抗菌作用机制 抗菌肽的作用机制是目前研究抗菌肽的一个非常热门的方向。虽然有很多关 于抗菌肽作用机理的报道，但是由于目前的研究都是在人工脂质膜上极性的，而 人工脂质膜和细胞膜在组成和结构上存在差异，细胞生长的环境和试验条件也不 = 7 相同，研究结果并不能完全代表抗菌肽在细胞中的作用状态。( 江龙法等，2 0 0 5 ) 。 严格意义上来说还没有形成一个能够解释一切的抗菌作用机制。研究发现来源于 不同家族的抗菌肽其作用方式是不一样的。目前对抗菌肽的作用机制研究较多的 有以下几种认识：( 1 ) 对质膜的作用；( 2 ) 抑制细胞的呼吸作用；( 3 ) 抑制细胞 外或胞内膜蛋白的形成；( 4 ) 抑制细胞壁的形成。 2 2 1 1 对质膜的作用 阳离子抗菌肽可通过电荷间的相互作用和细胞膜外层结构结合。革兰氏阴性 菌的细胞外膜含有带负电的脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) ，抗菌肽可取代结 合在l p s _ 1 2 能j m 9 2 + 、c a 2 + 等二价阳离子，引起外膜破裂或穿孔而透过外膜 ( h a n c o c kr e ，2 0 0 1 ) 。通过外膜的抗菌肽和细胞内膜上带负电荷的磷脂通过静 电引力结合，在细胞膜形成空洞或临时通道，从而引起崩解或透过细胞膜。国内 9 下烈每一l l 火学# 位论文 外学者对此研究较多，1 9 8 4 年o k a d a 等人提出抗菌肽起到了离子泵的作用，使细 胞内k + 离子迅速析出，a t p 含量迅速下降，继而导致细胞死亡。1 9 8 8 年c h r i s t e n s e n 等通过测定抗菌肽处理后的脂质体的膜电势和电流变化，判断出抗菌肽在膜上形 成了孔道。1 9 9 3 年c o c i a n c i c h 等研究发现了孔道的形成、开启和关闭都依赖于膜 的电势。只有当膜的电势高于1 1 0 m a 时孔道才能处于开启状态，因此将其称为 电势依赖性通道。1 9 9 6 年l o c k e y 通_ 过电镜和免疫胶体金技术观察到了天蚕素 ( c e e r o p i na ) 结合到大肠杆菌膜上，行成一个9 6 n m 直径的病灶，孔径4 2 n m 孔洞导致了细胞内容物外泄，细菌死亡( 耿华等，2 0 0 4 ) 为此学说奠定了较为坚 实的实验基础。其作用方式可分为“栅桶( b a r r e s t a v e ) ”模型( m a c h a e le la 1 ， 1 9 9 9 ，t o m a s e t a l ，2 0 0 1 ) 和“毡毯( c a r p e r t ) ”模型。 ( 1 ) “栅桶( b a r r e s t a v e ) ”模型：阳离子抗菌肽在电荷的作用下，结合在细 胞膜表面，并相互聚合，肽分子中的疏水基团插到磷脂双分子层的疏水部分，以 与膜表面垂直的方式排列。阳离子抗菌肽结构发生改变并通过疏水作用插到细胞 膜磷脂层，在细胞膜中抗菌肽聚合形成多聚体，形成横跨细胞膜的离孑通道。一 般认为阳离子抗菌肽的聚合体即可形成离子通道。离子通道一旦形成，外界的水 分即可深入细胞内部，细胞质也可渗透到外部。由于失去能量，严重时细胞膜会 崩解而导致细胞死亡。该模型中起主要作用的是疏水作用，阳离予抗菌肽应有稳 定的结构，如：两亲的“螺旋、疏水的o t 一螺旋、p 一折叠，或同时存在螺旋和p 一 折叠： ( 2 ) 毡毯( c a r p e r t ) 模型：有些昆虫抗菌肽并无稳定的c t 一螺旋或者b 折叠 结构，并且在作用过程中无明显的细胞膜破坏现象，但是仍然观察到细胞质中的 k + 渗出。有人在实验基础上提出了毡毯模型，该模型认为阳离子抗菌肽和细胞 膜上带负电荷的头部结合，平行排列在细胞壁表面形成类似“毡子”的结构，阳 离子抗菌肽的疏水部分并不插入细胞膜，但是疏水作用和分子张力作用下改变细 胞膜的流动性和厚度，从而在细胞膜上出现瞬时空洞，导致细胞质外渗或抗菌肽 渗透到细胞质中，严重时同样会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡。该模型其关键 作用的是电荷间的作用力，阳离子抗菌肽无需n 一螺旋、b 折叠等稳定的二级结构， 也不需要在细胞膜表面形成多聚体。抗菌肽引起的细胞膜破坏可以发生在整个细 胞膜上，也可仅在其中某些部位。 1 0 下烈喜- 1 i l l l 人学# 位论文 2 2 1 2 抑制细胞的呼吸作用 t h a n a t i n ( 死亡素) 在o 3 0 6 u m 时就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。 但当其浓度提高到7 0 1 1 m 时仍检测不到细胞内k + 离子的泄露。表l t ) j t h a n a t i n 不是 通过改变细胞膜的通透性来杀菌的。当用4 0 u m 的t h a l l a t i n 处理细菌1 h 后，可检 测到细菌的呼吸变弱；6 h 后，细菌的呼吸作用完全停止( f e h l b a u n me ta 1 ，1 9 9 6 ) ， 由此推断t h a n a t i n 是通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌的。 2 2 1 3 抑制胞外或胞内膜蛋白的形成 研究表明a t t a c i n s 能够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白o m p c 、o m p f 、o m p a 以及l a m b 基因的转录使这些蛋白的含量减少，从而导致细胞膜的通透性增加， 细菌的生长受到抑制( c a r l e s s o na n db e n n i c h ，1 9 9 1 ) a p i d a e c i n 的抗菌机制假说 认为，抗菌肽与大肠杆菌外膜成分结合，而后肽进入细胞外周胞质，通过与结合 在细胞内膜的受体分子发生特异性结合，进入细胞内，最后在胞内肽与一种或几 种与蛋白合成相关成分结合并发挥作用起到杀菌效果。抗菌肽的作用可能与中止 蛋白或d n a 的合成，导致这些成分的降解有关( c a s t e e l se l a l ，1 9 9 4 ；c a s t l ee t a l ， 1 9 9 9 ) 2 2 1 4 抑制细胞壁的形成 通过对麻蝇毒素i i ( s a r c o t o x i n si i ) 研究发现，s a r c o t o x i n s 主要抑制正在形 成的细胞壁，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻：而对于已经形成形成 的细胞壁没有作用，一般认为通过抑制细胞壁的形成达到杀菌效果( 刘先凯等， 2 0 0 1 ；刘先署等，2 0 0 2 ) 2 2 2 昆虫抗菌肽对病毒的作用及其机制 蜂毒素是一个有细胞毒性的抗菌肽，w a c h i n g e r 在1 9 9 8 年报道的研究结果表 明蜂毒素和天蚕素在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒h i v 一1 的基因表达，从而减少 h i v l 的增殖( w a e h i n g e re ta 1 ，1 9 9 8 ) ，这表明抗菌肽对艾滋病毒有抑制作用， 千烈喜，i i i l l 人学学似| 文 引起了抗菌肽抗病毒功能的关注。目前发现抗菌肽以3 种不同的机制起到抗病毒 的作用：第1 种是通过抗菌肽直接与病毒离子相结合而发挥作用，如a - - d e f e n s i n s 和m o d e l i n - - 1 等对疱疹病毒的作用，p o l y h e m u s i n s 对h i v 病毒的作用。第2 种 是抑制病毒的繁殖，如m e l i t i n 和c e c r o p i n a 对h i v 病毒的作用。第3 种机制是 通过模仿病毒的侵染过程而对其作用。如m e l l i t i n 及其类似物k 7 1 的结构与烟草 花叶病毒核衣壳m r n a 相互作用的区域具有相似性，这样蜂毒蛋白分子就可以 伪装成病毒包被蛋白，参与蛋白合成，被病毒r n a 结合，导致r n a 的构象改 变，不能与正常蛋白结合，病毒颗粒无法正常组装( 孙超等，2 0 0 0 ；柴小杰等， 2 0 0 4 ) 。 2 2 3 昆虫抗菌肽对寄生虫的作用及其机制 研究表明，抗菌肽能有效杀死引起人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、 c h a g a s 氏疾莱什曼病致病的寄生虫。s h a h a b u d d i n ( 1 9 9 8 ) 研究发现昆虫防御素 对感染蚊子的疟原虫发育的1 i 同时间有不同的作用，在疟原虫的卵囊期核子孢子 期经抗菌肽处理后虫内部会形成明显的大空泡，子孢子的膜通透性受到破坏，形 态受损，流动性减低。而且发现抗菌肽对蚊子没有毒性( s h a h a b u d d i n ，1 9 9 8 ) d i a z a c h i l r i c a 等( 1 9 9 8 ) 发现一种合成的天蚕素一蜂毒素杂和体对莱什曼原鞭毛 虫有杀伤作用，靶目标是细胞质膜。其作用模式与杀菌模式相似，抗菌肽能快速 降低h + o h 一的通透性使细胞的a t p 合成下降，呼吸减弱，外膜坍塌，原生质膜 形态遭破坏，从而杀死原虫。 2 2 4 昆虫抗菌肽对肿瘤细胞及癌实体瘤的作用及其机制 目前在肿瘤化学治疗方面，化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞均有不同程度的 抑杀作用，造成的毒副作用十分严重。而昆虫抗菌肽可以特异性抑杀某些肿瘤细 胞的生长和恶性增殖，但对正常的人体细胞不会造成损害，这无疑是给抗肿瘤药 物的研制和开发带来新的曙光。 昆虫抗菌肽对某些癌细胞有d n a 的断裂作用，王芳等( 1 9 9 8 ) 用单细胞凝胶 电泳技术( s c g e ) ( 单细胞凝胶电泳技术( s c g e ) 是一种快速敏感的检测单个哺乳 1 2 王烈喜i i1 人学学位论文 动物细胞d n a 断裂的技术) 研究了昆虫抗菌肽对人髓样白血病细胞和正常人白 细胞核染色质的影响，在荧光显微镜下观察，经抗菌肽处理的癌细胞的细胞核染 色质d n a 明显断裂，而正常人的白细胞和未经抗菌肽处理的癌细胞未观察到 d n a 的断裂。张双全等( 1 9 9 7 ) 的研究表明昆虫抗菌肽首先作用于靶病原物的外 膜，然后破坏内膜系统即细胞器，最后破坏核膜，由此可以推测昆虫抗菌肽有可 能对核内的染色体起作用。这说明昆虫抗菌肽对某些癌细胞有d n a 的断裂作用， 同时可以看出昆虫抗菌肽对癌细胞和正常人细胞具有选择性，目前对这种选择性 尚解释不清。 2 3 抗菌肽的改造与基因工程 2 3 1 抗茵肽的改造 传统分离抗菌肽的方法主要是用生物化学方法分离，对于昆虫